槟榔（Areca catechu L.）是热带太平洋和东南亚特有的一种植物[1]，主要分布在亚太地区[2]。槟榔的主要化学成分包括生物碱、黄酮、脂肪酸、鞣质、三萜和甾体类以及多糖类等物质[3-5]。槟榔除了作为中药使用外[6]，还可食用[7]。目前槟榔最大的应用场景是作为“嗜好品”[8-9]，是未成熟的槟榔果实，利用部位为槟榔果壳（实为大腹皮）。迄今为止，有超过6亿人是习惯性咀嚼槟榔者[10]。但槟榔加工过程中产生的槟榔芯（实为嫩槟榔）几乎未利用[11]。据统计，“槟榔嗜好品”每年加工产生的槟榔芯多达35 000 t，加工剔除的槟榔芯通常被当作废料焚烧处理，造成环境污染及资源浪费[12]。槟榔芯含有大量的生物碱、黄酮类、多酚类、纤维素等营养成分[13]，具有兴奋神经、增强注意力和改善记忆等作用[14]，可作为天然饲料添加剂，具有抗球虫[15]、驱绦虫[16]作用。自“禁抗”政策推出后[17]，中草药饲料添加剂成为优先替代方案，其天然、绿色、健康的优势得到了更多的认可和推广[18]。槟榔芯中含有丰富的生物碱，可进行资源再利用，可将槟榔芯开发为天然的养殖投入品原料[19]。中药指纹图谱反映了中药复杂成分的整体特征[20]，其缺点是模糊性强，不能突出不同产地药材的特征性[21]。而中药特征图谱是通过化学分析、液相及气相等技术手段构建中药化学特征和成分特征的图谱[22]，可改善中药指纹图谱的缺点。因此，本试验旨在利用HPLC技术建立槟榔芯的特征图谱，为后续槟榔芯开发成中兽药或饲料添加剂提供一定的技术支撑。1材料与方法1.1仪器超高效液相色谱系统（美国，安捷伦1260），ZORBAX 300-SCX色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），移液枪（德国，Eppendorf公司），ME204E电子天平（METTLER TOLEDO），KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。1.2试剂槟榔碱标准品（AR，批号：HR9421W2，纯度≥98%），槟榔次碱标准品（AR，批号：HR3822W2，纯度≥98%），去甲槟榔碱盐酸盐标准品（AR，批号：HR1322W1，纯度≥98%），去甲槟榔次碱盐酸盐标准品（AR，批号：HR5522W2，纯度≥98%），色谱级乙腈（Merck）、色谱级甲醇、磷酸、分析纯三乙胺（国药集团化学试剂有限公司），Milli-Q超纯水。1.3样品22批槟榔芯批次及产地见表1。鲜果槟榔产自海南万宁。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.T001表122批槟榔芯批次及产地序号批次产地序号批次产地S120220401海南万宁S1220220926湖南益阳S220220816海南万宁S1320220928湖南益阳S320220402湖南益阳S1420220929湖南益阳S420220826湖南益阳S1520220930湖南益阳S520220914湖南益阳S1620221001湖南益阳S620220915湖南益阳S1720221002湖南益阳S720220916湖南益阳S1820221003湖南益阳S820220917湖南益阳S1920221119湖南湘潭S920220918湖南益阳S2020221120湖南湘潭S1020220919湖南益阳S2120221121湖南湘潭S1120220925湖南益阳S2220221201印度尼西亚质控样品（QC样品）：分别从22批槟榔芯样品中各取1 g混合均匀。1.4溶液的制备1.4.1供试样溶液制备分别精密称定QC样品、鲜果槟榔芯及22批槟榔芯粉末1 g于具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇溶液，超声提取（250 W，40 kHz）30 min，放至室温，用甲醇补足损失的质量，转入离心机离心，取上层清液，过0.45 μm滤膜，收集续滤液即得供试样溶液。1.4.2对照品溶液的制备精密称定槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱对照品适量，分别置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配制成浓度为0.500、0.208、0.264、0.580 g/L的储备液。1.5色谱条件的优化参考《中华人民共和国药典》[23]及《中华人民共和国兽药典》[24]中槟榔碱的液相检测方法，分别考察检测波长、流速、进样量、流动相pH值对色谱图的影响，对色谱条件进行优化。以QC样为检测对象，进行DAD全扫，确定最大吸收波长。考察不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同进样量（5、8、10 µL）、不同流动相pH值（2.52、2.90、4.93）、不同柱温（20、25、30 ℃）对色谱图分离度、峰形的影响。1.6方法学考察取制备好的QC样品，分别进行精密度试验（连续进样测定6次）、稳定性试验（分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样）、重复性试验（平行6次进样），记录色谱图。以4号峰槟榔碱为S峰，计算各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值。1.7模拟工厂试验槟榔芯是鲜果槟榔（青果）经过一系列加工工艺后，在去籽环节剔除槟榔芯而来[25]。为避免外源性添加剂对槟榔芯内源性成分的干扰，本试验将模拟工厂的6个加工过程，探究每一步加工过程对槟榔芯有效成分的影响。（1）煮青果：取适量青果，加入适量没过青果的清水，煮25~30 min；（2）烘烤青果：烘箱60~70 ℃，烘48 h；（3）入味：水蒸气蒸煮80~90 ℃，30~60 min；（4）发籽：60~80 ℃转动数圈；（5）入苏：小苏打适量于冷开水溶解后倒入，浸泡8 h，适当搅拌；（6）烤籽：80~90 ℃，水分控制在25%～28%。每一步得到成品后，切籽，取槟榔芯，50~60 ℃烘12 h，再称重（干重），打粉，提取样品，按色谱条件进样。2结果与分析2.1色谱条件的优化（见图1~图5）检测波长的选择：出峰后，对样品色谱图采用全波长扫描。由图1可知，大多数色谱峰的最大吸收波长在215 nm。因此，选择215 nm作为数据采集波长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.F001图1215 nm波长色谱图考察不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）对槟榔芯中主要色谱峰的分离效果的影响。由图2可知，柱流速为1.0 mL/min时，在确保分离度的前提下出峰时间最短。因此，本试验选择流速为1.0 mL/min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.F002图2不同流速优化结果考察不同柱温（25、30、35 ℃）对槟榔芯中主要色谱峰的分离效果的影响。由图3可知，尽管柱温的变化会对出峰时间产生影响，但是不同柱温对分离度的影响并不明显。在峰形方面，柱温为25 ℃时，色谱图的峰形表现最佳。因此，本试验选择柱温为25 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.F003图3不同柱温优化结果考察进样量（5、8、10 µL）对色谱图的影响。由图4可知，5、8 µL的进样量响应较低。因此，选择10 µL作为本试验方法的进样量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.F004图4不同进样量优化结果采用三乙胺将0.1%磷酸水pH值分别调为2.52、2.92、4.93，评估分离度、峰形、出峰时间等因素。由图5可知，pH值在2.5左右峰形及分离度较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.F005图5不同pH值优化结果综合上述试验结果，确定的色谱条件是ZORBAX 300-SCX（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相为0.1%的磷酸水-乙腈（体积比90∶10），0.1%的磷酸水用三乙胺调pH值至2.30~2.55；检测波长为215 nm；流速为1.0 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 μL。2.2方法学考察（见表2~表7）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.T002表2精密度相对保留时间（n=6）编号峰1峰2峰3峰4RSD/%1.0332.4301.0430.000精密度10.4550.5370.7581.000精密度20.4560.5630.7581.000精密度30.4550.5370.7571.000精密度40.4540.5350.7561.000精密度50.4550.5370.7571.000精密度60.4440.5230.7381.00010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.T003表3精密度峰面积相对保留时间（n=6）编号峰1峰2峰3峰4RSD/%1.7902.0183.3490.000精密度10.2260.1950.1951.000精密度20.2160.1850.2101.000精密度30.2240.1920.2141.000精密度40.2260.1940.2101.000精密度50.2270.1950.2131.000精密度60.2230.1890.2131.00010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.T004表4重复性相对保留时间（n=6）编号峰1峰2峰3峰4RSD/%0.0341.9650.0410.000重复性10.4550.5370.7571.000重复性20.4560.5370.7581.000重复性30.4560.5630.7581.000重复性40.4550.5370.7571.000重复性50.4560.5370.7581.000重复性60.4560.5370.7571.000表2~表7中，峰1为去甲槟榔次碱，峰2为槟榔次碱，峰3为去甲槟榔碱，峰4为槟榔碱，各峰和S峰（槟榔碱）之间相对保留时间RSD均小于3%，相对峰面积RSD均小于%，均符合方法学要求，说明仪器的精密度良好，槟榔芯样品的4个峰重复性稳定性较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.T005表5重复性相对峰面积（n=6）编号峰1峰2峰3峰4RSD/%1.8201.6572.6160.000重复性10.2240.1920.2101.000重复性20.2140.1830.2031.000重复性30.2160.1850.2101.000重复性40.2160.1850.2141.000重复性50.2160.1840.2061.000重复性60.2130.1860.2191.00010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.T006表6稳定性相对保留时间（n=6）编号峰1峰2峰3峰4RSD/%0.1351.8520.0950.000稳定性00.4550.5370.7581.000稳定性20.4550.5370.7571.000稳定性40.4540.5350.7561.000稳定性60.4550.5370.7571.000稳定性80.4560.5630.7581.000稳定性100.4560.5370.7581.000稳定性120.4560.5370.7571.00010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.T007表7稳定性相对峰面积（n=6）编号峰1峰2峰3峰4RSD（%）2.4582.3223.4830.000稳定性00.2260.1950.1951.000稳定性20.2240.1920.2141.000稳定性40.2260.1940.2101.000稳定性60.2240.1920.2101.000稳定性80.2160.1850.2101.000稳定性100.2160.1840.2061.000稳定性120.2130.1860.2191.0002.3实验室模拟工厂试验（见图6）由图6可知，模拟工厂的6个加工过程中均含有槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱，每步加工过程对槟榔芯有效成分的影响不大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.F006图6实验室模拟工厂色谱图注：1为去甲槟榔次碱，2为槟榔次碱，3为去甲槟榔碱，4为槟榔碱；下图同。2.4特征峰的标定及参照峰的选择（见图7）按“2.1项”方法同时对QC样品、鲜果槟榔芯、22批槟榔芯及标准品进行分析，记录HPLC图谱。由图7可知，QC样品、鲜果槟榔芯中主要成分均在12~35 min之间出峰，其中有4个峰均能够与4个生物碱标准品相对应。峰1为去甲槟榔次碱，峰2为槟榔次碱，峰3为去甲槟榔碱，峰4为槟榔碱，说明在QC样品、鲜果槟榔芯及22批槟榔芯中均含有上述4种碱。参考《中华人民共和国药典》[23]及《中华人民共和国兽药典》[24]中“槟榔”药材的特征成分以及响应值，确定将4号峰槟榔碱作为S峰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.F007图7槟榔芯液相图谱2.5特征峰的相对保留时间（见表8）以S峰槟榔碱的保留时间为参照标准，换算其他特征峰的相对保留时间。由表8可知，4个特征峰相对保留时间RSD均小于3%，说明各特征峰出峰时间相对稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.T008表822批槟榔芯特征图谱相对保留时间编号峰1峰2峰3峰4RSD/%0.142 80.061 70.046 70S10.438 90.533 40.744 11S20.438 90.533 50.744 01S30.439 30.533 90.744 21S40.439 00.533 80.744 01S50.438 40.533 10.743 71S60.439 40.533 90.744 31S70.438 50.533 30.743 61S80.438 50.533 20.743 61S90.438 70.533 50.743 81S100.438 80.533 60.743 71S110.438 20.533 00.743 01S120.438 50.533 30.743 51S130.438 40.533 30.743 41S140.439 40.534 10.744 31S150.438 50.533 30.743 51S160.438 60.533 40.743 61S170.439 70.534 30.744 51S180.438 70.533 50.743 61S190.439 20.533 90.743 81S200.438 90.533 70.743 91S210.438 80.533 60.744 21S220.441 30.533 60.744 21平均值0.438 90.533 50.743 812.6特征图谱的生成将上述22批次样品的色谱图结果以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）”，进行色谱图叠加，确保4个特征峰在22批次样品中均被检测到。槟榔芯色谱图叠加结果见图8。进行多点校正后，生成对照特征图谱（R），结果见图9。通过以上两种方法验证，确定了4个共有的代表性特征峰，依次标记为1~4号峰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.F008图8槟榔芯色谱图叠加10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.022.F009图9槟榔芯对照特征图谱2.7特征图谱的结果评判QC样色谱与图9的槟榔芯对照特征图谱进行比较，两者有相同的特征峰和轮廓，且测定QC样品的HPLC图谱中峰1~峰4与S峰的相对保留时间分别为0.440 7、0.534 6、0.743 6、1.000 0与规定值的偏差分别为0.004 1%、0.002 1%、-0.000 3%、0，均小于3%，符合结果判定要求[25]。3讨论3.1色谱条件的优化本试验通过优化HPLC色谱条件，对柱温、流速、进样量、流动相pH进行考察[26]。结果显示，柱温和进样量对保留时间影响不大，流速和流动相pH值对保留时间影响较大。流速快则出峰时间快，保留时间短；流速慢则出峰时间慢，保留时间长。流动相的pH值大，则出峰时间快；流动相的pH值小，则出峰时间慢，分离度相对较好。此外，本试验考察不同色谱柱选择了3根不同色谱柱：XCharge C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）、ZORBAX 300-SCX色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）、ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm），对槟榔芯中主要色谱峰的分离效果进行了考察，并对峰形和出峰时间等因素进行了综合考量。结果表明，C18色谱柱检测生物碱类成分只能检测到槟榔碱，其他3个生物碱没有检测出来，而阳离子交换柱（SCX）色谱柱可以检测到4种生物碱类成分[27]，具有较好的分离度，并且出峰时间相对较短，表明生物碱类成分用SCX柱分离效果较好。本试验优化色谱条件后的个别色谱峰还存在拖尾现象，后续可以进一步优化色谱条件，使峰形更佳。3.2特征峰的确定特征峰的标定一般是选取4~8个共有的色谱峰作为特征峰。本试验的研究对象槟榔芯中生物碱特征组分较少。为确定槟榔芯特征性成分，本试验同时测定青果槟榔芯、实验室模拟工厂槟榔芯及工厂提供的22批槟榔芯。结果表明，与标准品比对，以上3种不同来源的槟榔芯均含有4种生物碱。青果槟榔芯峰面积大于切籽取芯的槟榔芯峰面积。由此可见，槟榔芯的色谱图随着加工过程的进行，峰高有所降低。推测原因可能是加工过程中高温蒸煮等过程破坏有效成分[28-29]。4结论本次试验通过对仪器条件进行优化，能够对槟榔芯中的各种化学成分进行有效分离，对22批槟榔芯进行分析，成功建立了槟榔芯HPLC特征图谱。模拟“槟榔嗜好品”加工的几个步骤，通过与标准品对比，证明QC样、青果槟榔芯及实验室模拟工厂几个步骤中槟榔芯中均存在4种生物碱，指认这4个峰为特征峰，分别为槟榔碱、槟榔次碱、去甲槟榔碱、去甲槟榔次碱。将槟榔碱（4号）峰设为S峰，计算4个特征峰的相对保留时间，得出槟榔芯各特征峰相对保留时间的规定值，分别为0.438 9、0.533 5、0.743 8、1.00 0，建立的槟榔芯HPLC特征图谱可以实现对槟榔芯的质量评价。槟榔芯特征图谱的精密度、稳定性重复性的RSD值均小于3%，可对槟榔芯进行质量控制。本研究为槟榔芯开发成养殖投入品过程中的品质控制提供技术支持和数据依据。