畜牧养殖业中使用抗生素来预防和治疗仔猪腹泻、奶牛乳房炎、鸡白痢等动物性疾病[1-2]。但是抗生素的大量使用会引发细菌产生耐药性、抗生素残留等问题，从而影响国民健康和养殖业的高质量发展[3-4]。2020年，农业农村部全面禁止饲料中添加抗生素药物，新型“替抗”产品的研发和应用迫在眉睫[5-7]。微生态制剂（probioties）是一类活菌制剂，利用益生菌或益生菌的促生长物质来抑制致病菌的生理活动，调节菌群平衡，提高机体免疫力，维护机体健康[8]。随着“禁抗令”颁布实施，微生态制剂在饲料行业中的应用迅速扩大[9]。益生菌活菌数是微生态制剂产品中的重要指标，如何突破单菌型发酵并且提高发酵液活菌浓度是当前发酵工艺条件研究的重点[10-11]。试验在前期研究基础上，选用双歧杆菌、凝结芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌3种益生菌配伍，通过单因素试验和正交试验设计优化，探究三菌型复合微生态制剂的最佳发酵工艺条件，为研究开发有效的微生态制剂类“替抗”产品提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种双歧杆菌菌株（保藏号：BNCC186143）、凝结芽孢杆菌（保藏号：BNCC136363）、嗜酸乳杆菌（保藏号：BNCC338075）均由本课题组实验室提供。1.1.2试剂LB液体培养基、MRS培养基、BL琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司；氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇、浓盐酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉、EDTA、甘油购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。1.1.3仪器设备LD5-2A型高速离心机购自北京京力离心机有限公司；DY2009（X）-032-00型高压蒸汽灭菌锅购自上海东亚压力容器制造有限公司；AY220型电子天平购自日本岛津制作所；BPX-52型生化培养箱购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-C1-LED超洁净工作台购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；MP512-01型精密pH计购自上海三信仪表厂；BGD-318WSL型冰箱购自青岛海尔股份有限公司；微量移液枪购自上海佳安分析仪器厂；752N紫外可见光光度计购自上海精密科学仪器公司；79-1型磁力加热搅拌器购自常州国华电器有限公司；CX43型光学显微镜购自奥林巴斯（中国）有限公司。1.2试验方法1.2.1菌种的活化、传代、鉴定和扩培取-70 ℃冰箱冻存的双歧杆菌菌株加入LB培养基中，在37 ℃下活化培养3次。将活化后对数生长期的菌液涂布培养在BL琼脂培养基上37 ℃下恒温培养12 h，挑取平板上的单菌落在LB液体培养基中扩培后再涂布培养于MRS琼脂平板上，在37 ℃恒温培养箱中生长12 h后，随机挑取半数以上单菌落进行革兰氏染色并在电子显微镜下镜检观察是否有杂菌；将镜检后的纯种菌落接种到MRS液体培养基上进行扩大培养，待用[12]。凝结芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌按照上述方法进行操作，经培养后获得纯种活化扩培菌悬液。1.2.2OD法检测活菌浓度标准曲线的建立试验采用分光光度法（OD）对益生菌培养液进行快速准确地检测[13]。在液体培养基中，细菌浓度与其在600 nm波长的吸光值呈线性关系，通过建立细菌浓度与吸光值（OD600 nm）之间的标准曲线，可以较准地通过吸光值反映菌悬液中细菌的活菌浓度。将活化的双歧杆菌接种于MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养，在培养后的第0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h取样，分别在600 nm波长下检测各组样品的吸光值。同时，每组发酵液样品经适当倍数稀释后，均匀涂布在MRS琼脂平板上培养，进行单菌落平板计数，每组样品的吸光值检测和平板计数都设置3次重复。根据各组发酵液样品的OD600 nm吸光值和平板计数法测得的活菌浓度，制作双歧杆菌快速检测OD法标准曲线[14]。凝结芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌按照上述方法进行操作，分别绘制OD法标准曲线。1.2.3单因素试验1.2.3.1发酵时间将活化的双歧杆菌以3％的接种量接种于无菌MRS液体培养基中，设定培养温度为37℃，初始pH值为7.0，按照不同发酵时间进行培养，分别在培养1、2、3、4、6、8、10、12、14 h测定其在600 nm波长下的吸光值，设置3个平行检测，考查发酵时间对双歧杆菌生长的影响，选出较优发酵时间。按照相同的方法考察发酵时间对凝结芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌生长的影响[15]。1.2.3.2培养温度将活化的双歧杆菌以3％的接种量接种于无菌MRS液体培养基中，设定发酵液初始pH值为7.0，按照31、34、37、40、43、46 ℃发酵温度下恒温培养12 h，测定各组发酵液在600 nm波长下的吸光值，设置3个平行检测，考查培养温度对双歧杆菌生长的影响，选出较优发酵温度。按照相同的方法考察培养温度对凝结芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌生长的影响。1.2.3.3初始pH值将活化的双歧杆菌以3％的接种量接种于无菌MRS液体培养基中，设定培养温度为37 ℃，按照初始pH值分别为6.0、6.5、6.7、6.9、7.1、7.5恒温培养12 h，测定各组发酵液在600 nm波长下的吸光值，设置3个平行检测，考查初始pH值对双歧杆菌生长的影响，选出较优初始pH值。按照相同的方法设定初始pH值分别为6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5，考察其对凝结芽孢杆菌生长的影响；设定初始pH值分别为4.5、5.0、5.6、5.8、6.0、6.5，考察嗜酸乳杆菌生长最适初始pH值。1.2.3.4接种量将活化的双歧杆菌分别按照1％、2％、3％、4％、5％、6％的接种量接种于无菌MRS液体培养基中，在最适初始pH值下，37℃恒温培养12 h，测定各组发酵液在600 nm波长下的吸光值，设置3个平行检测，考查接种量对双歧杆菌生长的影响，选出较优接种量。按照相同的方法考察接种量对凝结芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌生长的影响[16]。1.2.3.5三种益生菌配比将对数生长期的三种益生菌按照1∶1∶1、1∶1∶2、2∶2∶1和2∶1∶2（双歧杆菌：凝结芽孢杆菌：嗜酸乳杆菌）比例混合，分别制成不同的发酵种子液，按3％的接种量分别接种于无菌MRS液体培养基中。调节初始pH值7.0，在37℃下恒温培养12 h，测定各组发酵液在600 nm波长下的吸光值，设置3个平行检测，考察种子液中不同益生菌配比对发酵液菌浓度的影响，选出较优的益生菌配比。1.2.4正交试验优化发酵条件在单因素试验基础上，对影响复合微生态制剂发酵的益生菌配比、发酵温度及初始pH值3个因素及其交互作用进行综合研究。采用L9（34）正交试验设计，以发酵后菌悬液的吸光值OD600 nm为评价指标，设置3因素3水平研究方案进行正交试验优化发酵条件。正交试验因素与水平设计见表1[17]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.017.T001表1L9（34）正交试验因素与水平设计水平A菌种配比B培养温度/℃C初始pH值11∶1∶1377.221∶1∶2407.032∶1∶2436.8注：因素A中菌种配比为：双歧杆菌∶凝结芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌。2结果与分析2.1益生菌镜检结果（见图1）由图1（a）可知，双歧杆菌经革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性菌，在显微镜下呈短杆（棒）状、散布排列、菌落比较小、表面光滑、微微凸起、呈乳白色。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.017.F001图1益生菌镜检结果由图1（b）可知，凝结芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，菌体间易成对或成串排列、单菌落较大、圆形、带有褶皱、表面不光滑、浅黄色。由图1（c）可知，嗜酸乳杆菌属革兰氏阳性菌，菌体较双歧杆菌和凝结芽孢杆菌都短、单菌落直径大于双歧杆菌、圆形、表面光滑、呈白色。3种益生菌均无杂菌，可以用作种子液扩培。2.2OD法检测益生菌浓度标准曲线（见图2）由图2（a）可知，双歧杆菌生长标曲线性拟合良好，拟合的方程为y=5.736 7x+0.996 7，R2=0.992 4。由图2（b）可知，凝结芽孢杆菌线性拟合方程为y=3.531 8x+3.997 7，R2=0.994 2。由图2（c）可知，嗜酸乳杆菌线性拟合方程为y=1.860 1x+6.832 4，R2=0.993 1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.017.F002图2OD法检测益生菌浓度标准曲线2.3各因素变化对双歧杆菌生长的影响（见图3）由图3（a）可知，发酵时间对活菌浓度的影响符合双歧杆菌的生长曲线，在0~3 h为益生菌生长的延滞期，3~10 h为对数生长期，在10 h左右趋于平缓达到稳定期，双歧杆菌的浓度可达2.38×107 CFU/mL。由图3（b）可知，在培养温度31~37 ℃时，双歧杆菌发酵液浓度随着培养温度的升高而明显增加，在37~40 ℃时活菌浓度较高，在培养温度超过40 ℃时，菌悬液浓度呈急剧下降的趋势，双歧杆菌最适生长温度为38 ℃。由图3（c）可知，初始pH值对双歧杆菌的生长有明显的影响，在初始pH值为6.0~7.2时，菌液浓度随着初始pH值的上升而升高。在初始pH值为7.2~7.5时，菌液浓度随着初始pH值升高而下降。考虑到不同的益生菌对生长环境pH值很敏感，不同益生菌细胞代谢产物也有所差异，双歧杆菌生长最适初始pH值为7.2。由图3（d）可知，随着接种量的增加，双歧杆菌的生长呈现出先增后降的现象，在接种量为3%时达到峰值。在接种量低于3%时，接种量的增加会促进双歧杆菌生长，但超过3%的接种量时，菌体代谢产酸使发酵液过早进入衰亡期反而会不利于细菌生长，选择接种量为3%最为合适。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.017.F003图3各因素变化对双歧杆菌生长的影响2.4各因素变化对凝结芽孢杆菌生长的影响（见图4）由图4（a）可知，在0~4 h为凝结芽孢杆菌生长的延滞期，4~12 h为对数生长期。凝结芽孢杆菌浓度在12 h左右趋于平缓达到稳定期，菌悬液的浓度可达9.41×108 CFU/mL。由图4（b）可知，在30~37 ℃范围内凝结芽孢杆菌浓度随温度升高呈上升趋势，在37~40 ℃范围内趋于平稳，超过40 ℃菌液浓度下降，凝结芽孢杆菌最适生长温度为39 ℃。由图4（c）可知，初始pH值的增加对凝结芽孢杆菌的生长也呈现先增后降的趋势，最适初始pH值为7.0。由图4（d）可知，随着接种量从1%增加到6%，凝结芽孢杆菌的生长呈现出先增后降的现象，在接种量为4%时达到峰值，选择接种量为4%最为合适。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.017.F004图4各因素变化对凝结芽孢杆菌生长的影响2.5各因素变化对嗜酸乳杆菌生长的影响（见图5）由图5（a）可知，在0~4 h为嗜酸乳杆菌生长的延滞期，4~12 h为对数生长期，嗜酸乳杆菌浓度在12 h左右趋于平缓，到达稳定期，菌悬液的浓度可达3.16×108 CFU/mL。由图5（b）可知，在30~37 ℃范围内嗜酸乳杆菌浓度随温度升高呈上升趋势，在37~46 ℃范围内菌液浓度随温度升高而下降，嗜酸乳杆菌最适生长温度为37 ℃。由图5（c）可知，初始pH值从4.0到6.5的增加对嗜酸乳杆菌的生长，呈现先增后降的趋势，最适初始pH值为6.0。由图5（d）可知，随着接种量的增加，嗜酸乳杆菌的生长呈现出先增后降的现象，在接种量为4%时达到峰值，选择接种量为4%最为合适。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.017.F005图5各因素变化对嗜酸乳杆菌生长的影响2.6不同益生菌配比对发酵液活菌浓度的影响（见图6）由于不同益生菌对培养条件的需求有所差异，以及他们的代谢产物对彼此生长有促进或者抑制的复杂作用，所以合适的益生菌菌种配比对复合微生态制剂的发酵工艺有着重大影响。由图6可知，在复合益生菌种子液中嗜酸乳杆菌含量较高的组别（1∶1∶2和2∶1∶2），发酵菌悬液OD值较高，活菌浓度也较高，这是因为乳酸菌发酵产酸降低生长环境pH值更利于嗜酸乳杆菌生长；再比较嗜酸乳杆菌含量较高的两组中，双歧杆菌含量较高的菌种配比发酵组，菌悬液活菌浓度最高，和其他组相比差异显著。因此在单因素试验研究中，最适菌种配比双歧杆菌：凝结芽孢杆菌：嗜酸乳杆菌为2∶1∶2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.017.F006图6不同益生菌配比对发酵液菌浓度的影响注：图中三种益生菌配比为双歧杆菌∶凝结芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌。2.7复合益生菌微生态制剂发酵条件的优化L9（34）正交试验方案及结果直观分析见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.017.T002表2L9（34）正交试验方案及结果直观分析试验ABC空列OD600 nm111111.123±0.017212220.723±0.020313331.096±0.010422310.998±0.015523120.654±0.018621231.119±0.012733211.397±0.013831321.568±0.020932131.396±0.014K12.9423.8103.1733.518K22.7713.1263.2392.945K34.3613.1473.6623.611极差R1.5900.6840.4890.657因素主次ABC优方案A3B1C3通过极差分析可知，影响复合微生态制剂发酵各因素的主次关系为ABC，菌种配比对发酵菌悬液浓度影响最大。正交试验结果方差分析见表3。通过对正交试验方差分析结果进行F检验可知，菌种配比、发酵温度、初始pH值3个因素对发酵液菌浓度都有极显著的影响，与直观分析结果相匹配。经过正交试验结果优化后的发酵工艺最优发方案为A3B1C3，即最适菌种配比为双歧杆菌：凝结芽孢杆菌：嗜酸乳杆菌2∶1∶2，最适发酵温度为37 ℃，最适初始pH为6.8。由于此方案在正交设计方案中，且在L9（34）的9种试验方案中，菌悬液OD600 nm最高，在优化方案A3B1C3经过重复试验，得到发酵液菌悬液OD600 nm为1.591±0.015，经平板计数法测得活菌浓度为7.34×109 CFU/mL，与正交试验结果无差异，确定方案为微生态制剂发酵的最佳工艺条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.017.T003表3正交试验结果方差分析变异来源平方和自由度均方F值F(2,16)0.05F(2,16)0.01F(2,16)0.005A1.5220.761 8001 218.88**3.636.237.51B0.3120.153 500245.52**C0.1420.070 400112.64**区间0.0120.005 0008.00**模型误差0.2620.130 100208.17**试验误差0.01160.000 625总值2.2426注：**代表差异极显著（P0.01）。3结论益生菌的菌种配比对复合微生态制剂的发酵影响最大，其次为发酵温度和初始pH值，几种益生菌在生长过程中的相互促进或者拮抗作用是复合微生态制剂发酵中需要考虑的主要问题。经过优化，三菌型复合微生态制剂的最佳发酵条件为菌种配比2∶1∶2（双歧杆菌：凝结芽孢杆菌：嗜酸乳杆菌）、发酵温度37 ℃、初始pH值为6.8。在此条件下，发酵后的复合微生态制剂菌悬液浓度为7.34×109 CFU/mL。在使用微生态制剂替代抗生素来改善肠道菌群治疗细菌性动物疾病时，无论是多菌型还是单菌型微生态制剂，活菌浓度是发挥益生菌拮抗致病菌作用的保障之一，试验为进一步微生态制剂的体内研究提供参考。