弗氏柠檬酸杆菌是哺乳动物和水产动物共患的机会致病菌，可在动物肠道中定植，在机体抵抗力降低时，弗氏柠檬酸杆菌会转变为致病菌攻击机体。哺乳动物感染弗氏柠檬酸杆菌会出现精神沉郁、抽搐后死亡的症状，剖检可观察到脏器出血肿大[1]。水产动物感染弗氏柠檬酸杆菌后出现烂尾、体表红肿及皮肤溃烂等症状，进而导致水产动物大批量死亡[2-3]。弗氏柠檬酸杆菌对多种常用抗生素表现耐药性。在环境中广泛分布的耐药弗氏柠檬酸杆菌可通过不断进化增加其耐药传播能力及潜在致病能力，存在公共安全隐患。精油是一类天然物质，其多种活性成分共同作用于细菌，能有效抑制大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞杆菌等革兰氏阴性菌及金黄色葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的生长，发挥广谱杀菌作用[4-6]。研究表明，精油能够破坏细菌细胞壁的完整性，提高细菌细胞膜的通透性[7]，导致细菌形态结构破裂而发挥抑菌作用[8]。药食同源植物提取的精油进入动物机体后在肠道吸收转化，对细菌性疾病感染具有良好的防治效果，能够保护脏器形态结构，降低炎症细胞因子水平，帮助畜禽机体抵抗外界细菌感染，提高畜禽的生长性能[9]。本试验为研究弗氏柠檬酸杆菌对小鼠的致病性及精油对弗氏柠檬酸杆菌感染小鼠的预防作用，首先通过腹腔注射不同剂量的弗氏柠檬酸杆菌建立小鼠感染模型，其次观察不同精油预防7 d后小鼠的脏器载菌量、空肠组织炎症因子含量及病理变化，为弗氏柠檬酸杆菌感染的临床治疗提供参考。1材料与方法1.1试验材料弗氏柠檬酸杆菌为广西大学中兽医实验室保存。营养琼脂及营养肉汤购自北京奥博星生物技术有限责任公司。牛至精油购自江西亿森源植物香料有限公司，肉桂精油购自江西雪松天然药用油有限公司，吐温80购自天津市致远化学试剂有限公司。雄性KM小鼠购自长沙市天勤生物技术有限公司，体重为18~24 g，在清洁环境适应性饲养3 d，试验期间提供充足饲粮和饮水。1.2试验方法1.2.1细菌复苏与精油配制冻存的弗氏柠檬酸杆菌接种于营养琼脂，置于细菌培养箱（28 ℃）培养18 h，挑取光滑单菌落接种于营养肉汤，置于摇床（28 ℃，220 r/min）培养18 h，重复3次活化细菌。精油与吐温80比例为5∶3，加入无菌去离子水，使精油最终质量浓度达到50 g/L。1.2.2感染浓度测定弗氏柠檬酸杆菌培养至对数期，取100 μL菌液加入无菌1×PBS进行梯度稀释，涂布于营养琼脂，取2倍稀释菌液、1倍原菌液、2倍浓缩菌液、4倍浓缩菌液共4个浓度进行细菌感染浓度测定，每个浓度涂布4块平皿。放入细菌培养箱培养后，选择CFU在30~300的平皿进行菌落计数，确定细菌数量为5×109 CFU/mL。1.2.3致病性试验将30只小鼠随机分为5组，分别为对照组、1/2倍剂量组（2.5×109 CFU/mL）、1倍剂量组（5×109 CFU/mL）、2倍剂量组（1010 CFU/mL）、4倍剂量组（2×1010 CFU/mL），每组6只小鼠。对照组小鼠腹腔注射0.2 mL生理盐水，不同剂量组小鼠腹腔注射弗氏柠檬酸杆菌菌液（100 μL/g体重）。观察感染后小鼠临床症状，记录小鼠死亡数量，计算存活率。1.2.4精油预防小鼠感染弗氏柠檬酸杆菌试验将30只小鼠随机分为5组，分别为对照组、模型组、牛至精油组、肉桂精油组及复合精油组（牛至精油和肉桂精油联合），每组6只小鼠。各精油组小鼠通过口服的方式给药，剂量为100 mg/kg体重，对照组及模型组小鼠口服生理盐水，1次/d，持续7 d。最后一次给药2 h后，对照组小鼠腹腔注射0.2 mL生理盐水，其余组小鼠腹腔注射感染弗氏柠檬酸杆菌，剂量为100 μL/g。观察感染后小鼠临床症状，记录小鼠死亡数量、脏器载菌量及肠道病变等指标的变化，计算存活率。1.2.5脏器载菌量48 h后麻醉并剖杀小鼠，无菌采集部分肝脏和脾脏，加入无菌1×PBS放入组织研磨仪研磨，涂布于营养琼脂，培养18 h后记录脏器载菌量。1.2.6空肠炎症细胞因子含量测定及病理切片制作采集2~3 cm小鼠空肠组织，液氮速冻，按照试剂盒（BYabscience Biotechnelogy Co., Ltd）说明书检测空肠组织炎症细胞因子的含量。采集1~2 cm小鼠空肠组织，放入4%甲醛溶液固定，按照组织病理切片方法制作空肠切片，使用光学显微镜观察空肠病理学变化。1.3数据统计与分析使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，组间差异使用Duncan's法进行多重比较分析；使用GraphPad Prism 9.0软件作图展示数据。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1小鼠感染弗氏柠檬酸杆菌的临床症状观察结果（见图1）由图1可知，感染弗氏柠檬酸杆菌后12 h，1倍、2倍及4倍剂量组小鼠出现眼睑红肿、眼球充血及畏寒抱团的临床症状，症状随着时间延长而加重，小鼠四肢抽搐后死亡。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.012.F001图1小鼠感染弗氏柠檬酸杆菌的临床症状观察结果剖检死亡小鼠，小鼠肝脏及脾脏均出现不同程度的肿大、出血的现象。小鼠脏器病变结果见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.012.F002图2小鼠脏器病变由图2可知，对照组小鼠脾脏及肝脏的大小、形态及颜色为正常状态；1/2倍剂量组小鼠脏器与对照组相比无明显差异；1倍剂量组小鼠肝脏呈现深红色，有明显出血现象；2倍剂量组脾脏为黑红色，肝脏为深红色，病变程度进一步加重；4倍剂量组小鼠脾脏及肝脏均呈现黑红色，表明小鼠脏器的病变程度随着感染剂量的增加而加重。2.2不同浓度弗氏柠檬酸杆菌感染对小鼠存活率的影响（见图3）由图3可知，统计48 h内小鼠存活率，对照组及1/2倍剂量组小鼠48 h内未出现死亡情况，存活率为100%；1倍剂量组小鼠在48 h内死亡3只小鼠，存活率为50%；2倍剂量组小鼠于48 h内全数死亡；4倍剂量组小鼠于24 h内全数死亡。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.012.F003图3不同浓度弗氏柠檬酸杆菌感染对小鼠存活率的影响2.3不同精油对感染弗氏柠檬酸杆菌小鼠存活率的影响（见图4）弗氏柠檬酸杆菌加入机体后在小鼠肝脏弗氏柠檬酸杆菌对小鼠具有强致病性，能导致小鼠在12 h内出现死亡现象。由图4可知，对照组小鼠在试验期间未出现死亡现象，存活率为100%；模型组小鼠出现半数死亡，存活率为50%；牛至精油组小鼠在12、24、36 h出现死亡，存活率为60%；肉桂精油及复合精油组小鼠在12、24 h出现死亡（图4紫色线和橙色线重叠），存活率为75%，与模型组相比，小鼠存活率提高25%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.012.F004图4不同精油对感染弗氏柠檬酸杆菌小鼠存活率的影响2.4不同精油对小鼠脏器载菌量的影响（见图5）肝脏和脾脏是弗氏柠檬酸杆菌攻击的主要靶器官。由图5可知，对照组小鼠肝脏及脾脏未检测到细菌定植。与对照组相比，模型组小鼠脏器载菌量显著升高（P0.05）。与模型组相比，牛至精油组小鼠肝脏载菌量显著降低（P0.05），脾脏载菌量相对降低但未到达显著水平（P0.05）；肉桂精油组及复合精油组小鼠肝脏和脾脏的载菌量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.012.F005图5不同精油预防对小鼠脏器载菌量的影响注：不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下图同。2.5不同精油对小鼠空肠组织炎症细胞因子的含量的影响（见图6）弗氏柠檬酸杆菌进入机体后刺激免疫系统。由图6可知，模型组小鼠空肠促炎细胞因子IL-12、TNF-α、IL-1β及IL-6的含量显著高于对照组（P0.05），抑炎细胞因子IL-10含量显著低于对照组（P0.05）。与模型组相比，牛至精油组小鼠空肠IL-12的含量显著降低（P0.05）。与模型组相比，肉桂精油组小鼠空肠IL-12、IL-1β及IL-6的含量显著降低（P0.05），IL-10的含量显著升高（P0.05）；与牛至精油组相比，肉桂精油组小鼠空肠IL-6含量显著降低（P0.05）。与模型组相比，复合精油组小鼠空肠促炎细胞因子含量均显著降低（P0.05），抑炎因子含量显著升高（P0.05）。图6不同精油对小鼠空肠组织炎症细胞因子的含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.012.F6a1（a）IL-12、TNF-α及IL-1010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.012.F6a2（b）IL-1β、IL-62.6不同精油对小鼠肠道病变的影响（见图7）由图7可知，腹腔注射后弗氏柠檬酸杆菌首先定殖于小鼠肠道，观察小鼠空肠病变发现，对照组小鼠空肠组织形态结构完整，肠绒毛排列整齐，肠上皮细胞未出现明显脱落现象；模型组小鼠空肠被弗氏柠檬酸杆菌破坏，出现肠绒毛脱落及肠壁变薄的现象；牛至精油组小鼠空肠结构较为完整，少数肠绒毛顶端出现破碎现象；肉桂精油组小鼠空肠结构完整，无明显炎性细胞浸润现象；复合精油组小鼠空肠肠绒毛排列整齐，绒毛长度与模型组相比明显增加。图7不同精油对小鼠肠道病变的影响（100×）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.012.F7a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.012.F7a23讨论3.1弗氏柠檬酸杆菌对小鼠的致病性分析弗氏柠檬酸杆菌能感染禽类、两栖类、哺乳类动物等多种动物，从不同动物身上分离的弗氏柠檬酸杆菌对小鼠菌均表现致病性。腹腔注射4.5×109 CFU/mL的竹鼠源弗氏柠檬酸杆菌感染小鼠，48 h后小鼠表现为眼睛流泪，分泌物增多，腹泻后死亡[10]。从患病天鹅分离的弗氏柠檬酸杆菌腹腔注射感染小鼠后，小鼠出现精神沉郁、畏寒腹泻等临床症状，死亡小鼠肠道出现重度水肿，肝脏等器官出现充血[11]。鳟鱼体内分离弗氏柠檬酸杆菌感染小鼠后，小鼠出现与患病鱼相似腹腔膨大的临床症状，表现为肠道水肿、肝脏出血肿大、腹腔积液等症状，48 h后陆续出现死亡[12]。本研究中，弗氏柠檬酸杆菌感染后小鼠出现畏寒抱团、眼睑红肿及眼球充血的临床症状，死亡小鼠的肝脏及脾脏出现出血肿大的症状，且随着感染剂量增加而加重，与前人报道大部分结果一致，但尚未观察到小鼠肠道肿胀的现象。3.2精油对感染弗氏柠檬酸杆菌小鼠存活率及脏器载菌量的影响弗氏柠檬酸杆菌对四环素类、氯霉素类、青霉素类等抗生素的耐药性导致常规的抗生素治疗对弗氏柠檬酸杆菌感染表现疗效不佳，需要寻找新的治疗药物防治弗氏柠檬酸杆菌的感染。研究发现，静脉注射细菌脂多糖成分建立小鼠脓毒血症模型，100 mg/kg剂量的当归精油在感染前后2h给药能显著提高小鼠的存活率[13]。研究发现，通过鼻腔吸入茶树精油能保护小鼠免受细菌感染的侵害，表现为肺脏的指数、载菌量降低，病理变化减轻[14]。本研究中，小鼠通过口服精油给药，连续7 d，给药期间小鼠体重稳步上升，弗氏柠檬酸杆菌感染后，牛至精油、肉桂精油及复合精油预防组小鼠未出现明显的临床症状，表现为活泼好动，积极进食。小鼠存活率及脏器载菌量结果表明，精油预防能够提高小鼠的存活率，降低小鼠脏器载菌量，帮助小鼠抵抗弗氏柠檬酸杆菌感染带来的机体损伤。3.3精油对感染弗氏柠檬酸杆菌小鼠炎症细胞因子含量及肠道病理变化的影响弗氏柠檬酸杆菌为革兰氏阴性菌，进入机体后细菌中的脂多糖能够引起小鼠的免疫反应，导致机体炎症细胞因子水平升高，过度的炎症反应会引起机体免疫功能失调，导致小鼠死亡。研究发现，迷迭香精油能够降低肺炎模型中小鼠血清中炎症细胞因子IL-6、TNF-α的表达水平，减轻肺脏中炎症细胞的浸润，减少炎症细胞的数量[15]。精油对小鼠细菌性疾病表现抗炎、抗氧化的预防作用，可通过降低小鼠体内氧化应激和炎症反应的水平，增加肠道紧密连接屏障，减轻小鼠的临床症状。本研究发现，精油能够降低弗氏柠檬酸杆菌感染后小鼠体内促炎细胞因子的含量，减轻小鼠体内的炎症反应，推测精油进入小鼠体内后在肠道吸收转化，可通过增加肠绒毛数量和肠壁厚度，维护肠道健康屏障，从而抑制革兰氏阴性菌感染后体内过度的炎症反应，提高弗氏柠檬酸杆菌感染后小鼠的存活率。4结论本研究中，小鼠感染弗氏柠檬酸杆菌后，表现畏寒抱团、眼睑红肿及眼球充血的临床症状，死亡小鼠的肝脏及脾脏出现出血肿大的症状，且随着感染剂量提高而加重。牛至精油、肉桂精油及复合精油对感染弗氏柠檬酸杆菌小鼠表现良好的预防效果，通过提高肠道屏障功能阻止弗氏柠檬酸杆菌在小鼠靶器官的定植，抑制弗氏柠檬酸杆菌在小鼠体内引起的炎症反应，从而提高感染弗氏柠檬酸杆菌小鼠的存活率，其中肉桂精油及复合精油的效果较好。