黑水虻是粮食及农业组织认可的利于经济和环境可持续发展的重要替代蛋白质来源[1]，富含多种生物活性成分，可有效改善水产动物的免疫状态[2-3]。关于陆生动物饲料中添加黑水虻的研究较多，水产养殖业中黑水虻的应用研究仍处于早期阶段[3]，探索黑水虻替代饲料原料对各种鱼类的免疫增强作用是近几年水产养殖的热点。本文总结了黑水虻的生物学特性和作为免疫增强剂的原理，并汇总了近几年黑水虻在各种鱼类养殖中的应用研究进展，为黑水虻在鱼类养殖中的进一步应用提供参考。1黑水虻的生物学特性黑水虻属昆虫纲（Insecta）双翅目（Diptera）短角亚目（Brachycera）水虻科（Stratiomyidae）扁角水虻属（Hermetia），中文学名亮斑扁角水虻（Hermetia illucens Linnaeus）[4]。黑水虻起源南美洲热带草原，后引入美国、阿根廷、日本等地，目前广泛分布在南北纬40°之间的热带、亚热带以及部分温带地区，在我国分布于华北、华中、华南以及东南沿海[5-8]。黑水虻是完全变态发育的昆虫，生命周期分为卵、幼虫、蛹和成虫等4个时期，整个生长周期为35 d左右，条件适宜时28 d即可繁殖一代，在我国华南地区一年可繁衍9~10代[9-11]。黑水虻在饲养过程中易受环境因素的影响[12]，1 000 Lx光照条件下生长达到最优[13]，27~30 ℃时生长速度最快[14]，湿度60%以上才产卵[9]。黑水虻幼虫具有腐食性，主要以禽畜粪便、腐烂有机物、餐厨垃圾等废弃物为食，被用于畜禽粪便和餐厨垃圾的无害化处理，能够实现资源可循环利用[5-8,10,12,15]。2黑水虻作为免疫增强剂的原理长期生活在腐败有机质环境中的黑水虻幼虫免疫功能较强[10]，可产生大量抗菌物质，抑制细菌、真菌和病毒生长和繁殖[16]，如抗菌肽、几丁质、月桂酸、蛋白酶、P450解毒酶、水解酶等生物活性物质[12,14]，这些物质可作为免疫增强剂提高养殖动物的非特异性免疫能力，增强其抗病力和生长性能[6]。其中最受关注的是抗菌肽，它是生物体受到外来病原入侵时被诱导并迅速合成的多肽类物质，具有很强的抗菌或杀菌活性，是生物机体天然免疫防御系统的重要组成部分[17]。黑水虻幼虫具有天蚕素、防御素和攻击素等多种类型的抗菌肽[18]。黑水虻抗菌肽分子量小、水溶性好、热稳定性强、无免疫原性、抗菌谱广，尤其对耐药菌的抗菌效果更为显著，且只对发生病变的真核细胞和原核细胞产生作用，对正常的真核细胞不会产生免疫反应[7-9,18]，应用前景良好。黑水虻抗菌肽可以通过多种机制杀死细菌，包括膜破坏、干扰细菌代谢以及靶向细胞质成分，其作用机制主要有离子通道学说、抑制细胞呼吸学说、抑制细菌细胞壁的形成学说、胞内损伤假说等，不同类型抗菌肽的体内活性机制可能不一致，有待进一步研究明确[18]。黑水虻幼虫含有丰富的几丁质，可催化几丁质分解的几丁质酶普遍存在于真菌、植物、昆虫以及鱼类等生物中。研究表明，几丁质的酶解产物壳聚糖是一种免疫多糖，可以提高动物肝脏的机体活力[5]，促进脂类代谢，使机体营养保持在良好的水平，保护肝脏[15]。黑水虻幼虫粉中粗脂肪含量约为33%，其中中链脂肪酸与多不饱和脂肪酸含量占脂肪酸总量的60%以上，月桂酸含量占脂肪酸的40%以上[11]。研究表明，月桂酸具有抗菌作用，能够提升鱼体的免疫能力[19]。此外，黑水虻幼虫分泌的己二酸的抗菌能力较强，可对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、痢疾等病菌的生长产生较强的抑制作用，能够抑制肺炎克雷伯菌、淋病奈瑟菌等的成长活性[8]。3黑水虻在各种鱼类免疫增强方面的应用3.1大西洋鲑鱼（Salmo salar）2018年，美国颁布了可将黑水虻用于鲑鱼养殖的规定[20]。研究发现，使用15%的黑水虻幼虫粉完全替代鱼粉喂养8~16周，鱼体肠道健康并未受到破坏。与使用其他免疫增强剂的对照组相比，喂食黑水虻能够诱导产生相同水平的抗传染性胰腺坏死病毒（IPNV）抗体，免疫、屏障功能基因表达图谱相近，应激反应、免疫耐受和解毒活性增加的标志基因的表达均有所增加；虽然在喂食黑水虻组的近端和中端肠道同样观察到肠道细胞脂肪变性现象，但比较不明显，而远端肠道的相对重量明显增加；同时添加黑水虻还增加了鱼体肠道菌群的丰富度和多样性[21-23]。另一项研究发现，黑水虻对大西洋鲑鱼的皮肤黏液蛋白质组学和免疫反应影响较小，但中低等水平替代比例的黑水虻幼虫粉（6.25%、12.50%）或幼虫浆（3.7%、6.7%）明显降低了大西洋鲑盲肠中的肠道细胞脂肪变性程度；黑水虻幼虫粉替代比例为25%或幼虫浆替代比例为6.7%能够改善远端肠道组织学状态。饲料中黑水虻幼虫粉含量增加线性降低了鱼体血浆C反应蛋白的水平，而黑水虻幼虫浆含量增加则线性增加了鱼体血浆的抗氧化能力[24]。3.2虹鳟（Oncorhynchus mykiss）有学者研究了部分脱脂、完全脱脂或全脂的黑水虻幼虫粉或预蛹粉替代鱼粉对虹鳟肠道微生物群的影响，喂养5~12周后结果基本一致[25-27]。结果表明，鱼粉替代比例高达50%黑水虻占比30%对虹鳟的肠道微生物群具有积极影响，能够改善鱼体肠道微生物组成，增加肠道微生物的丰富度和多样性，如增加了乳酸、丁酸产生菌以及厚壁菌和放线菌的数量，减少了变形菌数，提高了棒状杆菌、芽孢杆菌和支原体的丰度。作者将杆菌丰度增加归因于高脂喂养提高了鱼体脂肪酶活性，将支原体丰度增加归因于高甲壳素喂养提高了鱼体甲壳素酶的活性[25-27]。而Terova等[28]研究了部分脱脂黑水虻幼虫粉替代鱼粉对虹鳟肝脏甲硫氨酸（Met）代谢的影响，结果表明，用黑水虻替代50%的鱼粉不会对虹鳟肝脏甲硫氨酸代谢产生负面影响，并且喂养黑水虻组的甲硫氨酸代谢效率直接调节肝脏组织中甲硫氨酸代谢相关的两个目标基因（胱硫醚-β-合成酶，CBS；S-腺苷高半胱氨酸水解酶，SAHH）的转录水平，维持单碳代谢底物的最佳水平（即S-腺苷甲硫氨酸∶S-腺苷高半胱氨酸，SAM∶SAH）。Kumar等[29]发现，黑水虻幼虫可有效预防虹鳟肠道由豆粕诱发的炎症，而且使用黑水虻幼虫油对鱼体健康有益。研究发现，添加16%的黑水虻幼虫下调了肠道前列腺素和干扰素调节因子1（IRF-1），显著增加了血清溶菌酶活性；黑水虻幼虫油并未影响肝脏或肠道的形态学状态，但肾脏白细胞介素-8、肿瘤坏死因子和IRF-1显著上调，同时血清过氧化物酶活性显著增加；添加胆汁酸的黑水虻幼虫油组肠道前列腺素基因的表达显著上调。3.3鲈鱼3.3.1大口黑鲈（Micropterus salmoides）Fischer等[30]在大口黑鲈幼鱼的饲料中添加全脂黑水虻幼虫粉或预蛹粉进行了为期8周的喂养试验，结果显示，11.9%黑水虻幼虫和9.83%黑水虻预蛹组与对照组中大多数幼鱼的肝脏/肠道基因表达程度基本一致，如生长（类胰岛素生长因子1、生长激素）、脂质代谢（胆固醇7α-羟化酶、脂肪酸合成酶）、抗氧化指标（超氧化物歧化酶）、炎性细胞因子（肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β1），但9.83%黑水虻预蛹组的肠道脂肪酸合成酶和肝脏转化生长因子-β1表达较其他组下调；肝脏和肠道组织病理学数据显示，与黑水虻预蛹相比，黑水虻幼虫更适合鱼类。有研究进行了为期9周的喂养试验[31-32]，结果表明，饲料中添加9%黑水虻幼虫浆对鱼体的免疫增强效果较好，血清丙二醛（MDA）含量降低，酸性磷酸酶（ACP）活性升高，肝脏过氧化物酶体增殖物活化受体α（PPARα）和脂蛋白酶（LPL）的mRNA表达下调。同时所有黑水虻幼虫浆喂养的组别中鱼体腹腔内脂肪沉积均增加，肝脏细胞发生不同程度的空泡变性和炎性细胞浸润现象，故建议在大口黑鲈饲料中添加黑水虻幼虫浆应慎重。有研究使用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）对大口黑鲈进行了72 h细菌挑战试验[33]，结果表明，喂养1%发酵黑水虻幼虫浆的累积死亡率显著下降，而喂养5%发酵黑水虻幼虫浆的累积死亡率急剧上升。同时还发现喂养1%发酵黑水虻幼虫浆提高了鱼体抗氧化能力，减少了氧化代谢产物。与空白对照组相比，喂养1%发酵黑水虻幼虫浆的肠道微生物情况发生了明显变化，优势门软壁菌门被梭杆菌门取代，最丰富属软壁菌门支原体属被梭杆菌门鲸杆菌属取代；在微生物潜在功能水平上，氨基酸、能量和核苷酸的代谢提高，而多糖和脂质的代谢降低，尤其是α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性明显增加。综上所述，1%发酵黑水虻幼虫浆、9%黑水虻幼虫浆、10%黑水虻预蛹粉或12%黑水虻幼虫粉喂养8~9周是替代大口黑鲈饲料中鱼粉的适宜添加比例和喂养时间。3.3.2尖吻鲈（Lates calcarifer）目前研究显示，黑水虻对鱼体的免疫增强作用差异较大[34-36]，可能是不同研究使用的饲料配方不同。Chaklader等[34]赞成用70%的家禽副产品粉（PBM）和30%的全脂黑水虻幼虫粉（FHI）或脱脂黑水虻幼虫粉（DHI）的混合物全部替代鱼粉蛋白，且认为全脂黑水虻幼虫是更好的蛋白质原料。喂养8周后，各黑水虻处理组血清免疫应答无显著差异；与对照组相比，70PBM-30FHI组鱼体的肝脏脂肪变性无明显变化，皮肤黏膜屏障反应相似，哈维弧菌（Vibrio harveyi）感染致死率无差异。但Gupta等[35]认为完全替代鱼粉不可取，7周喂养试验后，未添加鱼粉但添加18%黑水虻和58%多种非鱼粉成分的混合物对尖吻鲈鱼的肠道健康产生不利影响。Hender等[36]的研究中分别用黑水虻蛋白（22% HiP）替代30%鱼粉，用黑水虻虫油（10.5% HiO）替代30%鱼油（FO），用黑水虻蛋白和虫油（22%/10.5% HiPO）替代30%鱼粉和30%鱼油，6周喂养试验后，HiP组的血清杀菌活力显著增强，各试验组应激相关的热休克蛋白（HSP70和HSP90）无显著差异，HiP和HiPO组免疫相关（白细胞介素-1β和白细胞介素-10）基因表达显著上调，鱼体肠道和皮肤中黏液素细胞数量均增加。3.3.3欧洲鲈（Dicentrarchus labrax）Moutinho等[37]发现，中等比例的黑水虻喂养欧洲鲈9周后，鱼体的肝脏脂质过氧化以及超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性均下降，谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的活性不受影响，鱼饲料中添加19.5%的黑水虻不会影响鱼体颜色、肝脏、鱼肉脂肪酸谱和脂肪酸品质指标，还可减少肝脏和鱼肉的脂质过氧化。Abdel-Latif等[38]进行了与以上研究类似但黑水虻比例稍低的喂养试验，发现黑水虻的免疫增强作用更为明显，与对照组相比，所有黑水虻组MDA含量及过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性均以剂量依赖的方式显著增加；吞噬活性、吞噬指数、血清溶菌酶和呼吸爆发活性均显著增强，肝脏热休克蛋白70（HSP70）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-10（IL-10）基因的mRNA表达均显著上调；经溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染后，相对存活率显著提高。综上所述，黑水虻幼虫粉部分替代鱼粉蛋白的最高比例可达50%（饲料中占比15%），不会对鱼类健康产生负面影响，还可增强欧洲鲈鱼的抗氧化能力和免疫状态。3.4西伯利亚鲟（Acipenser baerii）Rawski等[39]和Caimi等[40]分别研究了黑水虻全脂和脱脂幼虫粉替代鱼粉对西伯利亚鲟鱼肝脏和肠道健康的影响，尽管喂养试验存在差别，但结果基本一致。Rawski等[39]在7周的喂养试验中添加了占比10%和15%的全脂黑水虻，结果发现，鱼体的幽门盲肠和近端肠道比例、绒毛高度和面积增加。Caimi等[40]进行的喂养试验为期17周，结果发现，含有18.5%和37.5%的黑水虻对鱼体肝脏和远端肠道的组织学状态无显著影响，但在37.5%的组中检测到氧化应激生物标志物的变化。3.5鲇鱼有研究进行了为期9周的喂养试验以评估黑水虻幼虫粉作为黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）饲料中鱼粉蛋白替代品的潜力[41]。结果显示，与其他试验组相比，25%替代组（黑水虻占比11%）的血清溶菌酶活性最高；与空白对照组相比，替代比例最大组（替代率48%，饲料中占比22%）的血清溶菌酶活性显著增加，同时该组的生长指标和饲料转化率未受到负面影响，建议黑水虻幼虫蛋白可替代黄颡鱼饲料中48%的鱼粉蛋白。有研究进行了为期8周的喂养试验以评估黑水虻幼虫油替代大豆油的效果[42]，与对照组相比，黄颡鱼幼鱼血清中抗超氧阴离子和MDA含量及过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性未产生变化，肿瘤坏死因子-α含量无明显差异，但当黑水虻幼虫油的替代比例超过40%（占比1.6%）时，各试验组鱼体血清中的抗炎因子IL-10、炎症因子白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）含量均显著升高。Fawole等[43]进行了为期9周的喂养试验以观察黑水虻幼虫粉替代鱼粉对尖齿胡鲇（Clarias gariepinus）幼鱼的影响，发现虽然鱼体血液指标和白细胞计数差异无统计学意义，但50%替代组（黑水虻占比12%）尖齿胡鲇肝功能酶（谷草转氨酶和谷丙转氨酶）活性最低；虽然喂养黑水虻组的MDA含量与对照组相近，但是替代50%组的过氧化氢酶活性明显增加。3.6斑马鱼（Danio rerio）在水产养殖研究领域，斑马鱼是开展饲料营养研究初步评估的模型动物[44]。研究表明，一定比例的黑水虻替代鱼粉喂养至一定时间可以促进斑马鱼的成肌基因的表达，调节甲壳素的酶水解作用；应激和免疫反应相关的基因表达结果表明鱼体健康不受影响，但高比例的黑水虻替代可能并未起到疫调节和免疫修饰作用[44-45]。3.7其他鱼类用脱脂黑水虻部分替代鱼粉的试验中，小丑鱼（Amphiprion ocellaris，Pomacentridae）幼鱼在脂质代谢和应激反应方面未发生显著变化，所有试验组小丑鱼肠黏膜和肝实质均正常[46]。在金头鲷鱼（Sparus aurata）研究中发现，黑水虻并未引起金头鲷鱼多饱和脂肪酸、血栓形成和过氧化指数显著差异[47]。研究表明，黑水虻对大黄鱼（Larimichthys crocea）幼鱼的免疫增强作用明显，随着黑水虻替代鱼粉比例提高，大黄鱼的血清甘油三酯（TG）和胆固醇（TC）水平显著降低；在所有试验组中，替代比例20%（饲料中占比7%）组大黄鱼的肝脏总抗氧化能力（T-AOC）最强；替代比例40%（饲料中占比14%）组大黄鱼的超氧化物歧化酶活性（SOD）最高，肝脏MDA含量最低[48]。Lu等[49]和Couto等[50]均不建议黑水虻完全替代鱼粉或豆粕，Lu等[49]指出黑水虻完全替代豆粕（饲料中占比26%）可以提高草鱼（Ctenopharyngodon idellus）的过氧化氢酶活性，但当替代比例超过50%（饲料中占比13%），鱼体的肠绒毛长度和肠壁厚度明显减少，气单胞菌（Aeromonas）和希瓦氏菌（Shewanella）的丰度减少；黑水虻替代比例达50%（饲料中占比30%）可增加大西洋白姑鱼（Argyrosomus regius）的嗜酸性粒细胞和上皮内白细胞的数量，且血浆抗蛋白酶活性随着黑水虻比例的增加而增加。4结论黑水虻在不同鱼类中可替代一定水平的鱼粉等营养成分。在多种鱼类饲料中少量添加黑水虻，无论是用黑水虻幼虫、预蛹、虫油，还是替代鱼粉、鱼油、豆油，或是额外添加，黑水虻均具有较好的免疫活性，可改善鱼体的血液生化参数，提高鱼体抗氧化和抗炎症能力，明显增强免疫基因表达和抗病力，同时具有肠道抑菌活性以及改善肠道健康的作用，但超过一定比例的添加量有可能对鱼体健康产生副作用，适宜添加量因鱼种而异，因此建议在改良饲料配方大规模应用前应进行仔细研究。