生物质能源是可再生、可替代化石资源转化成气态、液体和固态燃料以及其他化工产品的碳资源[1]。我国的农林生物质资源十分丰富，2021年我国秸秆产生量约8.65亿t，秸秆能源化利用率仅为8.5%，其中玉米秸秆产量达到3.21亿t[2]。目前，如何高效地转化木质纤维素资源是当今亟须解决的问题。白腐真菌能够将木质素降为CO2和H2O[3]，其可以合成一些非特异性和非立体结构选择性的酶，如漆酶（Lac）、锰过氧化物酶（MnP）和木质素过氧化物酶（Lip）等[4]。这些酶已被应用于多芳香族化合物、农药和染料等的降解[5-8]，在生物转化方面也具有重要的价值[9]。与白腐真菌相反，褐腐真菌能够优先降解生物质的半纤维素和纤维素部分，留下木质素[10]。但也有研究表明，一些褐腐真菌也具有漆酶活性，能够降解木质素，但降解能力不如白腐真菌[11]。在生物预处理方面，关于单株白腐真菌的应用研究较多。但近年来微生物共培养或复合菌群的使用也越来越受到人们的关注[12]。微生物共培养可以避免单一菌株引起的反馈调节，即代谢物抑制问题[13]。本研究以木腐真菌为研究对象，以玉米秸秆为试验材料，比较木腐真菌共培养和单一木腐真菌预处理玉米秸秆，考察秸秆微观结构的变化，系统评价微生物共培养对玉米秸秆的降解效果的影响，旨在筛选出优秀的微生物共培养组合。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌种白腐真菌一色齿毛菌（Cerrena unicolor）、白囊耙齿菌（Irpex lacteus）和褐腐真菌红缘拟层孔菌（Fomitopsis pinicola）采自东北林业大学帽儿山实验林场，于北方民族大学微生物实验室保存。1.1.2玉米秸秆玉米秸秆采自宁夏回族自治区银川市平吉堡，自然风干，粉碎，过20目筛，50 ℃烘干。1.1.3试验试剂蔗糖、葡萄糖、琼脂、柠檬酸钠、柠檬酸、酒石酸钠、酒石酸、CaSO4·H2O、2, 2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、2, 6-二甲氧基苯酚（2, 6-DMP）、MnSO4、H2O2、NaCl、CaCl2、K2HPO4、CuSO4、Na2MoO4·2H2O、KAl(SO4)2·12H2O、FeSO4·7H2O、MgSO4、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CoCl2均为分析纯，购自索拉宝生物科技有限公司。琥珀酸二甲酯、次氮基三乙酸（NTA）均为分析纯，购自西格玛奥德里奇贸易有限公司。1.1.4仪器设备3-30K台式高速冷冻离心机（德国SIGMA公司），HH-4数显恒温水浴锅（南北仪器有限公司），SW-CJ-1FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），HZ-9511K台式恒温双层摇床（太仓市科教器材厂），LRH250生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），UV1000紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），LDZX-50KBS高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂），SU8010扫描电镜（日立制作所）、FTIR-7600傅里叶红外光谱仪（天津港东科技股份有限公司）。1.1.5培养基木屑麦麸培养基：78%白桦木屑、20%麦麸、1% CaSO4·H2O和1%蔗糖。PDA琼脂培养基（1 L）：200 g马铃薯、20 g葡萄糖、20 g琼脂，蒸馏水定容至1 L[14]。液体培养基参考Tien等[15]方法配制。1.2试验方法1.2.1拮抗试验将保存在木屑麦麸培养基中的木腐真菌接种到PDA琼脂培养基，于28 ℃黑暗培养直至菌丝生长至培养皿边缘，放入4 ℃保存。分别从3种木腐真菌PDA固体培养基取6 mm菌饼接种于PDA固体培养基，置于28 ℃黑暗培养。1.2.2共培养精确称取4.000 g玉米秸秆装入50 mL的锥形瓶中，加入26 mL的液体培养基，121 ℃灭菌20 min。取2个不同或相同菌种的6 mm菌饼，分别置于锥形瓶底部的对称位置，在培养的第20 d加入5 mL灭菌蒸馏水。在共培养的第10、20、30、40 d，每瓶加入25 mL pH值4.5的0.05 mol/L酒石酸-酒石酸钠缓冲溶液，28 ℃、120 r/min振荡2 h，取上清，10 000 r/min离心5 min，作为粗酶液。1.2.3木质素酶活性测定漆酶酶活测定体系为3 mL，其中包括0.2 mL的1.0 mmol/L ABTS、2.3 mL pH值为3.0的0.05 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和0.5 mL适当稀释的粗酶液，在30 ℃测定420 nm处吸光度1 min的变化。1个酶活力单位（U）定义为1 min氧化1 μmol ABTS所需的酶量[ε420 nm=36 000 L/(mol·cm）]。锰过氧化物酶活性测定体系为3 mL，其中包括10 μL的0.05 mol/L 2, 6-DMP、2.44 mL pH值为5.0的0.05 mol/L酒石酸-酒石酸钠缓冲液、20 μL的0.05 mol/L MnSO4、0.04 mol/L H2O2 30 μL，适当稀释的粗酶液0.5 mL，在30 ℃测定469 nm处吸光度1 min的变化。1个酶活力单位（U）定义1 min转化1 μmol 2, 6-DMP所需要的酶量[ε469 nm=49 600 L/(mol·cm）]。1.2.4秸秆失重率测定将预处理前后玉米秸秆50 ℃烘干恒重，测秸秆重量。Wx=100%×(N0-Nx)/N0 (1)式中：Wx为失重率（%）；N0为处理前秸秆重量（g）；Nx为处理后秸秆重量（g）。1.2.5木质纤维素含量测定采用范氏（Van Soest）法[16]测定木腐真菌预处理玉米秸秆前后的纤维素、半纤维素和木质素含量。1.2.6红外光谱分析使用傅里叶红外光谱仪在4 000~400 cm-1之间的光谱范围内对每个样品进行扫描，光谱分辨率为4 cm-1。1.2.7电镜扫描分析加速电压为5 000 V时，通过扫描电子显微镜评估未处理和处理过的玉米秸秆的表面，对所有样品表面进行喷金，以提高导电性。1.3数据统计与分析试验数据采用GraphPad Prism 8软件进行方差分析，Tukey法进行多重比较检验。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.13种木腐真菌在PDA固体培养基中的拮抗试验结果（见图1）为了分析3种木腐真菌是否适合共培养，对3种木腐真菌进行了拮抗试验。由图1可知，白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌、白囊耙齿菌和一色齿毛菌均呈现锁死拮抗作用，而红缘拟层孔菌和一色齿毛菌呈现一定程度的相互入侵，3种木腐真菌生长速度接近。研究表明，3种木腐真菌适合进行同步共培养。真菌共培养时，大约55%的组合表现出不同类型的锁死拮抗作用[17]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F001图13种木腐真菌在PDA固体培养基中的拮抗试验结果注：a为白囊耙齿菌，b为红缘拟层孔菌，c为一色齿毛菌。2.2木腐真菌共培养对木质素酶活性的影响2.2.1木腐真菌共培养对漆酶活性的影响（见图2）由图2（a）可知，一色齿毛菌和红缘拟层孔菌共培养产漆酶，在第10、20 d时未受到抑制，但是第30、40 d时，共培养产漆酶活性显著低于红缘拟层孔菌单独培养（P0.05）。由图2（b）、2（c）可知，预处理40 d内时，一色齿毛菌和白囊耙齿菌共培养以及白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌共培养产漆酶活性大部分均显著低于单一真菌产漆酶（P0.05），这两组共培养显示出对产漆酶的抑制作用。图2木腐真菌共培养对漆酶活性的影响注：字母不同表示差异显著（P0.05）；图3、图4、图6与此同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F2a1（a）一色齿毛菌和红缘拟层孔菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F2a2（b）一色齿毛菌和白囊耙齿菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F2a3（c）白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌2.2.2木腐真菌共培养对锰过氧化物酶活性的影响（见图3）由图3可知，预处理40 d内，3种共培养预处理相对于单一真菌预处理产锰过氧化物酶活性随培养时间发生变化。第10 d时，3种共培养并没有增加锰过氧化物酶产酶量。但在第20 d时，3种共培养产锰过氧化物酶活性均高于单一真菌预处理，白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌共培养是红缘拟层孔菌单独预处理产锰过氧化物酶活的3.11倍，为933.82 U/L；而一色齿毛菌和白囊耙齿菌共培养是一色齿毛菌单独预处理产锰过氧化物酶活的2.73倍，为941.82 U/L。第30 d时，一色齿毛菌和白囊耙齿菌共培养产锰过氧化物酶活性降低，但仍显著高于单一真菌预处理产酶量（P0.05）。第40 d时，共培养并未增加锰过氧化物酶活性。图3木腐真菌共培养对锰过氧化物酶活性的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F3a1（a）一色齿毛菌和红缘拟层孔菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F3a2（b）一色齿毛菌和白囊耙齿菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F3a3（c）白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌2.3木腐真菌共培养对玉米秸秆损失率的影响（见图4）由图4可知，在培养的第20、30 d，一色齿毛菌和白囊耙齿菌、白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌共培养的秸秆失重率均显著大于真菌单独培养（P0.05）。在培养第40 d时，白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌共培养的秸秆失重率最大，达到46.15%；一色齿毛菌和红缘拟层孔菌共培养的40 d中秸秆失重率均与真菌单独培养差异不显著。图4木腐真菌共培养对玉米秸秆损失率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F4a1（a）一色齿毛菌和红缘拟层孔菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F4a2（b）一色齿毛菌和白囊耙齿菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F4a3（c）白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌2.4木腐真菌共培养对玉米秸秆红外光谱的影响（见图5）由图5可知，在3 356 cm-1处出现一个宽吸收峰与纤维素、半纤维素和木质素分子的—OH伸缩振动有关[18]，在木腐真菌预处理后羟基的吸收峰向波数较大的方向移动，表明纤维素、半纤维素和木质素的暴露。在2 920、1 634 cm-1处观察到的吸收峰来自苯环C=C骨架振动[19]，说明在预处理过程中苯环骨架受到了一定的影响。1 506 cm-1处的吸收峰来自木质素C=O伸缩和芳香骨架振动以及碳水化合物的—CH-和—OH弯曲[20]，白囊耙齿菌预处理后吸收峰由1 506 cm-1移动到1 515 cm-1，表明白囊耙齿菌相对于其他预处理对玉米秸秆的木质素或纤维半纤维素结构破坏更大[21]。1 319 cm-1处的吸收峰是硬木和所有非木材木质素紫丁香基（S）环和愈创木基（G）环缩合的特征峰，而896 cm-1是木质素对-羟基苯基（H）单位-CH-的面外形变振动引起的吸收峰[22]，木腐真菌预处理后吸收峰向波数较大的方向移动，说明木质素中的3种单体结构受到了一定影响。1 380、1 247、1 162、1 056 cm-1处的吸收峰，分别是由纤维素和半纤维素—CH2摇摆和COO—拉伸、C—O—C不对称拉伸、C—O—C反对称伸缩振动、C1—H变形引起[23]，这些纤维素和半纤维素的特征吸收峰在预处理也发生了一定的移动，表明预处理过程中，玉米秸秆中的纤维素和半纤维素结构也受到影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F005图5木腐真菌共培养对玉米秸秆红外光谱的影响玉米秸秆被一色齿毛菌和红缘拟层孔菌共培养预处理后，木质素相关特征峰变化最为明显，如3 356 cm-1处特征峰移动到3 362 cm-1，2 920 cm-1处特征峰移动到2 924 cm-1，1 634 cm-1移动到1 639 cm-1，1 319 cm-1移动到1 323 cm-1，表明一色齿毛菌和红缘拟层孔菌共培养对玉米秸秆木质素降解最明显，而纤维素对应的特征峰，如1 380 cm-1移动到1 374 cm-1变化也较大。木腐真菌对玉米秸秆降解后，各特征峰的波数和吸光值均发生了明显的变化，代表了样品中各个官能团的振动。2.5木腐真菌共培养40 d对玉米秸秆木质纤维素含量的影响（见图6）由图6可知，共培养第40 d时，各组处理中纤维素、半纤维素和木质素含量均低于未处理组，但半纤维素含量变化差异不显著。一色齿毛菌和红缘拟层孔菌共培养中木质素和半纤维素含量分别比未处理降低了5.81%和3.62%，木质素降解率达到45.75%，而纤维素的降解率较少，为19.66%。白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌共培养中木质素和纤维素含量降低均最少，分别降低了1.61%和5.10%。白囊耙齿菌单独培养时，纤维素含量降低最多，为15.26%，降解率达到44.02%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F006图6木腐真菌共培养40 d对玉米秸秆木质纤维素含量的影响2.6木腐真菌共培养预处理玉米秸秆的电镜扫描结果（见图7）由图7（a）可知，未经处理的玉米秸秆表面平整光滑，形态较完整。图7木腐真菌共培养预处理玉米秸秆的电镜扫描结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F7a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F7a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F7a310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F7a410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F7a510.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F7a610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.21.016.F7a7由图7（b）~7（g）可知，在木腐真菌预处理后，玉米秸秆表面似乎被破坏。此外，在预处理后的玉米秸秆表面观察到细小的碎屑状结构，表明预处理后的真菌对秸秆表面和内部结构均具有影响。由图7（d）、7（f）可知，在第40 d白囊耙齿菌单独培养对玉米秸秆表面破坏最为严重，一色齿毛菌和白囊耙齿菌共培养对玉米秸秆表面破坏程度次之。除了白囊耙齿菌外，一色齿毛菌和红缘拟层孔菌单独培养相对于共培养对玉米秸秆表面的破坏更为明显。3讨论反刍动物能够将农作物秸秆作为其饲料来源，但秸秆中木质素含量过高会降低瘤胃微生物的降解能力[24]。采用物理、化学和生物的方式可去除木质素，提高秸秆的利用率，但利用真菌或木质素酶去除木质素是最实用和环保的方法[25-26]。Shrivastava等[27]发现，利用白腐真菌（Pleurotus ostreatus和Trametes versicolor）发酵小麦秸秆能够有效提高粗蛋白含量、有机物消化率、短链脂肪酸产量、可代谢能值，降低C/N比，这种生物转化使富含木质素的小麦秸秆具有了高能量饲料的潜力。Sufyan等[28]在研究侧耳属不同菌种通过固态发酵方式提高麦秸、稻草、玉米芯的营养价值和消化率时发现，利用Pleurotus ostreatus对小麦秸秆和水稻秸秆进行固体发酵，以及利用Pleurotus florida对玉米芯中固态发酵均能够最大选择性降解木质素，提高其营养价值和消化率。Kumar等[29]从白腐真菌Schizophyllum commune中提取漆酶对不同农作物秸秆进行体外木质素的降解，结果显示，漆酶在体外可以提高小米、水稻、小麦和玉米秸秆的消化率。Ijoma等[17]研究发现，KN10（Trichoderma harzianum BHU-BOT-RYRL10）与其他真菌的共培养会显著降低漆酶活性，增加锰过氧化物酶活性。但Kachlishvili等[30]研究发现，两种木腐真菌共培养能够促进漆酶合成，Cerrena unicolor和Trametes versicolor共培养以及Lenzites betulina和Panus lecomtei共培养均可提高漆酶活性，而Cerrena unicolor与其他真菌共培养却会降低锰过氧化物酶活性3~12倍。本研究中，一色齿毛菌和红缘拟层孔菌共培养，木质素的损失率显著高于单一培养，但是漆酶和锰过氧化物酶却不是最高，表明木质素的降解并不仅仅与漆酶和锰过氧化物酶活性有关，可能还有其他木质素降解相关酶的介导。由于真菌共培养组合不同，对木质素酶的合成和木质素的降解表现出的影响也不同，可以选择适当的真菌组合提高相关木质素酶的产量或提高木质素的降解，对开发木腐真菌的应用能力具有重要意义。4结论本研究结果表明，一色齿毛菌和白囊耙齿菌共培养以及白囊耙齿菌和红缘拟层孔菌共培养40 d，相对于单一真菌预处理，共培养显示抑制漆酶合成，但在培养的第20 d时共培养显著提高了锰过氧化物酶的合成。一色齿毛菌和红缘拟层孔菌共培养预处理40 d后，木质素降解率最高，且纤维素的降解率较低。