日粮中营养物质的刺激能够使基因表达更有活力，探究影响机体基因表达的营养物质的作用机制可为某些特定基因表达的研究提供营养分子基础。因此，探究日粮营养成分中的营养因子调控动物基因的表达使机体达到最佳的生长状态，在现代畜牧生产中具有重要意义。羊毛是最常见的纺织原材料[1]。新疆绵羊品种乔达多胎红羊有绒毛、两型毛和粗毛3种毛型；乔达多胎红羊被毛以红色为主，其余部位基本上无色斑；被毛厚密而绒多，光泽好[2]，是优良的地方半粗毛绵羊新品种，乔达多胎红羊毛是和田地毯的主要原材料。根据以往关于毛色的报道[3]，鉴定为毛色相关的基因较多，其中基因座300多，基因150多[4]。哺乳动物毛色由黑色素细胞产生的真黑素和棕黑素在毛基质中的沉积而形成[5]。毛色调控的基因可直接引导机体内黑色素的生成、转移和分布[6]。LFE1、STX17与BMP7基因促进毛囊的形成、发育、增殖、分化等周期性的变化[7]。研究表明，敲除小鼠皮肤组织LFE1抑制毛囊中黑色素的形成，导致毛色变浅[8]。目前，关于蒙古马、驴、绵羊等大型家畜的STX17基因相继被克隆，并表明了STX17基因也参与毛色的形成[9]。BMP7在山羊、牦牛、绵羊、人、小鼠和獭兔毛囊中过度表达[10]。最近全基因组关联分析（GWAS）已成为挖掘基因的有效方法，诸多学者基于GWAS技术分析到了与绵羊各种性状相关的遗传机制，但基于基因相对表达量技术分析日粮蛋白对乔达多胎红羊毛色基因的差异表达尚未见报道。乔达多胎红羊体重与体尺指标均呈极显著正相关，且此结果为乔达多胎红羊群体的育种选育、饲料配制与遗传种质特性提供了育种基础[11]。然而，目前国内尚无乔达多胎红羊日粮蛋白对生长性能的相关研究。因此，本研究选用乔达多胎红羊为研究对象，探讨日粮蛋白含量对基因STX17、LEF1与BMP7表达量、生长性能及产毛量的影响。1材料与方法1.1试验设计试验于2022年10月至12月（共计60 d）在和田地区皮山县西域沐羊人农牧科技有限公司开展，选用活重相似的成年乔达多胎红羊42只，随机分为对照组和试验组，每组3个重复，每个重复7只羊。试验组日粮组成为玉米10.0%、豆饼15.0%、小麦秸20.0%、麸皮30.0%、大麦5.0%、食盐0.5%、青干草粉19.5%，粗蛋白含量13.5%；对照组日粮组成为玉米20.0%、豆饼5.0%、小麦秸15.0%、麸皮30.0%、大麦10.0%、食盐0.5%、青干草粉19.5%，粗蛋白含量12.5%，两组日粮的消化能均为10.38 MJ/kg。试验羊均自由采食苜蓿干草，每日每只绵羊饲喂500 g配合饲料（新疆西域沐洋人农牧科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1不同日粮蛋白与目的基因mRNA表达量1.2.1.1总RNA的提取和cDNA的合成试验结束后，每组选择3只羊采集皮肤组织，置于液氮快速冷冻并-80 ℃保存。根据制造商说明从健康无病绵羊活体采样皮肤组织并提取总mRNA，用紫外分光光度计检测各组织mRNA的OD值与浓度（OD260 nm/280 nm=1.8~2.0），电泳法检测mRNA的完整性，判断mRNA是否被污染或降解。合格的mRNA使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒进行逆转录合成cDNA。1.2.1.2设计引物及合成基于绵羊基因序列选取两组引物，通过NCBI寻找绵羊β-actin、STX17、LEF1与BMP7基因的序列，使用在线引物设计软件设计引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成引物。引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.T001表1引物序列引物名称引物序列（5'→3'）退火温度/℃扩增产物/bpLFE1F：CTCTATCCAGGCTGGTCTGCR：GGCAGCTGTCATTCTTGGAC60108β-actinF：CCAACCGTGAGAAGATGACCR：CAGAGGCGTACAGGGACAG58103STX17F：TACAGAAGCCATACCAAGCCR：TTGGGGAGGATGAGGTAGGG60101BMP7F：CACAACACCACTCAGTCCACCTCR：AGAGACGTCCCTGGCACATACA601051.2.1.3目的基因的qPCR以逆转录的产物为模板，β-actin为定量内参，每个样品进行3个重复，第一组设置为对照组，按制造商的建议将STX17、LFE1与BMP7基因的qPCR反应体系设为20 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60、58、60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，35个循环；95 ℃变性5 s，4 ℃保存。1.2.2体尺指标与剪毛量试验开始及结束，每组选择3只羊，使用杖尺、软尺、电子秤测定体重、体尺、体长及胸围，并记录每只羊的耳标号及对应测量得到的活重及体尺（胸围、体高与体长）数据。在4月份时剪羊毛并用电子秤测定其重量，取侧面肩胛部从毛根剪去5 cm×5 cm左右面积的毛样，装入自封袋带回新疆农业大学羊毛分析室进行分析。按照《羊毛油脂含量测定方法》（ZB B 45010-88）测定毛脂重。1.3数据统计与分析对目的基因mRNA各组数据、体尺指标与剪毛量的数据进行方差齐性检验后，统计检验各组间差异，采用独立样本t检验进行组间差异比较，试验数据采用SPSS Statistic V20. 0软件进行分析，使用GraphPad8软件绘制柱形图。2结果与分析2.1目的基因mRNA表达量的显著性分析（见图1、图2）各样品中提取的总RNA用紫外分光光度计检测，选出OD值在正常范围之内的mRNA。由图1可知，5S、18S、28S RNA基因条带清晰，说明RNA纯度高且完整性好，可供后续测试使用。由图2可知，qPCR产物经电泳检测，产物单一、纯净、明亮，片段长度符合预期大小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.F001图1总RNA完整性检测结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.F002图2目的基因PCR扩增产物注：1为DNA Marker；2~5为STX17、LFE1、BMP7、β-actin。2.2目的基因与内参基因的标准曲线（见图3~图6）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.F003图3STX17溶解曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.F004图4LFE1溶解曲线通过引物特异性检测反应体系与目的基因扩增程序，检测引物特异性，绘制STX17、LFE1、BMP7与β-actin基因的标准曲线。由图3~图6可知，熔化曲线只有一个尖锐的单峰，扩增效率高，熔化温度分别为60、58、60、60 ℃；无引物二聚体和其他污染，说明引物可靠，反应体系与程序合适，试验结果真实可用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.F005图5BMP7溶解曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.F006图6β-actin溶解曲线2.3不同日粮蛋白含量对乔达多胎红羊皮肤组织中目的基因mRNA表达的影响（见图7）由图7可知，与对照组相比，试验组乔达多胎红羊皮肤组织中LEF1 mRNA表达显著提高（P0.05），而STX17、BMP7 mRNA表达差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.F007图7不同日粮蛋白含量对乔达多胎红羊皮肤组织中目的基因mRNA表达的影响注：“*”表示差异显著（P0.05）。2.4不同日粮蛋白含量对乔达多胎红羊体尺指标的影响（见表2）由表2可知，试验组乔达多胎红羊体重、体高、体长与胸围均显著高于对照组（P0.05）。乔达多胎红羊体尺指标与日粮蛋白含量呈正相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.T002表2不同日粮蛋白含量对乔达多胎红羊体尺指标的影响组别体重/(kg/只)体高/cm体长/cm胸围/cm对照组42.64±8.54a62.22±5.26a63.49±4.72a80.29±6.17a试验组46.17±8.52b69.60±3.87b70.47±5.35b84.41±6.13b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。2.5不同日粮蛋白含量对乔达多胎红羊产毛量的影响（见表3）由表3可知，试验组乔达多胎红羊剪毛量比对照组高32.17%（P0.05），试验组乔达多胎红羊毛脂重比对照组高21.40%（P0.05）。乔达多胎红羊剪毛量、毛脂重与日粮蛋白含量呈正相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.003.T003表3不同日粮蛋白含量对乔达多胎红羊产毛量的影响组别剪毛量毛脂重对照组446.0±19.0a378.5±17.0a试验组589.5±6.0b459.5±3.5bg3讨论3.1不同日粮蛋白含量对乔达多胎红羊皮肤组织中目的基因表达量的影响环境、基因型、表型之间的相互作用决定动物对营养物质的吸收利用率。动物日粮中最重要的营养因子是蛋白质，其调控机体内新陈代谢和特定基因的差异表达。Li等[12]研究表明，营养物质中蛋白质水平降低，导致氨基酸转氨酶mRNA的表达上调，以促进游离氨基酸被猪骨骼肌的吸收。张杰等[13]研究表明，日粮蛋白水平上升可导致荣昌猪肌肉和脂肪发育相关基因的显著表达及肌纤维线粒体DNA拷贝数显著提高。本试验结果表明，与对照组相比，试验组乔达多胎红羊毛色相关基因LEF1 mRNA表达显著提高，而STX17、BMP7 mRNA表达差异不显著。张杰等[13]研究表明，蛋白饲料也会显著提高毛色相关基因的表达，与本研究结果相似。但由于本试验很难避免环境以及交叉污染，在结果上可能会存在一定误差。3.2不同日粮蛋白含量对乔达多胎红羊体尺指标的影响体尺是鉴定绵羊生产能力的重要评定指标之一。羊复胃的生理消化方式和生长发育规律是制定绵羊日粮蛋白消化的重要因素[14]。有研究显示，育肥羊日粮蛋白含量越高，羔羊体重也会增大，当日粮蛋白含量超过23％时与育肥羊的体重呈显著负相关[15]。本试验结果与邱怀等[16]、张永福[17]、李世英等[18]的研究结论一致，绵羊的体尺指标与日粮中蛋白质含量呈显著正相关。日粮蛋白质含量越低，绵羊体重及体尺指标越低；反之，日粮蛋白质水平低则会降低绵羊的生长性能。本试验中，随着日粮蛋白含量增加，绵羊的体重、体高、体尺与胸围均呈上升趋势。因此，适宜的营养水平对乔达多胎红羊的体尺发育具有重要作用。3.3不同日粮蛋白含量对乔达多胎红羊产毛量的影响和田地区气候干燥，昼夜温度差异较大。家畜在低温干燥环境下会造成大量的能量消耗，因此提高家畜的饲养水平十分重要。特别是提高妊娠和哺乳母畜的饲养水平，可加快毛囊生长发育速度，从而促进单位皮肤面积上的毛囊增加，提高剪毛量。本试验结果显示，剪毛量和毛脂重与日粮蛋白含量均显著正相关，且试验组乔达多胎红羊剪毛量、毛脂重均高于对照组，说明饲粮粗蛋白水平为13.5%能够满足乔达多胎红羊日粮中对蛋白物质的需要，为LEF1显著提高其褐黑色素细胞及毛囊发育提供保障，从而提高其产毛量。4结论本研究结果表明，试验组乔达多胎红羊皮肤组织中LEF1 mRNA表达量及体重、体高、体长与胸围和剪毛量、毛脂重均显著高于对照组，LFE1 mRNA的表达量以及体重、体长、体重、胸围等体尺指标和剪毛量、毛脂重均与日粮蛋白含量呈显著正相关。