长江鲟（Acipenser dabryanus）是我国长江上游特有的淡水定居性鱼类。20世纪后期，因水体污染、过度捕捞、栖息地破坏、幼鱼资源补充不足等原因，长江鲟野生资源量急剧下降[1-2]。目前，开展人工养殖、增殖放流是保护长江鲟物种最直接、有效的方式。但人工养殖条件下，长江鲟幼鱼对病原菌易感性提高，会对养殖和增殖放流保护造成不利影响。因此，如何提高长江鲟幼鱼的免疫力和抗病力成为长江鲟物种保护领域的研究热点。中草药因具有资源丰富、价格低廉、不易产生耐药性等优点而广受关注[3]。研究表明，中草药具有促进鱼类生长[4]、改善消化吸收功能[5]、提高抗病能力和保护机体健康[6-7]等功效。利用复方中草药提高鱼类免疫力和抗病力的相关研究已在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[8]、杂交鲟（♀Acipenser schrenckii×♂Acipenser baeri Brandt）[9]、大菱鲆（Scophthalmus maximus Linnaeus）[10]、草鱼（Ctenopharyngodon idella）[11]、胡鲇（Clarias batrachus）[12]等鱼类养殖中广泛开展。但关于中草药在长江鲟物种保护研究领域中的研究鲜见报道。因此，本试验研究复方中草药对长江鲟幼鱼免疫、抗氧化及抗病力的影响，旨在为中草药在长江鲟人工养殖及物种保护等研究领域的应用提供参考。1材料与方法1.1试验动物试验鱼为中华鲟研究所自繁自养的长江鲟幼鱼，随机选取鱼体完整、健康无伤、体重（537.68±25.47）g、体长（46.27±5.71）cm的长江鲟幼鱼360尾。1.2试验材料基础饲料购自浙江金甲水产饲料有限公司，基础饲料为粉料，其营养水平为粗蛋白≥43%、粗纤维≤5%、粗脂肪≥5.0%、磷1.0%~3.0%、粗灰分≤18%、钙2.0%~5.0%、赖氨酸≥2.0%。中草药均购自湖北省宜昌市益丰大药房，药材烘干，粉碎，过80~120目筛网，按照中草药组方配比混匀（黄芪∶白术∶防风∶山楂∶党参∶茯苓∶甘草=3∶2∶1∶1∶1∶1∶0.5）。1.3饲养管理试验在直径2 m、水深0.6 m的水泥池内进行，流水模式培育试验鱼，试验用水为井水，试验期21 d。试验期间养殖水温21.8~23.5 ℃。定时监测养殖水体水质指标，通过排污、换水等措施确保养殖水质指标符合养殖需求。1.4试验设计将360尾长江鲟幼鱼随机分为4组，每组3个重复，每个重复长江鲟幼鱼30尾，对照组、0.5%试验组、1.0%试验组和1.5%试验组分别在基础饲料中添加0、0.5%、1.0%、1.5%配制好的复方中草药。试验前暂养阶段，4组试验鱼均投喂基础饲料（日投喂量为体重的0.50%~0.75%）。7 d后正式试验，按照试验设计中草药添加量配制试验饲料，对照组不添加任何药物，连续投喂21 d。1.5测定指标及方法1.5.1样品采集试验第7、14、21 d时分别采样，每个试验组随机取试验鱼15尾，低温麻醉、尾静脉采血，2 500 r/min离心15 min，血清样本于-80 ℃冰箱保存。1.5.2血清生化指标血清样本指标采用双抗体夹心法测定，检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，参照说明书步骤进行指标检测。抗氧化指标包括：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）。免疫指标包括：免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、补体C3、补体C4、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LSZ）、抗菌肽（TP）。1.5.3攻毒试验在对比投喂试验的第14、21 d，分别开展攻毒试验。试验期间不投喂饲料。试验第14、21 d分别从各试验组中随机抽取长江鲟幼鱼，用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，本实验室保留的病原菌）做攻毒试验。攻毒试验前用不同浓度梯度的嗜水气单胞菌菌液做预试验，筛选出半致死浓度（LD50）进行攻毒试验。每组分别取长江鲟幼鱼20尾，按照100 g体重胸鳍基部注射0.5 mL生理盐水悬浮的嗜水气单胞菌（浓度为1×108 CFU/mL），注射后统计7 d内各组累计死亡的数量，计算死亡率。死亡率=(试验初尾数-试验末尾数)/试验初尾数×100%(1)1.6数据统计与分析试验数据采用SPSS 25.0软件和Excel软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复方中草药对长江鲟幼鱼免疫指标的影响（见表1~表7）由表1可知，与对照组相比，试验第14 d，1.0%试验组和1.5%试验组鱼血清IgG含量显著升高（P0.05）；试验第21 d，1.0%试验组和1.5%试验组鱼血清IgG含量呈下降趋势，其中1.5%试验组鱼血清IgG含量高于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T001表1复方中草药对长江鲟血清IgG含量的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组28.49±4.2126.82±5.22ab24.32±4.08ab0.5%试验组27.42±5.0524.98±4.48a23.76±2.39a1.0%试验组30.11±2.1832.02±1.54b28.76±5.02ab1.5%试验组31.06±2.2032.00±3.18b30.43±5.60b注：同列数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。g/L由表2可知，与对照组相比，试验第7 d，1.5%试验组鱼血清IgM含量显著升高（P0.05）；试验第14 d，1.0%试验组和1.5%试验组鱼血清IgM含量显著升高（P0.05）；试验第21 d，1.0%试验组和1.5%试验组鱼血清IgM含量呈下降趋势，其中1.5%试验组鱼血清IgM高于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T002表2中草药对长江鲟血清IgM含量的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组27.53±3.21a26.37±5.12a26.23±3.72ab0.5%试验组27.51±4.71a29.15±2.62ab25.32±3.67a1.0%试验组33.53±4.44ab35.65±4.88b31.42±4.55ab1.5%试验组35.07±4.87b35.46±5.44b32.57±7.10bmg/L由表3可知，与对照组相比，整个试验期内各试验组鱼血清C3含量未产生显著差异（P0.05）。第7、14、21 d，1.0%试验组和1.5%试验组鱼血清C3含量呈先升高后降低的趋势，以试验第14 d时最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T003表3中草药对长江鲟血清C3含量的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组142.41±20.03140.14±24.21142.91±15.340.5%试验组128.22±12.97160.06±19.98143.82±14.111.0%试验组135.72±15.29152.99±17.35147.75±12.081.5%试验组137.57±24.89164.35±23.25153.72±26.19mg/L由表4可知，试验第7、14 d，1.5%试验组鱼血清C4含量显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T004表4中草药对长江鲟血清C4含量的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组215.84±10.92ab195.14±9.07a203.39±15.720.5%试验组214.08±10.38a208.40±8.84a204.85±20.911.0%试验组218.14±10.47ab212.85±9.36a205.41±13.231.5%试验组236.63±13.53b238.57±7.64b213.52±21.85mg/L由表5可知，与对照组相比，试验第7、14 d，1.5%试验组鱼血清LSZ活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T005表5中草药对长江鲟血清LSZ的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组4.96±1.52a5.55±1.92a5.65±1.270.5%试验组5.47±0.31a5.51±0.24a5.57±1.461.0%试验组5.59±0.33a5.67±0.27ab5.28±1.311.5%试验组6.78±0.70b7.05±0.73b6.20±0.89U/L由表6可知，与对照组相比，试验第7、14 d，1.5%试验组鱼血清AMP含量显著升高（P0.05）；第21 d有所下降，但仍处于显著水平（P0.05）；1.0%试验组鱼血清AMP含量仅在第14 d时显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T006表6中草药对长江鲟血清AMP含量的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组5.49±0.93a5.09±0.74a5.39±1.76a0.5%试验组5.56±0.32a5.78±0.41ab5.49±1.31a1.0%试验组5.88±0.53ab6.78±1.24b6.74±1.41ab1.5%试验组6.68±0.49b8.66±0.64c7.85±1.47bmg/L由表7可知，与对照组相比，试验第14 d，1.5%试验组鱼血清AKP活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T007表7中草药对长江鲟血清AKP活性的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组80.64±20.5282.00±14.73a83.42±14.560.5%试验组81.15±19.5482.41±15.07a85.87±22.821.0%试验组86.55±19.93102.76±17.42ab87.23±17.621.5%试验组102.36±19.32110.41±17.17b91.86±20.12U/L2.2复方中草药对长江鲟幼鱼抗氧化指标的影响（见表8~表13）由表8可知，与对照组相比，试验第7、14、21 d，1.5%试验组鱼血清SOD活性显著升高（P0.05）；在试验第7、14、21 d，1.0%试验组鱼血清SOD活性呈先升后降的趋势（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T008表8中草药对长江鲟血清SOD活性的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组84.91±10.66a92.89±12.11a88.05±17.61a0.5%试验组86.24±11.22a99.50±10.93ab84.22±15.20a1.0%试验组103.39±17.19ab105.17±16.58ab95.31±12.60ab1.5%试验组122.88±25.50b121.13±28.38b112.24±15.54bU/mL由表9可知，与对照组相比，试验第14 d，1.5%试验组鱼血清CAT活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T009表9中草药对长江鲟血清CAT活性的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组46.91±9.0749.15±8.68a44.29±6.980.5%试验组48.47±8.4950.31±13.37a49.72±13.721.0%试验组50.85±11.4166.10±16.81ab49.53±13.741.5%试验组51.95±7.4075.76±14.90b50.53±14.55U/mL由表10可知，与对照组相比，试验第14 d，1.5%试验组鱼血清POD活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T010表10中草药对长江鲟血清POD活性的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组421.05±73.83420.76±18.19a411.85±65.070.5%试验组457.99±44.64450.19±55.68ab424.56±24.011.0%试验组452.45±65.54465.96±61.63ab432.84±38.711.5%试验组469.06±58.54498.07±30.11b452.34±34.24U/L由表11可知，与对照组相比，试验第14、21 d，1.5%试验组鱼血清GSH-Px活性显著升高（P0.05）；试验第14 d，1.0%试验组鱼血清GSH-Px活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T011表11中草药对长江鲟血清GSH-Px活性的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组179.90±25.87168.72±25.72a160.43±35.82a0.5%试验组177.96±21.98182.72±17.71ab169.21±16.20ab1.0%试验组181.08±16.40201.93±19.71bc185.35±23.69ab1.5%试验组189.38±20.96216.45±26.03c197.22±21.07bU/L由表12可知，与对照组相比，试验第14 d，1.5%试验组鱼血清MDA含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T012表12中草药对长江鲟血清MDA含量的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组14.36±2.5613.32±3.12b13.02±3.030.5%试验组14.11±1.3914.68±1.51b13.05±3.941.0%试验组13.50±1.4113.90±1.51b12.68±3.781.5%试验组13.24±1.3810.48±1.86a11.06±2.68μmol/L由表13可知，与对照组相比，试验第7、14 d，1.5%试验组鱼血清T-AOC显著升高（P0.05）；试验第14 d，1.0%试验组鱼血清T-AOC显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.T013表13中草药对长江鲟血清T-AOC的影响组别第7 d第14 d第21 d对照组0.75±0.03ab0.75±0.02a0.75±0.030.5%试验组0.72±0.04a0.75±0.03a0.72±0.051.0%试验组0.78±0.05bc0.85±0.06b0.74±0.051.5%试验组0.82±0.03c0.88±0.07b0.78±0.04mmol/L2.3复方中草药对长江鲟幼鱼抗病力的影响（见图1）由图1可知，投喂复方中草药能够降低感染嗜水气单胞菌的长江鲟幼鱼的死亡率。在试验第14、21 d，1.0%试验组和1.5%试验组鱼攻毒死亡率均明显低于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.010.F001图1复方中草药对长江鲟幼鱼抗病力的影响3讨论3.1复方中草药对长江鲟幼鱼免疫能力的影响鱼类的免疫指标包括免疫球蛋白（Ig）、LSZ、C、TP、AKP等，在抵抗病原体入侵和感染过程中具有重要作用，也是评价机体免疫能力的重要指标。Ig是体液中一类具有免疫功能的球蛋白，软骨鱼类血清中存在两种Ig，即IgM和IgG[13]。王煜恒等[14]研究发现，投喂中草药成分黄芪多糖可显著提高杂交鳢（Channa maculate×Channa argus）血清IgM含量，进而提高机体免疫力和抗病力。本试验发现，1.0%和1.5%复方中草药可以显著提高长江鲟血清IgG和IgM的含量，与上述研究结果一致。补体系统在先天性免疫中具有驱化、调理和消灭病原体的作用[15-17]。补体C3、C4是补体系统中的重要组成成分，在鱼类免疫系统中具有重要作用[18]。研究显示，在黄颡鱼（pelteobagrus fulvidraco）饲料中添加党参、黄芪、野菊花等中草药，可显著提升血清补体C3、C4的含量[19]。富含复方中草药（麻黄、苦参、黄芩、五倍子）的饲料可以增强黄颡鱼血清补体C3和C4的活性[20]。王凡等[21]研究表明，复方中草药可显著提升虹鳟（Oncorhynchus mykiss）血清C3和C4含量，进而提高虹鳟的免疫力和抗病力。本试验结果显示，1.0%试验组和1.5%试验组长江鲟血清C3、C4含量升高，但血清C3含量没有产生显著变化，1.5%试验组鱼血清C4含量显著提高，与上述研究结果存在差异，可能是药物种类及配伍、鱼类种类差异及对药物敏感性等原因引起，具体原因需进一步从外源性药物诱导C3、C4产生的机制进行研究。鱼类血清LSZ活性可反映其免疫状态，因机体接触免疫增强剂或抗原性物质而上升[22]。邢玉娟等[23]研究表明，投喂中草药制剂可以提高草鱼（Ctenopharyngodon idellus）血清LSZ活性。采用黄芪、黄芩等中草药投喂大黄鱼（Pseudosciaena crocea）可显著提升鱼体LSZ活性[24]。投喂复合中草药饲料可明显提高虹鳟血清LSZ活性[21]。本试验也得到了与上述研究一致的结果。AMP是鱼类免疫系统的重要组成部分，对细菌、病毒、真菌和寄生虫具有较强的抑制或杀伤作用，多存在于血液、皮肤黏液、肠道等组织中[25-26]。研究发现，投喂添加AMP的饲料可降低凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）感染副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）和白板综合征的死亡率[27]。本研究中，1.0%试验组和1.5%试验组长江鲟血清AMP含量显著提升，揭示投喂复方中草药对长江鲟免疫能力提升具有促进作用。AKP是机体磷代谢中的重要水解酶，参与鱼类免疫应答和多种生理代谢过程，它通过改变病原体表面结构而增强巨噬细胞对病原体的识别和吞噬作用，在鱼体营养物质吸收利用及非特异性免疫中发挥着重要作用[28]。齐茜等[29]研究表明，摄食复方中草药的闪光鲟（Acipenser stellatus）血液AKP活性显著升高。孙学亮等[30]研究表明，饲料中添加复方中草药可显著提高亚东鲑（Salmo trutta fario）血液AKP活性。本试验结果表明，1.5%中草药对长江鲟AKP活性提高具有作用，进而对提高机体免疫能力具有积极作用。刘海芳等[8]研究表明，基础饲料中添加黄芪、山药、红枣组成的复方中草药可提高虹鳟非特异性免疫功能。付廷斌等[9]研究显示，在饲料中添加复方中草药（黄芪、丹皮、大黄、连翘和白术等）对杂交鲟抗氧化、非特异性免疫功能具有促进作用。高学政等[10]研究显示，在基础饲料中添加党参、白术、茯苓、熟地黄、甘草、山楂、五倍子、栀子和生姜组成的复方中草药提高了大菱鲆幼鱼的非特异性免疫力。郑善坚等[11]研究表明，饲料中添加黄芪多糖、郁金、五味子、甘草等组成的复方中草药可以增强草鱼的非特异性免疫功能。本试验中，饲料中添加1.0%和1.5%复方中草药可不同程度地提高长江鲟血清IgG、IgM、C3、C4、TP的含量和AKP、LSZ活性，其中1.5%添加量作用效果更加显著，表明饲料中添加复方中草药可有效提高长江鲟幼鱼免疫功能，这与上述相关学者的研究结果相似。综上所述，复方中草药可提高长江鲟免疫能力，但这些指标在投喂一段时间达到峰值后开始下降，说明复方中草药对长江鲟免疫功能具有双重调节作用，长时间投喂会降低复方中草药作用。3.2复方中草药对长江鲟幼鱼抗氧化能力的影响SOD、POD、CAT、GSH-Px是机体抗氧化酶系统的重要组成部分，在维持机体氧化和抗氧化动态平衡过程中起到至关重要的作用，也是评价机体抗氧化能力的重要指标[31-32]。MDA可反映组织细胞的受损程度[30]。T-AOC是反映机体总抗氧化能力的关键指标[33]。张照红[34]研究表明，添加复方中草药可以显著影响罗非鱼（Oreochromis niloticus×O. aureus）和草鱼（Ctenopharyngodon idellus）的抗氧化能力。吴彬[35]研究表明，饲料中添加黄芩、金银花、板蓝根、黄芪可显著提升吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）幼鱼的抗氧化能力。孙学亮等[30]研究表明，饲料中添加大黄、黄芪、连翘、黄苓和丹皮组成的复方中草药可显著提高白点鲑（Salvelinus pluvius）、亚东鲑（Salmo trutta fario）血液抗氧化能力，且投喂14 d时效果达到最佳。冒树泉等[5]研究指出，添加复方中草药可提高大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）机体抗氧化能力。本试验结果表明，饲料中添加1.0%和1.5%中草药可不同程度地提高长江鲟血清SOD、CAT、GSH-Px、POD活性及T-AOC，降低MDA含量。其中1.5%试验组效果显著。在投喂第14 d时，长江鲟血清SOD、CAT、GSH-Px、POD、T-AOC达到峰值，之后开始呈下降或向正常指标值恢复变化的趋势；而MDA值在投喂第14 d值最低，之后开始上升，与前人研究结果一致。综上所述，复方中草药对长江鲟抗氧化能力具有调节作用，适当投喂中草药能够提升长江鲟幼鱼机体抗氧化能力。3.3复方中草药对长江鲟幼鱼抗病力的影响复方中草药能够增强鱼类的免疫机能和抗病力，降低对病原微生物的易感性，对抵御病害发生具有作用。盛竹梅等[20]研究表明，投喂复方中草药制剂能够增强黄颡鱼对人工感染嗜水气单胞菌的抵抗力。汤菊芬等[36]研究显示，经人工感染无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）后，以中草药复合微生态制剂组的吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）免疫保护率最高。孙裔雷等[37]研究结果显示，以茵陈、板蓝根、大黄、三七、紫草、金银花等中草药配制的3种复方中草药均可有效提高嗜水气单胞菌攻毒后施氏鲟的成活率。田海军等[38]利用地锦草、茵陈等中草药制成药饵投喂鲫（Carassius auratus），并注射温和气单胞菌（Aeromonas sobria）菌悬液进行攻毒。结果表明，投喂复方中草药组试验鱼存活率明显提高。冯淇元等[39]研究用鲁氏耶尔森菌（Yersinia ruckeri）进行攻毒试验，发现给虹鳟投喂黄芪、连翘、金银花等制成的复方中草药饵料能够降低死亡率，达到保护效果。本研究用嗜水气单胞菌活菌液对长江鲟人工感染试验，结果表明，投喂复方中草药能够降低长江鲟对嗜水气单胞感染的死亡率，与前人研究结果相似，表明投喂复方中草药能够有效提高鱼类的免疫功能，降低对致病菌的易感性，对鱼类的抗病力具有增强作用。同时，本研究也表明，攻毒试验鱼死亡率变化趋势与复方中草药作用长江鲟幼鱼后血清抗氧化和免疫功能相关指标变化具有相关性，表明检测长江鲟血清抗氧化和免疫功能相关指标可反映机体抗病力情况。4结论投喂适量的复方中草药对长江鲟幼鱼的免疫功能、抗氧化功能以及抗病力具有明显的促进作用，表明在饲料中添加适量的复方中草药能够降低长江鲟幼鱼对病原微生物的易感性，增强机体抗病力，从而达到预防疾病发生的效果。