嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）广泛存在于水体、土壤和水生动物体内，是常见的人、畜及水生动物共患病致病菌，可引起人类急性胃肠炎，甚至严重败血症[1]。嗜水气单胞菌已成为我国水产养殖中的主要致病菌，感染鱼类引起的暴发性出血病死亡率达65%以上[2]。使用抗菌药是防治嗜水气单胞菌感染的主要手段，但长期使用抗菌药和不规范用药引起的耐药性和药物残留等问题，严重影响抗菌药在水产动物养殖中的使用效果，给公共卫生和食品安全带来隐患。因此，开发高效低毒、安全环保的新型抗菌药是水产养殖业面临的主要问题。中药具有资源丰富、安全、不易产生耐药性、价格低等优点。许多中药对嗜水气单胞菌具有抗菌活性[3]，还可促进营养物质的吸收[4]，提高水生动物免疫力[5]，有望开发成为治疗嗜水气单胞菌感染的新型药物。中药的抗菌活性与其有效成分的提取密切相关，且受菌株来源和毒力的影响[6]。目前，多数研究采用同一种提取方法评价不同中药或中药复方的体外抗菌活性，但试验菌株不同可能造成指导用药时抗菌效果出现偏差。因此，本试验选择大黄、诃子、五倍子、黄连、黄芩5种中药，采用水提法和醇提法制备提取物，比较5种中药水提物、醇提物及组合对3株临床分离的嗜水气单胞菌的抗菌效果，筛选出抗菌效果较好的中药提取物及组合，为开发绿色高效的新型抗菌药提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1药品与试剂大黄、诃子、五倍、黄连和黄芩购自泰州市国泰大药房。环丙沙星标准品购自中国药品生物制品检定所。LB肉汤培养基、M-H琼脂培养基购自温州市康泰生物科技有限公司。二甲基亚砜（DMSO）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。1.1.2试验菌株试验用嗜水气单胞菌A1、A2、A3分别在江苏南通、常州、上海地区由发病鲢鱼、鳖、团头鲂内脏分离鉴定后保存；对照菌株As为As-1.927标准株，购自中国科学院北京微生物研究所。1.2试验方法1.2.1菌悬液制备菌种划线分离培养18 h后，挑取单个菌落接种于LB肉汤培养基，于28 ℃培养18~24 h，采用麦氏比浊法调整菌液浓度约为1×107 CFU/mL。1.2.2中药药液制备中药烘干12 h，粉碎，过40目筛，分别采用水提法和醇提法提取有效成分。水提法[7]：中药粉末加10倍体积的蒸馏水浸泡过夜，武火煎煮至沸腾，改用文火煎煮1 h，4层纱布过滤；药渣再分别加8倍和5倍体积的水进行第2、3次煎煮，过滤，合并3次滤液，抽滤，浓缩至生药质量浓度为1 g/mL的水提物。醇提法[8]：中药粉末与70%乙醇混合（1∶10），于80 ℃回流提取3次，每次1 h，合并提取液，45 ℃水浴旋转蒸发浓缩制成浸膏。使用前使用少量DMSO溶解，制成生药质量浓度为1 g/mL的醇提物。中药提取物采用100 ℃流通蒸汽灭菌30 min，4 ℃保存。1.2.3体外药敏试验采用牛津杯法。取菌悬液0.1 mL，均匀涂布于营养琼脂培养基，待表面干燥后放置灭菌牛津杯，牛津杯中分别加入单味中药水提物或醇提物（相当于0.5 g/mL）0.2 mL。同时以灭菌PBS和环丙沙星溶液（20 mg/L）作为对照，每个处理设3个重复。做好标记，盖上陶瓦盖，于28 ℃培养24 h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径。因中药提取物有颜色，影响抑菌圈的透明度，因此采用灭菌接种环挑取抑菌圈内培养物在普通琼脂培养基上划线，37 ℃培养24 h，确认无细菌生长的才可判定为抑菌圈。根据判定标准判断嗜水气单胞菌对各中药提取物的敏感性。判定标准为：抑菌圈直径≥20 mm，为极度敏感；15 mm≤抑菌圈直径20 mm，为高度敏感；10 mm≤抑菌圈直径15 mm，为中度敏感；抑菌圈直径10 mm，为低度敏感[9]。1.2.4最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）测定采用微量肉汤稀释法测定MIC[10]。96孔板第1~12孔中分别加入肉汤培养基100 μL，第1孔中加入100 μL中药提取物（1 g/mL），混匀后取100 μL加入第2孔，依此类推至第9孔后取100 μL弃掉，使中药提取物终浓度为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 g/L。1~11孔每孔加入菌悬液10 μL。第10孔为环丙沙星（浓度为20 mg/L)对照，第11孔为菌液对照，第12孔为肉汤培养基作空白对照，每个处理设3次重复。于28 ℃培养24 h，测定菌液OD600 nm值。测试孔与空白对照孔OD600 nm值无明显差异定义为无菌生长，以无菌生长孔内药液的最小浓度为MIC。移取48 h后肉眼观察疑似无菌生长孔培养液10 μL接种至固体培养基，28 ℃培养24 h无菌生长对应孔的药物最低浓度即为MBC。1.2.5中药对嗜水气单胞菌生长的影响选择5种中药相对敏感的提取物测定中药对嗜水气单胞菌A1生长曲线的影响。参照朱璐丹等[11]方法，略做调整，将1%嗜水气单胞菌菌悬液分别接种至中药提取物终浓度为MIC、1/2MIC、1/4MIC的LB培养基中，以添加2 mg/L环丙沙星为阴性对照，同时设菌液对照和肉汤空白对照。于28 ℃、180 r/min摇床中培养，每隔2 h 取菌液测OD600 nm值，重复3次，取平均值绘制生长曲线。1.2.6中药联合抑菌试验采用微量肉汤棋盘交叉法[12]。根据单味中药MIC测定结果，选择5味中药的最佳提取物，在同一微孔板每行1~6孔中分别加入2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC的单味中药提取物A 50 μL，每列1~6孔中加入2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC浓度的单味中药提取物B 50 μL，使各浓度单味中药两两组合，每孔再加入稀释好的菌悬液10 μL，进行联合抑菌试验。同时设1/2 MIC单药、肉汤培养基、菌液各100 μL分别作单药对照、空白对照和菌液对照。混匀后于28 ℃培养24 h，测定菌液OD600 nm值。测试孔与空白对照孔OD600 nm值无明显差异的定义为无菌生长孔，判定联合用药时各中药提取物的MIC。联合用药结果以联合抑菌指数（FICI）为判定依据，其中FICI≤0.5为协同作用，0.5FICI≤1.0为相加作用，1.0FICI≤2.0为无关作用，FIC＞2.0为拮抗作用。FICI=联合用药时A药MIC单用A药时MIC+联合用药时B药MIC单用B药时MIC (1)1.3数据统计与分析试验数据使用Excel、SPSS 20软件进行统计分析和作图，组间比较采用独立样本t检验，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.15种中药水提物和醇提物对嗜水气单胞菌的体外抑菌结果（见表1）由表1可知，高度敏感的中药提取物排序为五倍子水提物五倍子醇提物＞大黄醇提物＞诃子水提物＞黄芩醇提物＞黄连水提物；大黄水提物、黄芩水提物、诃子醇提物对嗜水气单胞菌中度敏感；黄连醇提物抑菌圈最小，为8.18 mm，敏感度低。大黄和黄芩醇提物对嗜水气单胞菌的敏感度显著高于其水提物（P0.05），诃子和黄连水提物的敏感度显著高于其醇提物（P0.05）。对照药物环丙沙星对嗜水气单胞菌A1产生的抑菌圈小于标准株及A2、A3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.016.T001表15种中药水提物和醇提物对嗜水气单胞菌的体外抑菌结果项目水提物醇提物A1A2A3平均值AsA1A2A3平均值As大黄10.9412.3412.0211.77±0.73a12.3217.4819.0417.6118.04±0.87A20.11诃子16.5817.0217.6617.09±0.54b14.9612.3610.8812.5711.94±0.92B12.63五倍子21.7418.2119.6519.87±0.79c21.4817.4717.4616.6118.51±1.08c17.85黄连15.2117.6514.3715.74±1.70d17.538.168.358.048.18±0.16D8.04黄芩13.9511.3813.7413.02±1.43e12.7916.5817.0217.6616.75±0.23E17..88环丙沙星18.7226.7825.3723.62±4.3026.8218.7226.7825.3723.62±4.3026.82注：同行数据平均值肩标字母大小不同表示差异显著（P0.05）。mm2.25种中药提取物对3株嗜水气单胞菌的MIC、MBC值（见表2、表3）由表2可知，五倍子水提物和醇提物的MIC最小，为7.81～15.63 g/L，其次是大黄醇提物和诃子水提物，MIC均为15.63~31.25 g/L，黄芩醇提物MIC为31.25 g/L，黄连水提物的MIC为31.25~62.50 g/L，黄连醇提物MIC最大，≥500.00 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.016.T002表25种中药提取物对3株嗜水气单胞菌的MIC值项目水提物醇提物A1A2A3AsA1A2A3As大黄/(g/L)62.5062.5062.5062.5031.2531.2515.6315.63诃子/(g/L)31.2531.2531.2515.63125.00125.0062.5062.50五倍子/(g/L)15.637.8115.637.8115.6315.637.8115.63黄连/(g/L)62.5031.2531.2531.25＞500.00500.00500.00500.00黄芩/(g/L)125.00125.00250.00125.0031.2531.2531.2531.25环丙沙星/(mg/L)20.0010.0010.0010.0020.0010.0010.0010.00由表3可知，五倍子水提物和醇提物MBC最小，为15.63~31.25 g/L；其次是大黄醇提物和诃子水提物，MBC均为31.25~62.50 g/L；黄芩醇提物的MBC为62.50 g/L；诃子醇提物MBC均为31.25~62.50 g/L，黄连水提物的MBC为62.50~125.00 g/L，低于黄芩水提物的MBC；黄连醇提物未显示杀菌作用。所有中药提取物的MIC和MBC均明显高于环丙沙星。环丙沙星对嗜水气单胞菌A1的MIC高于标准株及菌株A2、A3。大黄和黄芩醇提物的MIC和MBC均小于其水提物，诃子和黄连水提物的MIC和MBC均小于其醇提物，五倍子水提物MIC和MBC与醇提物相当。研究表明，大黄和黄芩醇提物的抗菌活性优于其水提物，诃子和黄连水提物的抗菌活性优于其醇提物，五倍子水提物与醇提物抗菌活性相当，综合抑菌圈结果，选择大黄、黄芩醇提物醇提物、诃子、黄连、五倍子水提物进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.016.T003表35种中药提取物对嗜水气单胞菌的MBC值项目水提物醇提物A1A2A3AsA1A2A3As大黄/(g/L)125.00125.00125.00125.0062.5062.5031.2531.25诃子/(g/L)62.5062.5062.5031.25250.00250.00125.00125.00五倍子/(g/L)31.2515.6331.2515.6331.2531.2515.6331.25黄连/(g/L)125.0062.5062.5062.50＞500.00＞500.00＞500.00＞500.00黄芩/(g/L)250.00250.00250.00250.0062.5062.5062.5062.50环丙沙星/(mg/L)20.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.002.3不同浓度中药提取物对嗜水气单胞菌生长的影响（见图1~图5）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.016.F001图1不同浓度大黄醇提物对嗜水气单胞菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.016.F002图2不同浓度诃子水提物对嗜水气单胞菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.016.F003图3不同浓度五倍子水提物对嗜水气单胞菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.016.F004图4不同浓度黄连水提物对嗜水气单胞菌生长的影响由图1~图5可知，5种中药提取物浓度为MIC时，18 h内细菌生长曲线平缓，与环丙沙星的抑制曲线基本平行，总菌量基本无增加；5种中药提取物在低于MIC浓度下细菌生长被抑制，总菌量始终低于菌液对照组，中药提取物浓度越高，细菌生长抑制作用越明显。研究表明，5种中药提取物均可抑制嗜水气单胞菌生长，抑菌作用在一定范围内呈浓度依赖关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.016.F005图5不同浓度黄芩醇提物对嗜水气单胞菌生长的影响2.4中药两两组合联合抑菌试验结果（见表4）由表4可知，诃子水提物+五倍子水提物的FICI最小（0.42），其次是五倍子水提物+黄连水提物的FICI（0.46），均为协同作用；大黄醇提物+诃子水提物、大黄醇提物+五倍子水提物、大黄醇提物+黄连水提物、五倍子水提物+黄芩醇提物均表现为协同作用；黄连水提物+黄芩醇提物表现为相加作用；大黄醇提物+黄芩醇提物、诃子水提物+黄连水提物表现为无关作用；诃子水提物+黄芩醇提物表现为拮抗作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.016.T004表4中药两两组合联合抑菌试验结果项目FICI平均FICI联用结果FICI联用结果A1A2A3As大黄醇提物+诃子水提物0.500.500.500.50协同0.50协同大黄醇提物+五倍子水提物0.500.500.500.50协同0.50协同大黄醇提物+黄连水提物0.500.500.500.50协同0.50协同大黄醇提物+黄芩醇提物1.501.251.251.33无关1.25无关诃子水提物+五倍子水提物0.500.380.380.42协同0.38协同诃子水提物+黄连水提物2.002.002.002.00无关2.00无关诃子水提物+黄芩醇提物3.002.003.002.67拮抗3.00拮抗五倍子水提物+黄连水提物0.500.380.500.46协同0.38协同五倍子水提物+黄芩醇提物0.500.500.500.50协同0.50协同黄连水提物+黄芩醇提物1.000.751.000.92相加1.00相加3讨论3.1不同提取方法、菌株来源对中药抑菌作用的影响中药抗菌活性的发挥与其活性成分的提取密切相关。本试验发现，大黄、诃子、黄连和黄芩的水提物与醇提物对嗜水气单胞菌的抑菌圈大小存在明显差异，对同一菌株的MIC、MBC也不同；其中大黄和黄芩醇提物对嗜水气单胞菌抑制作用较其水提物更强，诃子和黄连水提物较醇提物抑菌效果更好，五倍子水提物与醇提物抑菌效果相近。韦盘秋等[13]比较了8种中药醇提物与水提物对嗜水气单胞菌等的抑制作用，表明黄芩醇提物较水提物抑菌效果好。晋鹏飞等[14]发现，嗜水气单胞菌对五倍子、大黄、诃子等不同溶剂提取物敏感度不同。因此，提取方法是影响和评价中药抗菌活性的重要因素，应选择适合的提取方法最大程度地发挥中药的抑菌效果。本试验中同一种中药及环丙沙星对3株不同来源的嗜水气单胞菌的抑菌圈直径、MIC、MBC不尽相同。陶健等[15]也发现，黄芩对3种嗜水气单胞菌抑制作用强，对其中一个菌株抑制作用弱。因此，菌株来源不同，对同一中药的敏感性可能不同，推荐临床用药时应考虑不同地域内菌株对中药敏感性的差异。3.25种中药提取物对3株嗜水气单胞菌的MIC、MBC的影响嗜水气单胞菌是水生动物最常见的致病菌，筛选抑制该菌的中药成为研究热点。肖辉等[16]比较了16种中药水提物对嗜水气单胞菌的抑制作用，发现五倍子、黄连、诃子、大黄的水提物抑菌效果最好，MIC分别为7.81、15.63、31.25、62.50 g/L。夏与晴等[17]测得黄连水提物对嗜水气单胞菌的MIC为31.25 g/L。王洪彬等[18]发现，诃子水提物对舌鳎源嗜水气单胞菌的MIC为31.25 g/L，与本试验中药水提物的结果一致。但陶健等[15]发现黄芩、诃子水提物对嗜水气单胞菌的抑菌效果最好，MIC分别为57、114 g/L，大黄、五倍子的抑菌效果差，MIC均为227 g/L；陶莎等[19]测得黄连水提物的MIC为7.81 g/L，与本试验结果不同。本试验中部分中药醇提物的抑菌效果与卢春霞等[2]的研究结果相似，但MIC也存在较大差异，可能是提取处理、菌株来源、试验方法、中药产地、采收部位、炮制方法等不同。3.3中药两两组合联合抑菌试验结果分析本试验表明，5种中药提取物对嗜水气单胞菌均有抗菌活性，但抑菌效果不同。生产实践中将两种或两种以上的药物配伍，可产生协同作用，增强抗菌效果。本试验结果发现，单味中药在MIC浓度下可完全嗜水气单胞菌生长，在亚抑菌浓度（1/2MIC）下只能减缓细菌生长速度，不能完全抑制细菌生长。五倍子与诃子、大黄、黄连、黄芩等两两组合后的MIC较单用时降低，即两药联用具有协同增效作用。其中以五倍子水提物与诃子水提物组合效果最佳，其次是五倍子水提物+黄连水提物、五倍子水提物+大黄醇提物，均产生协同作用，诃子水提物与黄连水提物组合产生无关作用。苏振霞等[20]研究发现，以五倍子水提物为主药，分别与诃子、黄连、大黄水提物组合，对嗜水气单胞菌的抑菌效果由强到弱排序为五倍子＋诃子五倍子＋黄连五倍子＋大黄。陶莎等[19]研究发现，诃子与黄连水提物组合对嗜水气单胞菌表现为无关作用，与本试验结果基本一致。中药联用产生协同增效的原因可能是不同中药提取物在混合溶解过程中各组分间发生物理或化学反应，提高了有效成分的溶出率，甚至产生新的成分和作用；或是不同组分抗菌作用靶点不同，联用后多位点、多途径发挥抗菌作用，从而增强抗菌活性。部分中药组合后产生无关或拮抗作用，可能使有效成分在配伍组合中相互结合、吸附等物理作用而降低有效成分的浓度，或者破坏原有化学结构而失去抗菌活性[21]。因此，5种中药复方的最佳组合、组成比例、作用组分及作用机理还需进一步研究。4结论大黄、黄芩的醇提物较水提物的抗嗜水气单胞菌活性更强，诃子、五倍子、黄连水提物较醇提物抗菌活性更强；五倍子水提物与大黄醇提物、诃子水提物、黄连水提物、黄芩醇提物两两组合及大黄醇提物分别与诃子水提物、黄连水提物组合抗菌活性增强；黄连水提物与黄芩醇提物组合也可增强抗菌活性。