发酵全混合日粮（FTMR）是采用营养调控技术，按照日粮配方将精饲料、粗饲料、矿物质以及维生素等成分进行搅拌、混合后进行发酵处理的日粮[1-2]。FTMR具有营养搭配合理、能够长期贮存的优势[3]。霉菌是引起FTMR腐烂变质的主要因素，玉米赤霉烯酮（ZEN）、T-2毒素（T-2）、黄曲霉毒素（AFT）、呕吐毒素（DON）和伏马菌素（FB）等霉菌毒素是有毒、致癌的生物性污染物[4-6]。这些霉菌毒素能够污染饲料，影响动物生产性能及健康[6]。与单独一种霉菌毒素相比，多种霉菌毒素协同作用对饲料造成的污染问题更严重[7-9]。因此，本试验研究多种霉菌毒素在发酵全混合日粮中的动态变化规律，监测饲料中的霉菌毒素含量，为减轻霉菌毒素对畜牧业的危害、降低经济损失提供参考。1材料与方法1.1试验材料发酵全混合日粮的制作采用湖南碧野公司生产的ZF型生物饲料发酵机，搅拌均匀后用密闭的塑料袋压实，包好，饲料在袋内自然发酵30 d，取样测试分析发酵品质和营养水平[10]。发酵全混合日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.026.T001表1发酵全混合日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量营养水平合计100正大186肉羊浓缩料15粗蛋白15.28±0.34玉米30中性洗涤纤维56.66±0.88麸皮10酸性洗涤纤维30.54±0.80柠条20钙1.43±0.01苏丹草25磷0.40±0.05注：营养水平均为实测值。%发酵全混合日粮的pH值为4.23，乳酸占总酸含量的85%，乙酸占干物质含量的0.15%，乳酸与乙酸的比例为12.43∶1。1.2试验设计取50 kg发酵全混合日粮，置于温度18~25 ℃、湿度20%~50%的房间内，使生物发酵饲料在开放条件下产生霉菌毒素。每天定量喷洒水，保证霉菌毒素繁殖所需的水分。每隔5 d采样1次，对试验样品8个部位进行多点取样。按照霉菌毒素检测方法进行菌群计数，测定ZEN、T-2、AFB1、DON、FB1的含量变化。1.3测定指标及方法1.3.1霉菌毒素霉菌毒素采用ZLJC/YQ-069液相质谱联用仪进行测定[11]。试剂主要包括乙腈（色谱纯、分析纯）、甲醇（色谱纯）、甲酸（HPLC级）、流动相B（移取50 μL甲酸加水稀释至100 mL得到0.5%甲酸溶液）。AFB1、FB1、ZEN、T-2、DON等5种真菌毒素标准品纯度均不低于97%。准确称取1.00 mg各毒素标准品，采用乙腈溶解并定容至10 mL，-18 ℃以下贮存。根据各毒素在质谱中的响应值，使用甲醇稀释各储备液，配制成含200 μg/L DON、FB1，50 μg/L ZEN、T-2，20 μg/L AFB1的混标溶液。应用UPLC-XEVO TQ超高效液相色谱-串联四级杆质谱（ESI源）准确称取2 g粉碎均匀的试样于50 mL离心管中，加入20 mL 80%乙腈、0.1%甲酸水溶液，在恒温振荡器中振荡30 min，加入QuEChERS萃取包（Part No.5982-0650，安捷伦），振摇2 min，8 000 r/min离心5 min，取2 mL置于50 ℃水浴中氮吹至近干。使用甲醇水溶液溶解，定容至0.5 mL，旋涡混匀1 min，0.22 μm聚醚砜滤膜置于样品瓶中，进行UPLC-MS/MS测定。1.3.2不同时间霉菌毒素含量的回归分析应用DPS拟合不同霉菌毒素随时间变化回归关系方程，应用Excel 2003进行数据处理作图，从而了解霉菌毒素随时间变化的繁殖规律。1.3.3霉菌毒素之间的互作效应分析应用DPS对不同霉菌毒素进行回归分析，再采用Excel 2003进行数据处理作图，从而了解霉菌毒素之间的互作效应，并进行相关分析。2结果与分析2.1不同霉变时间FTMR霉菌毒素含量及数学模型测定结果（见表2、表3）饲料霉变后，在饲料原料和全价料中会同时存在多种霉菌毒素。即使每种原料只含有一种霉菌毒素，在多种原料配合成全混合日粮后也会含有多种不同的霉菌毒素[12-14]。不同时间霉变日粮中5种霉菌毒素含量变化见表2。对霉菌含量与时间关系进行回归分析后，DON含量变化趋势不明显，一直处于平稳的状态，无数学模型。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.026.T002表2不同霉变时间FTMR霉菌毒素含量测定结果取样时间/d霉菌和酵母菌含量/(CFU/g)T-2/(μg/kg)FB1/(μg/kg)AFB1/(μg/kg)DON/(μg/kg)ZEN/(μg/kg)15.0×1020.035±0.00551.00±2.530.72±0.1251.00±4.2722.00±0.5762.0×1030.029±0.00447.00±3.520.62±0.1062.00±3.3822.00±0.68113.6×1030.034±0.00546.00±3.320.79±0.1561.00±4.3624.00±0.63161.0×1040.027±0.00445.00±2.730.66±0.1360.00±4.3529.00±0.24211.0×1050.023±0.00344.00±2.360.73±0.1663.00±3.8228.00±0.68262.8×1050.021±0.00441.00±3.121.00±0.1550.00±2.3826.00±0.43由表2、表3可知，第1~26 d霉菌和酵母菌含量变化呈指数上升，y=3.259 4e0.2537x（R²=0.970 5）；T-2的含量呈现下降的趋势，数量变化呈线性回归：y=-0.000 5x+0.035 5（R²=0.801 6）；FB1含量以抛物线形式变化，15 d到达最低点，数学回归模型：y=0.023 6x2-1.019 3x+52.246（R²=0.730 7）；AFB1含量呈直线上升趋势，数学回归模型：y=0.009 1x+0.629 9（R²=0.404 8）；ZEN含量从第1 d的22 μg/kg上升到26 d的26 μg/kg，数量呈指数上升，y=21.863e0.01x（R²=0.616 9）。研究表明，随着饲料霉变时间增加，霉菌毒素含量也会相应增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.026.T003表3霉菌毒素含量的数学模型序号项目数学模型R21霉菌和酵母菌含量y=3.259 4e0.253 7x0.970 52T-2y=-0.000 5x+0.035 50.801 63FB1y=0.023 6x2-1.019 3x+52.2460.730 74AFB1y=0.009 1x+0.629 90.404 85ZENy=21.863e0.01x0.616 92.2不同霉菌毒素之间的相关系数、互作效应霉菌毒素互作效应是指2种或超过2种霉菌毒素同时存在于饲料中时共同作用对饲料毒性产生的影响[5,7,9-10]。多种霉菌毒素同时存在时的毒性可能表现为加性效应、亚加性效应、协同效应、增效效应和颉颃效应[7-8]。多种霉菌毒素还具有促进或抑制霉菌毒素繁殖的功能[13]。应用DPS对不同霉菌毒素进行Pearson测定，不同霉菌毒素之间相关性见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.026.T004表4不同霉菌毒素之间相关系数及显著性项目T-2FB1AFB1DONZENT-2—0.023 30.387 00.980 20.152 5FB10.872 8—0.186 20.948 00.157 3AFB1-0.436 4-0.623 2—0.175 20.802 4DON0.013 2-0.034 7-0.635 4—0.640 2ZEN-0.661 4-0.655 90.132 50.244 7—注：左下角为相关系数，右上角为P值。由表4可知，T-2与FB1之间存在正相关关系，表示两者具有相互促进作用；FB1与AFB1、DON、ZEN之间存在负相关关系；ZEN和T-2、FB1之间存在负相关关系，表示两者之间具有抑制作用。不同霉菌毒素之间互作效应见图1。图1不同霉菌毒素之间互作效应10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.026.F1a1（a）FB1与T-2的互作效应10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.026.F1a2（b）AFB1与FB1的互作效应10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.026.F1a3（c）DON与AFB1的互作效应10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.026.F1a4（d）DON与T-2的互作效应由图1（a）可知，FB1的含量随着T-2含量增加而增加，两者相互促进生长，存在线性关系：y=511.92x+31.248（R²=0.761 7）。由图1（b）可知，AFB1含量随着FB1的含量增加而减少，两者相互抑制生长，两者之间的线性关系为：y=-0.025 2x+1.903 3（R²=0.388 4）。由图1（c）可知，DON含量随着AFB1含量增加而减少，两者相互抑制生长，两者之间的线性关系为：y=-27.306x+78.404（R²=0.403 7）。由图1（d）可知，T-2和DON之间存在二次曲线关系，随着T-2含量增加，DON含量先增加后降低，拟合方程为：y=-197 556x2+11 155x-94.349（R²=0.556 8）。3讨论3.1发酵全混合日粮中多种霉菌毒素共存分析全球每年约有25%的粮食作物受到霉菌毒素的污染[14]。以受到霉菌毒素的粮食作物为原料会危害畜禽的健康，影响畜禽产品安全[15-16]。在饲料原料或全价料中会同时存在几种霉菌毒素[6,17]，因此一种饲料原料在自然条件只受一种霉菌毒素污染的可能性较低。杜妮[18]调查发现，我国部分地区抽检的饲料及饲料原料中，AFB1、ZEN、DON、FB1和T-2均呈高阳性率，检测到3种以上霉菌毒素的样品占比93.63%。雷元培等[19]对饲料原料和饲料中霉菌毒素污染进行调查，发现2019年饲料原料和饲料3种霉菌毒素阳性检出率为64.64%；2020年饲料原料和饲料3种霉菌毒素阳性检出率为87.43%，表明饲料及饲料原料中霉菌毒素污染范围较广，且大多数饲料样品同时受多种霉菌毒素污染。本研究表明，在发酵全混合日粮中多种霉菌毒素共存。由于未对其他种类霉菌毒素进行检测，不排除有其他霉菌毒素的存在。3.2不同霉菌毒素的互作关系分析在实际生产中，饲料或原料中单一霉菌毒素的含量低于试验控制条件下也会引起毒性效应，造成畜禽生产性能下降。不同的霉菌毒素之间存在相互协作的关系。与饲喂纯化霉菌毒素饲料相比，饲喂自然污染的霉菌毒素饲料动物产生的中毒症状更明显，原因是两种或两种以上霉菌毒素存在互作效应导致。霉菌毒素的互作效应普遍存在，其中镰孢菌毒素之间、镰孢菌毒素与其他霉菌毒素之间的毒性互作效应最为常见。DON和萎蔫酸、AFB1和T-2，AF、赭曲霉毒素（OTA）和T-2等的互作效应主要表现为加性效应和协同效应[4-5]。3.3日粮霉变对饲料营养水平的影响饲料中含有霉菌生长所必需的营养物质，使霉菌在饲料发生霉变后快速繁殖[20]。在饲料霉变前期存在有益的霉菌，有益于提升饲料质量。真菌的菌丝穿透能力和产酶能力均很强，发酵过程中菌种利用粗脂肪中碳水化合物作为生长繁殖碳源，霉菌分泌的蛋白酶将大分子蛋白质降解为小分子肽和游离氨基酸，提高氨基酸含量。在饲料霉变后期，霉菌会消耗氨基酸等养分，并将能量转化为水和CO2[21]。霉菌能够分泌促进饲料分解的酶，大幅度削弱饲料的营养价值，降低发酵饲料中蛋白质的含量，霉菌的快速增殖使饲料中维生素A、维生素D、维生素E等的比例也随之降低[22]。3.4日粮霉菌毒素安全评价分析霉菌毒素是发酵饲料霉变过程产生的有毒有害物质。饲料中霉菌毒素可由动物代谢到人类可食用的肉、奶、蛋等产品中[23]。我国《饲料卫生标准》（GB 13079—2001）规定奶牛精料和补充料中AFB1限量≤10 μg/kg；肉牛精料和补充料中AFB1限量≤50 μg/kg；玉米、花生饼（粕）、棉籽饼（粕）、菜籽饼（粕）限量≤50 μg/kg；豆粕限量≤30 μg/kg。发酵饲料中霉菌毒素的评价是反刍动物养殖者和科研机构关注的重点。青贮饲料中霉菌毒素的主要种类包括AFB1、ZEN和DON，青贮饲料中AFB1、ZEN和DON允许限量参照我国国家标准《饲料卫生标准》（GB 13078—2017），饲料阳性样品判定标准即检出限值为AFB1≥0.5 μg/kg、ZEN≥1 μg/kg、DON≥10 μg/kg、FB1≥25 μg/kg、T-2≥50 μg/kg[24]。本试验中发酵全混合日粮样品中AFB1、ZEN和DON含量均高于检出限值，属于阳性饲料样品。4结论本试验发现，在发酵全混合日粮霉变过程中，各种霉菌毒素会逐渐增多，研究可为了解霉菌毒素的变化规律提供技术参考。