我国是世界上最大的罗非鱼（tilapia）生产国和出口国，2016年我国罗非鱼产量达到峰值186.6万t，2021年我国罗非鱼产量仍有166.26万t[1]。目前，如何提升罗非鱼的质量和价格、拓展国内外市场是罗非鱼养殖中需要解决的实际难题。使用蚕豆对鱼类进行脆化可以改善鱼类肉品质及口感，从而提高鱼类的经济价值[2]。饲喂蚕豆可以改善草鱼（Ctenopharyngodon idella）[3-6]、罗非鱼[7]、异育银鲫（Carassius auratus gibelio）[8]和斑点叉尾鮰（Ictalurus punetaus）[9]等鱼类的肉品质。但直接投喂蚕豆存在适口性差、鱼类生长缓慢、脆化度不均匀、脆化时间较长及脆化商品率较低等问题。由于罗非鱼消化系统脆弱、肠道较短而肠壁较薄等，使用蚕豆饲喂罗非鱼约1个月会造成其大量死亡。脆化专用沉性颗粒饲料具有饲料系数偏高和肝胆疾病易发多发等缺点，制约了脆化专用沉性颗粒饲料的推广应用。因此本课题组在前期研究的基础上[10-11]，进一步调整优化脆化饲料配方、改变制备方法（膨化），探讨膨化浮性脆化饲料对罗非鱼生长性能、肌肉品质和肠道菌群的影响，为罗非鱼肌肉品质的改良提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验鱼罗非鱼由福建省淡水水产研究所榕桥中试基地自繁培育而成，平均体重240 g。1.1.2试验饲料对照组饲料为市售罗非鱼商品饲料。试验组饲料为自制脆化饲料，原料组成为蚕豆55%、红鱼粉3%、豆粕6%、花生粕6%、菜籽粕12%、面粉12%、鱼油1%、预混料5%，按试验要求使用双螺杆膨化机（TSE65）制成膨化浮性颗粒料。试验饲料营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.T001表1试验饲料营养水平组别水分粗灰分粗蛋白粗脂肪对照组9.37±0.155.83±0.0630.88±0.204.40±0.26试验组8.47±0.218.07±0.0630.70±0.565.03±0.25注：营养水平为实测值。%1.2试验设计试验在福建省淡水水产研究所榕桥中试基地循环水系统中进行。罗非鱼停食24 h后，从苗种培育池挑选规格基本一致、健康状况良好的罗非鱼，投放入室内循环水系统中（试验桶直径1.5 m，水深0.8 m），每桶20尾。120尾鱼分2组，每组3个重复。试验用水为曝气后的自来水，试验期间水温24~30 ℃、溶解氧≥5.0 mg/L、pH值7.1~7.8。投饵量按试验鱼体重的2%~4%，2次/d（8：00~9：00、16：00~17：00），以1 h内摄食完为准。试验期90 d。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验最后1 d，试验鱼停食24 h，测定各生长指标。增重率(WGR)=增重/初重×100%(1)特定生长率(SGR)=(ln末重-ln初重)/试验天数×100%(2)饲料系数(FCR)=总投饵量/总增重(3)脏体比(VSI)=内脏重/鱼体重×100%(4)肝体比(HIS)=肝胰脏重/鱼体重×100%(5)肥满度(CF)=体重/体长3×100(6)成活率(SR)=(试验结束鱼尾数/试验开始鱼尾数)×100%(7)1.3.2肌肉营养成分试验结束后，各试验组分别取3尾鱼，取背部肌肉50 g，去皮，-20 ℃保存。肌肉水分、粗灰分、粗蛋白质和粗脂肪含量测定分别参照GB 5009.3—2016、GB 5009.4—2016、GB 5009.5—2016和GB 5009.6—2016的方法测定。氨基酸组成与含量（除色氨酸外）参照GB 5009.124—2016 盐酸水解法，使用氨基酸自动分析仪（日立L-8900）测定。脂肪酸组成与含量根据GB 5009.168-2016第三法“归一化法”，使用气相色谱仪（Agilent 7890A）进行测定。1.3.3肌肉质构分析不同试验组鱼采样经活体宰杀，沿着鱼背部肌肉纤维方向进行取样，切成20 mm×20 mm×20 mm的小块，采用TA.XT PLUS型质构分析仪测定鱼肉的质构特性，检测硬度、弹性、胶着性、咀嚼性和回复性。具体方法为采用P36R圆柱形探头（直径36 mm）、对肌肉进行2次压缩，进行质地多面剖析（TPA）模式测试。TPA模式设定参数为测前速度2 mm/s、中速度1 mm/s、测后速度10 mm/s，变形程度40%，触发力5 g。每个样品分别平行测量6~10次，去掉最大值和最小值，取平均值。1.3.4肠道菌群分析试验结束，试验鱼停食24 h，每组随机各取3尾试验鱼，取75%乙醇擦拭体表，用无菌剪刀和镊子从腹腔中分离出肠道，使用PBS缓冲液冲洗，置于5 mL无菌冻存管中，-80 ℃保存。肠道样品分别标记为P组（对照组，样品编号P1~P3）和JD组（试验组，样品编号JD1~JD3）。经质检合格的样品使用16S rDNA通用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和806R（GG-ACTACHVGGGTWTCTAAT）进行PCR扩增，PCR产物使用DNeasy PowerSoil Pro Kit试剂盒进行提取，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA高通量测序，并将得到的数据进行Alpha指数分析、菌群结构与组成及功能预测等生物信息学分析。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 28软件处理，对试验数据进行独立样本t检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1脆化饲料对罗非鱼生长性能的影响（见表2）由表2可知，试验组罗非鱼的FCR和HSI显著高于对照组（P0.05），SGR显著降低（P0.05），脆化饲料对其他生长性能指标无显著影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.T002表2脆化饲料对罗非鱼生长性能的影响项目对照组试验组初重/g238.11±3.42238.33±4.37末重/g637.33±35.32a562.89±26.93bWGR/%167.81±17.94a136.11±7.74bSGR/(%/d）1.97±0.14a1.72±0.07bFCR1.56±0.08a1.85±0.07bVSI/%8.90±1.2710.86±2.11HSI/%2.02±0.67b3.40±1.14aCF/(g/cm3）4.41±0.444.55±0.55SR/%100100注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）；表4、表5与此同。2.2脆化饲料对罗非鱼肌肉品质的影响2.2.1脆化饲料对罗非鱼肌肉常规营养成分的影响（见表3）由表3可知，试验组罗非鱼肌肉中的水分含量显著低于对照组（P0.05），粗蛋白和粗脂肪含量均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.T003表3脆化饲料对罗非鱼肌肉常规营养成分的影响组别水分粗灰分粗蛋白粗脂肪对照组78.45±0.07a1.05±0.0718.85±0.07b1.90±0.00b试验组77.65±0.21b1.10±0.0020.05±0.21a2.15±0.07a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）；表6、表7与此同。%2.2.2脆化饲料对罗非鱼肌肉氨基酸组成与含量的影响（见表4）由表4可知，在检出的17种氨基酸中（因酸处理，色氨酸未检出），除了脯氨酸外，试验组罗非鱼肌肉中的其他16种氨基酸含量均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.T004表4脆化饲料对罗非鱼肌肉氨基酸组成与含量的影响项目对照组试验组项目对照组试验组项目对照组试验组蛋氨酸0.53±0.00b0.58±0.02a组氨酸0.50±0.00b0.57±0.01a胱氨酸0.10±0.00b0.13±0.00a亮氨酸1.46±0.01b1.60±0.05a精氨酸1.20±0.01b1.27±0.04a脯氨酸0.74±0.020.74±0.00异亮氨酸0.80±0.00b0.89±0.02a半必需氨基酸1.701.84酪氨酸0.58±0.01b0.62±0.01a苯丙氨酸0.74±0.01b0.83±0.00a天冬氨酸1.87±0.01b2.08±0.05a非必需氨基酸8.168.99苏氨酸0.88±0.00b0.95±0.03a谷氨酸2.77±0.03b3.01±0.10a氨基酸总量17.5019.24缬氨酸0.84±0.01b0.92±0.02a甘氨酸0.92±0.01b1.13±0.01a呈味氨基酸6.667.44赖氨酸1.75±0.01b1.94±0.06a丙氨酸1.11±0.01b1.23±0.02a必需氨基酸指数79.2287.24必需氨基酸7.668.44丝氨酸0.75±0.01b0.80±0.01a%试验组罗非鱼肌肉中的必需氨基酸、半必需氨基酸、非必需氨基酸、氨基酸总量、呈味氨基酸的含量和必需氨基酸指数均高于对照组。2.2.3脆化饲料对罗非鱼对肌肉脂肪酸组成与含量的影响（见表5）由表5可知，两组试验罗非鱼肌肉组成均以油酸、棕榈酸、亚油酸、硬脂酸和棕榈油酸为主。试验组罗非鱼肌肉的油酸、棕榈酸、硬脂酸和棕榈油酸的含量均显著低于对照组（P0.05），但亚油酸含量显著高于对照组（P0.05）。两组脂肪酸总量比较接近，分别为95.67%和95.6%。试验组罗非鱼肌肉的饱和脂肪酸总量、单不饱和脂肪酸总量低于对照组，不饱和脂肪酸总量、多不饱和脂肪酸总量和必需脂肪酸总量均高于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.T005表5脆化饲料对罗非鱼对肌肉脂肪酸组成与含量的影响项目对照组试验组项目对照组试验组月桂酸0.06±0.00b0.12±0.00a8, 11, 14-二十碳三烯酸0.51±0.00b0.62±0.00a豆蔻酸3.47±0.02a2.74±0.01b11, 14, 17-二十碳三烯酸0.20±0.01b0.28±0.00a豆蔻油酸0.16±0.01a0.14±0.00b二十碳四烯酸*0.66±0.00b0.70±0.00a十五碳酸0.19±0.01b0.25±0.00a木焦油酸0.07±0.00a0.06±0.00b棕榈酸23.80±0.00a23.05±0.07b二十碳五烯酸*0.11±0.00b0.13±0.00a棕榈油酸5.45±0.02a4.98±0.01b二十二碳六烯酸1.16±0.07a1.06±0.00b十七碳酸0.21±0.00b0.29±0.00a脂肪酸总量95.67±0.0895.60±0.09硬脂酸5.81±0.04a5.67±0.00b饱和脂肪酸总量34.0232.56油酸37.05±0.07a34.8±0.00b不饱和脂肪酸总量61.6563.05亚油酸*11.10±0.00b15.30±0.00a单不饱和脂肪酸总量44.9741.66花生酸0.33±0.00a0.30±0.01b多不饱和脂肪酸总量16.6821.39γ-亚麻酸*0.63±0.00b0.86±0.00a必需脂肪酸总量13.5018.53花生烯酸2.31±0.01a1.75±0.01b二十碳五烯酸+二十二碳六烯酸1.261.19α-亚麻酸*1.00±0.00b1.54±0.00a不饱和脂肪酸总量/饱和脂肪酸总量1.811.94花生二烯酸0.52±0.00b0.73±0.01a多不饱和脂肪酸总量/饱和脂肪酸总量0.490.66山嵛酸0.17±0.00a0.15±0.01b注：“*”为必需脂肪酸。%2.2.4脆化饲料对罗非鱼肌肉质构的影响（见表6）由表6可知，试验组罗非鱼的肌肉硬度、胶着性和咀嚼性均显著高于对照组（P0.05），内聚性显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.T006表6脆化饲料对罗非鱼肌肉质构的影响组别硬度/g弹性/mm内聚性胶着性/g咀嚼性/g回复性对照组3 138.99±222.77b0.79±0.040.60±0.06a1 889.95±211.94b1 493.02±111.95b0.48±0.07试验组6 048.88±227.05a0.81±0.060.50±0.04b3 005.18±234.63a2 425.51±251.00a0.45±0.112.3脆化饲料对罗非鱼肠道菌群的影响2.3.1脆化饲料对罗非鱼肠道菌群Alpha多样性的影响（见表7）由表7可知，每个样品的Coverage指数均高于0.999，表明检测结果准确可信。通过对比投喂不同饲料的罗非鱼肠道微生物Alpha指数发现，试验组罗非鱼肠道的Chao指数、Shannon指数与Simpson指数为160.75、2.58和0.19，均低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.T007表7脆化饲料对罗非鱼肠道菌群Alpha多样性的影响组别Chao指数Shannon指数Simpson指数Ace指数Coverage指数对照组187.36±34.34a2.82±0.40a0.59±0.41a185.57±30.360.999 4±0.00试验组160.75±26.05b2.58±0.24b0.19±0.06b161.96±26.270.999 8±0.002.3.2脆化饲料对罗非鱼肠道菌群门水平组成的影响（见图1）由图1可知，试验组和对照组罗非鱼在门水平上肠道菌群种类和相对丰度存在明显的差异。对照组中罗非鱼在门水平上肠道菌群以变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、Unclassified_k_norank_d_Bacteria和拟杆菌门（Bacteroidota）等为优势菌门，其中变形菌门占比最大，变形菌门和梭杆菌门占比在80%以上。而试验组以脱硫菌门（Desulfobacterota）、Unclassified_k_norank_d_Bacteria、变形菌门、螺旋菌门（Spirochaetota）、梭杆菌门和拟杆菌门等为优势菌门。对照组和试验组共同优势菌群为变形菌门、梭杆菌门和拟杆菌门，其中脱硫菌门和螺旋菌门仅见于试验组，试验组变形菌门和厚壁菌门的占比明显下降。图1脆化饲料对罗非鱼肠道菌群门水平组成的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.F1a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.F1a22.3.3脆化饲料对罗非鱼肠道菌群功能的影响（见图2）为探索不同饲料对罗非鱼肠道菌群功能的影响，采用PICRUS t软件对肠道菌群的功能进行预测。由图2可知，COG功能分类统计结果表明，对照组与试验组罗非鱼的肠道菌群功能基本一致，肠道细菌“RNA加工与修饰”“染色质结构和动力学”“能源生产和转换”和“细胞周期控制、细胞分裂与染色体分配”功能类群的相对丰度较高，表明两种饲料对罗非鱼肠道菌群功能无显著影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.009.F002图2脆化饲料对罗非鱼肠道菌群功能的影响3讨论3.1脆化饲料对罗非鱼生长性能的影响有研究表明，投喂蚕豆可显著改善草鱼[3-6]、罗非鱼[7]、异育银鲫[8]和斑点叉尾鮰[9]等鱼类的肉质，但会显著降低其生长性能，从而导致饲料系数显著上升，养殖成本明显增加；在饲料中添加不同比例的蚕豆饲喂罗非鱼也得出类似的结果[12]。原因可能是蚕豆中氨基酸含量不平衡[13]，且含有大量的抗营养因子[14-15]，影响了鱼类肠道对营养物质的吸收与利用所致。本研究中，对照组罗非鱼各项生长指标（WGR、SGR）均高于试验组，但FCR和HSI明显低于试验组。与本项目组前期研究结论[10]相比，脆化专用膨化饲料组罗非鱼的FCR比前期的脆化沉性料（2.94）降低了37.07%，表明通过优化饲料配方、改进加工工艺，脆化专用浮性配合饲料的饲料转化效率得到了明显提高，使试验罗非鱼的生长性能明显提升。可能是由于饲料加工工艺（膨化）减弱了蚕豆抗营养因子的毒性，或降低了抗营养元素如缩合单宁的有效含量，从而提高了试验鱼肠道对营养物质的吸收利用水平和饲料的适口性，具体原因还需进一步研究。3.2脆化饲料对罗非鱼肌肉品质的影响已有相关研究证实，投喂蚕豆可显著提高罗非鱼肌肉中粗脂肪含量，降低粗蛋白含量[7]。本课题组前期研究发现，蚕豆为主要原料研制的脆化专用饲料饲喂罗非鱼的肌肉粗脂肪含量提高了57.3%、粗蛋白含量降低了5.9%[10]。本研究发现，投喂脆化浮性饲料提高了罗非鱼肌肉的粗蛋白、粗脂肪含量。造成差异的原因可能是优化后的脆化料氨基酸比例和平衡性得到了优化提升，饲料蛋白转化效率有了明显提升，从而相应提高了罗非鱼肌肉粗蛋白含量。本试验发现，试验组罗非鱼肌肉中的必需氨基酸、半必需氨基酸、非必需氨基酸、氨基酸总量、呈味氨基酸的含量和必需氨基酸指数均高于对照组，且肌肉中的必需脂肪酸总量、不饱和脂肪酸总量和多不饱和脂肪酸总量也有明显提升。这说明本研究中的脆化饲料能够改善罗非鱼肌肉的营养品质和风味。质构可以反映食品的组织特性[16]；肉的口感、嫩度、可食性及加工出品率与其质构息息相关[17]。质构分析技术已被广泛应用于鱼类试验研究及其水产品加工的科学研究和产品开发中[18]，是评判鱼类肌肉食用品质的常用方法。本研究结果表明，脆化饲料可显著提高试验罗非鱼肌肉的硬度、胶着性和咀嚼性。硬度是肌肉保持形状的内部结合力，与其脂肪含量息息相关，并随着脂肪含量的增大而增大[19-20]。本试验中，罗非鱼的肌肉硬度也呈现出随其粗脂肪含量的增大而增大的变化趋势。胶着性是剪切肌肉时最先感触到的抵抗力，与样品硬度和内聚性均呈正相关；咀嚼性是指将固体食品咀嚼到可吞咽状态时所做的功的大小，与其硬度、内聚性和弹性均有相关性，在数值上等于硬度、内聚性和弹性等三者的乘积[21]。本试验发现，罗非鱼的肌肉硬度和弹性越大，其咀嚼性就越强，三者间呈正相关。林婉玲等[22]对脆肉鲩的研究也发现了这一特点。因此，脆化饲料可明显提升罗非鱼肌肉的食用品质。3.3脆化饲料对罗非鱼肠道菌群的影响肠道是鱼类消化食物、吸收营养物质的主要器官，而肠道细菌的大部分营养物质则是通过鱼类组织液或分解食物而获得，因此饲料的品质对肠道菌群有很大的影响[23]。Chao指数和Ace指数值越大，表明群落的丰富度越高；Shannon指数和Simpson指数则表征物种多样性，其指数值越大，表明群落的多样性程度越高[24]。本研究中，对照组罗非鱼肠道菌群的Chao指数、Shannon指数与Simpson指数均高于试验组，表明脆化饲料降低了罗非鱼肠道菌群的丰富度和多样性。研究发现，鱼类肠道中的优势菌群为拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）等[25]，其中厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门为其核心菌群（在不同鱼类肠道中均有发现）[26]。本研究结果显示，试验组和对照组罗非鱼肠道菌群在门水平上的种类和相对丰度存在明显的差异；对照组以变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门等为优势菌门，而试验组以脱硫菌门（Desulfobacterota）、Unclassified_k_norank_d_Bacteria、变形菌门、螺旋菌门（Spirochaetota）、梭杆菌门和拟杆菌门等为优势菌门，表明鱼类肠道菌群结构与饲料密切相关[27-29]。此外，本试验中仅试验组罗非鱼肠道中发现脱硫菌门和螺旋菌门，且变形菌门和厚壁菌门占比明显下降。原因可能是添加了蚕豆的脆化饲料更适宜于脱硫菌门和螺旋菌门在罗非鱼肠道的定植与增殖，而其中的抗营养因子对肠道有益菌如厚壁菌门的微生物存在一定抑制作用，使其比例相应下降，进而导致试验鱼的生长速度下降，具体原因有待于进一步研究。处于稳态中的肠道微生物菌群可帮助鱼类消化吸收营养物质，调控鱼体的免疫系统，进而维持机体的健康[30]。本试验结果显示，对照组与试验组罗非鱼肠道菌群功能基本一致，说明两种不同饲料对罗非鱼肠道菌群功能无显著影响；肠道细菌基因在RNA加工与修饰、染色质结构和动力学、能源生产和转换、细胞周期控制、细胞分裂与染色体分配等功能类群方面的相对丰度较高，表明这些肠道菌群可以维持正常状态下细胞的基本生理活动，并可使试验鱼肠道菌群的结构维持相对稳定和平衡的状态。4结论本研究结果表明，脆化饲料降低了罗非鱼的生长性能，但改善了罗非鱼肌肉的营养价值和食用品质；改变了罗非鱼肠道菌群结构和多样性，但对肠道菌群功能没有显著影响。