罗非鱼具有生长快、病害少、繁殖力强、食性杂等特点，且鱼肉中骨刺少、肉质厚，富含多种不饱和脂肪酸，是我国南方主要经济鱼种之一[1]。在罗非鱼的饲养过程中常使用抗生素等化学药物治疗一些细菌性疾病，抗生素的不规范使用会造成药物残留、鱼体出现耐药性、污染养殖水体等问题。因此，研究并开发一种能够促进罗非鱼生长、提高罗非鱼产量、减少病害发生的安全饲料添加剂成为研究热点[2]。裂褶菌多糖（SPG）是从裂褶菌子实体、菌丝体或发酵液中提取出来的水溶性多糖。裂褶菌胞外多糖是以葡萄糖为单一组分，以β-(1-3)和β-(1-6)糖苷键组成的β-葡聚糖[3-4]，具有提高动物体液免疫功能、抗衰老、抗肿瘤、抗癌等多种生物活性[5-8]。有研究发现，β-葡聚糖可以明显改善罗非鱼生长性能和抗嗜水气单胞菌感染的能力[9]，但目前国内对裂褶菌胞外多糖作为罗非鱼饲料添加剂的研究较少。肠道细菌的组成和数量对鱼类健康非常重要，其结构的相对稳定有助于加快宿主的生长和改善肉质，对宿主的健康具有重要意义[10]。孙敬锋等[11]研究表明，肠道菌群具有促进鱼体消化吸收食物、阻隔外界细菌等作用。本试验以吉富罗非鱼为研究对象，探究裂褶菌胞外多糖对罗非鱼的生长以及肠道菌群的影响，为裂褶菌胞外多糖作为鱼类饲料添加剂的研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料罗非鱼购自广州市渔丰种苗基地。罗非鱼基础饲料购自广东省江门市鼎足水产饲料厂，主要原料包括鱼粉、鱼油、豆粕、花生粕等，其粗蛋白、粗纤维、粗灰分、粗脂肪含量分别为32.0%、6.0%、16.0%、4.0%。裂褶菌菌种由中国农业大学烟台研究院微生物实验室分离保藏。1.2试验仪器塑料养殖箱购自森腾塑业有限公司，饲料颗粒机购自辉丰五金工厂，SPN202F电子天平购自梅特勒-托利多（常州）称重设备系统有限公司，IP54电子数显卡尺购自桂林广陆数字测控股份有限公司，均质机购自江苏天翎仪器有限公司，CR21GIII高速离心机购自Hitachi Koki，800Y高速多功能粉碎机购自皇代公司。1.3裂褶菌多糖饲料的制备裂褶菌多糖的制备参考冀颐之等[3]的方法，稍做改动。将裂褶菌发酵液离心后取上清液，置于旋转蒸发仪中，浓缩至原体积的三分之一左右。浓缩液与无水乙醇以1∶3的比例混合，醇沉24 h，取其中固体物质干燥并粉碎，得到粉末状裂褶菌胞外多糖。将罗非鱼基础饲料粉碎，过100目筛，分别加入0.10%、0.20%、0.30%的裂褶菌多糖，混匀，采用制料机制成粒径约为1.5 mm的颗粒饲料。1.4试验设计及饲养管理将鱼苗预养1 w，选用生长情况良好，体长（49.39±2.07）mm、体重（1.61±0.15）g的健康罗非鱼160尾，随机分成4组，每组4个重复，每个重复10尾鱼。对照组罗非鱼饲喂基础饲料，0.10%组、0.20%组、0.30%组分别在基础饲料中添加0.10%、0.20%、0.30%裂褶菌多糖。正式试验期40 d，各组水质、水量基本一致，均为脱氯自来水（日曝），24 h用增氧机充气，水温保持在28 ℃左右。试验采用饱食的方式，每天8：00、16：00定时饲喂罗非鱼，进食0.5 h，使用吸便器吸出饲料残渣和排泄物，喂料量为各组鱼体总重的2％~4％，3 d调整1次喂量，每2 d换水一次，每次换水量约为水箱的50%。1.5测定指标及方法1.5.1生长性能试验开始和结束，分别测量罗非鱼的体长和体重，计算罗非鱼的增重率、特定生长率、肥满度。增重率(WGR)=Wt-W0W0×100% (1)特定生长率(SGR)=lnWt-lnW0t×100% (2)肥满度(CF)=WtL3×100 (3)饲料系数=FWt-W0 (4)式中：W0为罗非鱼初重（g），Wt为罗非鱼末重（g）；L为罗非鱼末体长（mm）；F为饲料采食量（g）；t为试验时间。1.5.2肠道菌群试验结束后，选择生长性能表现最好的试验组（0.1%组）命名为EG组，对照组命名为CG组。在CG组和EG组中随机取3条罗非鱼，停食24 h，麻醉鱼体，使用75%的乙醇对鱼体表面消毒，在无菌条件下打开腹腔，取出完整肠道（食道后端至肛门），肠道内容物送上海生工生物有限公司进行Illumina Miseq高通量测序。使用Usearch软件，统计各样本有效序列数据，使用mothur软件分析肠道微生物的物种丰度和Alpha多样性，使用R软件绘制稀释曲线和优势物种相对丰度统计图（phylum水平、genus水平）。通过PICRUSt2预测对照组和EG-1组中罗非鱼的代谢活动，根据COG数据库和KEGG数据库进行功能分析，采用GraphPad Prism9制作功能丰度热图。1.6数据统计与分析数据采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1裂褶菌多糖对罗非鱼生长性能的影响（见表1）由表1可知，0.10%组、0.20%组、0.30%组罗非鱼末体长、末重都均高于对照组。0.10%组罗非鱼的增重率和特定生长率显著高于其他组（P0.05），饲料系数显著低于其他组（P0.05）。0.10%组罗非鱼的增重率达到379.47%，比对照组提高了219.63%；特定生长率达到3.92%，比对照组提高了101.03%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.008.T001表1裂褶菌多糖对罗非鱼生长性能的影响组别初体长/mm末体长/mm初重/g末重/g增重率/%特定生长率/(%/d)肥满度/(g/cm3)饲料系数对照组49.63±1.83a60.26±1.85a1.62±0.223.54±0.23a118.72±5.29a1.95±0.06a1.61±0.061.54±0.05b0.1%组49.32±2.5678.78±5.49c1.60±0.237.70±0.68c379.47±23.37c3.92±0.12c1.62±0.471.24±0.02a0.2%组49.52±2.6770.62±1.64b1.61±0.036.00±0.25b272.39±25.94b3.28±0.17b1.70±0.081.40±0.06b0.3%组49.09±2.0363.02±3.67a1.60±0.123.88±0.41a140.69±32.45a2.17±0.34a1.54±0.131.43±0.18b注：同列数据不同字母不同表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2罗非鱼肠道样品细菌序列特征分析（见表2、图1）由表2可知，样品中共存在229 245个序列数，对各样本数据的质量进行质控过滤，得到CG组的有效序列数为100 838，EG组的有效序列数为128 003，两组序列的平均长度为415.91，最短序列长度为350，最长序列长度为435。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.008.T002表2各样本有效序列数据统计组别标签序列原始序列数有效序列数碱基数平均长度最短序列长度最长序列长度CG组CGCCAT100 929100 83841 695 161413.49350435EG组GCGGTA128 316128 00353 546 289418.32353435从样品中随机抽取一定数量的序列作抽平分析，由图1可知，各组曲线均趋于平缓，说明本次测序数量足够，质量可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.008.F001图1稀释曲线2.3裂褶菌多糖对罗非鱼肠道菌群Alpha多样性的影响（见表3）由表3可知，CG组和EG组的覆盖度均接近1，表明本次测序结果可代表样本的真实情况，未被检出序列的概率较小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.008.T003表3裂褶菌多糖对罗非鱼肠道菌群Alpha多样性的影响组别Chao1指数Ace指数Shannon指数Simpson指数覆盖度/%CG组6406653.500.0699.888EG组6847003.420.0899.925Chao1指数和Ace指数是生态学中估计物种总数的常用指数，EG组的Chao1指数和Ace指数高于CG组，说明EG组的肠道微生物种类更丰富。Simpon指数和Shannon指数常用来估算样品中的微生物多样性。Shannon值越大，表明群落多样性越高；Simpson指数值越大，表明群落多样性越低。CG组的Shannon指数高于EG组，而Simpon指数低于CG组，表明CG组微生物群落多样性更高。2.4裂褶菌多糖对罗非鱼肠道微生物群落的影响（见图2、图3）鱼类肠道存在由多种微生物构成的复杂微生态系统，肠道菌群在维持宿主肠道功能，促进营养物质消化、吸收、代谢，调节机体免疫功能等方面有重要作用[12]，也可影响宿主正常生理功能[13]，为个体免疫力调节和生长发育提供有效保证[14]。由图2可知，在门水平上，罗非鱼肠道的优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia），变形菌门在两组中占绝对优势。EG组变形菌门和衣原体门的丰度低于CG组，而浮霉菌门和疣微菌门的丰度高于CG组，放线菌门、厚壁菌门两组差距不大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.008.F002图2裂褶菌多糖对罗非鱼肠道门水平相对丰度的影响由图3可知，在属水平上，罗非鱼肠道优势菌群大多数没有明确分类。未分类罗丹诺杆菌科（unclassified-Rhizobiales）、未分类γ变形菌纲（unclassified-γ-Planctomycetaceae）、未分类浮霉菌科（unclassified-Gammaproteobacteria）均为CG组、EG组丰度占比前三的细菌。其中EG组中未分类浮霉菌科、未分类γ变形菌纲相对丰度高于CG组，而未分类罗丹诺杆菌科低于CG组。CG组中Akkermansia的丰度与EG组差异显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.008.F003图3裂褶菌多糖对罗非鱼肠道属水平相对丰度的影响2.5罗非鱼肠道菌群功能预测结果（见图4）由图4可知，得到6类一级生物代谢通路，37种二级功能通路。在二级通路中，有12种参与代谢（metabolism），4种参与遗传信息处理（genetic information processing），3种参与环境信息处理（environmental information processing），4种参与细胞过程途径（cellular processes），8种参与机体系统（organismal systems）功能通路，6种参与人类疾病（human diseases）。图4KEGG功能预测分析热图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.008.F4a1（a）一级生物代谢通路10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.008.F4a2（b）二级功能通路其中12种代谢功能通路，包括氨基酸代谢（amino acid metabolism）、能量代谢（energy metabolism）等，EG组表达量均高于CG组。遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程途径共计11种通路，EG组丰富度高于CG组。在机体系统功能通路中，除排泄系统（excretory system）表达量略低外，其他7种功能通路EG组的表达量均高于CG组。在人类疾病通路中，除代谢疾病（metabolic diseases）表达量略高外，其他5种功能通路EG组的表达量均低于CG组。3讨论3.1裂褶菌多糖对罗非鱼生长性能的影响真菌活性多糖具有防病促生长的作用[15]。研究表明，饲料中添加适量的β-葡聚糖可以提高水产动物的消化酶活性，增强肠道消化吸收能力，提高饲料利用效率[16-18]。本试验发现，0.1%、0.2%、0.3%组罗非鱼的增重率、特定增长率均有提高。多糖可通过提高消化酶活性等的改善消化的方式增强动物的生长性能[19]，其抗菌活性和抗病毒等功效对肠道菌群的有益影响也是多糖促进生长的原因之一[20]。裂褶菌胞外多糖促进生长的具体原因仍需进一步探究。本试验发现，0.3%组对罗非鱼的促生长作用不显著，表明裂褶菌多糖的添加量需要控制在一定范围，与许国焕等[21]研究结果一致。原因可能是鱼体中存在一种对免疫刺激剂的负反馈系统，使生长水平回到正常甚至低于正常的状态[22]。3.2裂褶菌多糖对罗非鱼肠道微生物结构的影响本试验中，从门水平上分析，变形菌门在CG组和EG组均占绝对优势，与周鹤庭等[23]对黄条鰤幼鱼的研究一致。变形菌门包含许多病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等，变形菌门的高丰度会导致紧密连接蛋白表达降低，从而引起肠道损伤的发生[24]。本试验发现，CG组罗非鱼肠道的变形菌门细菌丰度高于EG组。疣微菌门能够降解难消化的多糖并发酵膳食纤维，产生短链脂肪酸，从而提高肠道屏障完整性[25]。衣原体门可以引起鱼类疾病，常以鳃上皮囊泡的形式引起呼吸系统感染[26]。EG组丰度前五的门中特有的为疣微菌门，CG组特有的为衣原体门。因此，在饲料中适量添加裂褶菌胞外多糖可以抑制肠道有害菌的生长，促进有益菌的生长，对提高罗非鱼的抗病性有一定作用。本试验中，从属水平上分析，未分类罗丹诺杆菌科、未分类γ变形菌纲、未分类浮霉菌科均为CG组、EG组丰度占比前三的细菌。吴振聪等[27]、朱昊俊等[28]研究发现，鲸杆菌属均为罗非鱼肠道主要的优势菌，但在本试验罗非鱼肠道中几乎未检测到鲸杆菌属，这可能与罗非鱼的性别、水环境因素、养殖模式的不同，甚至分析方法的差异相关[29]。Akkermansia可通过直接作用、联合细胞信号转导通路共同作用、分泌代谢产物等方式维护肠黏膜屏障稳定，在肠道黏液层的生理学中起关键作用[30-31]。CG组中Akkermansia的丰度仅为2.78%，而EG组中Akkermansia的丰度占9.43%。因此，添加0.1%的裂褶菌胞外多糖，可在一定程度上降低罗非鱼感染肠炎的风险。3.3裂褶菌多糖对罗非鱼肠道微生物功能的影响本试验发现，罗非鱼的肠道菌群在一级功能层中显著富集于代谢，在二级功能中相对丰度较高的代谢通路有氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量代谢等，与在李全杰等[29]的研究结果一致，推测本试验罗非鱼肠道菌群的多样性功能同样在代谢中发挥重要作用，并有助于维持微生物群结构的稳定性。本试验发现，除排泄系统外，CG组，EG组罗非鱼肠道的代谢功能、机体系统和遗传信息处理表达均增强，有利于鱼体营养物质的利用及细胞功能的发挥，增加对营养物质的利用，促进鱼类的生存和生长[32]，这也与本试验0.1%组的增重率和特异性增长率都高于对照组的试验结果一致。因此，饲料中加入裂褶菌胞外多糖对吉富罗非鱼肠道菌群结构起正向效应。4结论本研究结果显示，在饲料中添加适量裂褶菌胞外多糖能够提高罗非鱼的生长性能，对肠道健康具有正向促进作用，改善肠道微环境，以0.10%的添加水平为宜。