静脉滴注是临床治疗中常用的给药方式，输液器是不可缺少的耗材，一次性输液器与药物直接接触，由输液器本身带来的安全性问题成为研究热点[1]。聚氯乙烯型(PVC)为临床上常见输液器类型，增塑剂邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)在药物中溶出较为突出，DEHP具有生殖毒性、肝毒性及致突变性[2]。此外，PVC输液器，对脂溶性药物亦有较强的吸附作用，对药物的有效性产生影响[3]。鉴于PVC输液器存在潜在的安全性隐患，欧盟与美国都有相关限制性使用的规定，我国亦批准新型输液器在临床治疗中使用，如热塑性聚氨酯类(TPU)、热塑性聚酯弹性体(TPEE)及热塑性聚烯烃(TPO)等材料类型。TPU主要由低聚二醇与异氰酸酯类成分合成的高分子材料，具有优异的耐磨性能、软触感、耐腐蚀性，并具有良好的韧性和弹性以及良好的生物相容性，作为PVC输液器的替代品，在医疗机构有较多应用[4]。同时，TPU输液器在临床应用中潜在的安全性问题也应引起了关注[5-6]。毒理研究表明，聚合过程中残留的异氰酸酯类成分可对人体的呼吸系统、免疫系统、内分泌系统、皮肤等造成损害，可诱导大鼠骨髓染色体畸变[7]。本实验参照有关注射剂相容性研究技术要求，以银杏二萜内酯葡胺注射液(GDLI)为载体，模拟其临床使用情况，建立7种异氰酸酯类成分与2种抗氧剂的提取与溶出的检查方法，为相关相容性研究提供借鉴。1实验部分1.1主要原料热塑性聚氨酯类(TPU)输液器，批号220301、220603、220805，北京伏尔特技术有限公司；0.9%氯化钠注射液，250 mL/袋，江苏亚邦生缘药业有限公司；银杏二萜内酯葡胺注射液(GDLI)，批号220601、220801、220901，5 mL/支，江苏康缘药业股份有限公司；乙腈、二氯甲烷、三乙胺、85%磷酸，HPLC级，TEDIA公司；9-N-甲氨甲基蒽，纯度98.0%，德国Sigma-Aldrich公司；N,N-二甲基乙酸胺，HPLC级，北京百灵威科技有限公司；苯基异氰酸酯(PI)、环己基异氰酸酯(CI)、六亚甲基二异氰酸酯(HMDI)、甲苯-2,6-二异氰酸酯(2,6-TDI)，纯度≥99.0%，德国Sigma-Aldrich公司；甲苯-2,4-二异氰酸酯(2,4-TDI)，纯度≥99.0%、二苯基甲烷-4,4’-二异氰酸酯(4,4’-MDI)，纯度98.7%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；四［3-（3,5二叔丁基-4-羟苯基）丙酸］季戊四醇酯(1010)，纯度95.0%、3-（3,5二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸正十八碳醇酯(1076)，纯度99.0%、1,5-萘二异氰酸酯(1,5-TDI)，纯度98.0，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。1.2仪器与设备高效液相色谱仪(HPLC)，FLD检测器，Agilent 1200，美国Agilent公司；纯水机，Milli-Q Academic，美国Millipore公司。1.37种异氰酸酯类成分测定方法的建立1.3.1色谱条件色谱柱为Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温40 ℃；流动相A为乙腈；流动相B为3%三乙胺溶液（用磷酸调节pH值为3.0）。梯度洗脱0~25 min，A为60%；25~40 min，A为60%~80%；40~50 min，A为80%；50~55 min，A为80%~60%；55~60 min，A为60%；流速为1 mL/min；激发波长为254 nm，发射波长为412 nm。1.3.2混合对照品溶液的制备分别称取PI、CI、HMDI、2,6-TDI、2,4-TDI、4,4’-MDI、1,5-TDI对照品适量，置于25 mL量瓶中，加二氯甲烷溶解，并稀释至刻度，制成质量浓度分别为0.413、0.474、0.509、0.506、0.497、0.474、0.486 g/L的标准储备液。精密移取标准储备液适量，用二氯甲烷配制成4~100 ng/mL系列浓度的对照品溶液。精密移取各浓度对照品溶液1 mL于6个20 mL顶空瓶中，再分别加入10 mL二氯甲烷和1 mL衍生试。（称取9-N-甲氨甲基蒽130 mg，用二氯甲烷溶解并转移至50 mL量瓶中，定容，避光保存。）20 ℃下，密封，避光反应30 min，氮气浓缩至干，再加入10 mL衍生物溶剂（量取N,N-二甲基甲酰胺50 mL于100 mL量瓶，加乙腈40 mL，用水定容），溶解，离心，取上清液，得到混合对照品溶液。1.3.3供试品溶液的制备取输液器碎段（长度小于0.2 cm）约1 g，精密称定，置50 mL锥形中，加入10 mL二氯甲烷和1 mL衍生试剂，密封，避光，振荡12 h，提取液转移至20 mL玻璃瓶中，密封，-20 ℃下保存。剩余样品残渣重复提取衍生12 h，合并提取液，氮气浓缩至干，加入10 mL衍生物溶剂，溶解，离心，取上清液，得到供试品溶液。1.4抗氧剂1010与1076测定方法的建立1.4.1色谱条件色谱柱为Kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流动相甲醇-水(90∶10)；流速为1.0 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为247 nm。1.4.2混合对照品溶液的制备分别取四［3-（3,5二叔丁基-4-羟苯基）丙酸］季戊四醇酯(1010)和3-（3,5二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸正十八碳醇酯(1076)对照品适量，精密称定，加乙腈制成质量浓度分别为4.75 μg/mL、4.86 μg/mL的对照品溶液，4 ℃冰箱保存。1.4.3供试品溶液的制备取输液器碎段（长度小于0.2 cm）约7 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取配伍药液（取250 mL氯化钠注射液1袋，加入GDLI注射液1支，混匀）50 mL，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）60 min，取出，放冷，滤过，滤液加乙酸乙酯萃取3次，每次40 mL，合并乙酸乙酯液，挥干溶剂，残渣加乙腈溶解并转移至1 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。2结果与讨论2.1流动相的选择异氰酸酯化学性质较为活泼，与水生成尿类化合物，因此采用9-N-甲氨甲基蒽衍生后测定的技术路线[8-10]，在此基础上应用RP-HPLC荧光检测器检测[11]。流动相采用乙腈-三乙胺系统，可以有效抑制衍生物在ODS色谱柱上的拖尾现象，验证试验表明，该法适用于异氰酸酯类成分的测定。抗氧剂1010和1076在甲醇-水系统中，色谱峰峰形良好，分离完整。2.2溶出介质的选择由于异氰酸酯与质子性溶剂（含有活泼氢）会产生化学反应，采用注射剂作为溶出介质已不适用，参照相容性研究技术要求[8]，改用二氯甲烷振荡提取24 h，并同时进行衍生化反应，测定可提取物[12-14]。抗氧剂的溶出试验，依据相关技术要求，采用GDLI注射液作为溶出介质，考察TPU输液器的浸出情况[15-17]。2.37种异氰酸酯类成分测定方法的验证2.3.1衍生化时间的选择7种异氰酸酯类成分在20 ℃下，避光，在二氯甲烷中与9-N-甲氨甲基蒽进行衍生化反应，每间隔10 min测一次峰面积，表1为测试结果。从表1可以看出，反应30 min时，各成分达到平衡。随着时间的推移，峰面积基本保持稳定。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.T001表1异氰酸酯类成分衍生化反应时间的考察Tab.1Investigation of derivatization reaction time for isocyanates时间/min峰面积PICIHMDI2,6-TDI1,5-TDI2,4-TDI4,4'-MDI1021240661697555765311166061328913079942850916720236787362547873611373641243701323667883753817564973533024253776279542611541513929220493450045793330379382056402425338027954242154151692922045445003909333123938201250242529622795383815414830292203904500379933300593819582.3.2专属性实验图1为阴性样品、混合对照品及TPU输液器样品的HPLC色谱图。从图1可以看出，与阴性样品对比，7个分析物对应的位置无干扰，该法专属性良好。图1阴性样品、混合对照品及TPU输液器样品的HPLC谱图Fig.1HPLC chromatograms for negative sample, mixed reference standards and TPU infusion devices samples注：10-PI；14-CI；16-HMDI；17-(2,6-TDI)；18-(1,5-TDI)；19-(2,4-TDI)；21-(4,4'-MDI)10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.F1a1（a）阴性样品10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.F1a2（b）混合对照品10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.F1a3（c）供试品2.3.3线性实验、检测限、定量限、精密度、溶液稳定性和回收率以质量浓度为横坐标，待测成分的峰面积为纵坐标，计算回归方程，测定PI、CI、HMDI、2,6-TDI、1,5-TDI、2,4-TDI、4,4’-MDI线性关系，表2为7种异氰酸酯的线性关系、定量限、检出限及精密度。从表2可以看出，在实验范围内各成分呈现良好线性关系。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.T002表27种异氰酸酯的线性关系、定量限、检出限及精密度（n=6）Tab.2Linear regression, LOQ, LOD and precision of the seven isocyanate compounds（n=6）成分回归方程线性范围/（ng·mL-1）rLOQ/（ng·mL-1）LOD/（ng·mL-1）RSD/%低中高PIy=293642x+9249064.1~78.50.99980.0150.0053.41.700.98CIy=306018x+1622514.8~90.20.99990.0150.0052.40.800.41HMDIy=158195x-218795.1~96.80.99990.0500.0153.71.200.682,6-TDIy=298433x+2051355.1~96.20.99980.0150.0052.41.700.951,5-TDIy=46947x+383725.0~94.50.99960.0500.0155.72.000.982,4-TDIy=101519x+1722754.7~90.00.99980.0500.0155.80.950.794,4'-MDIy=100651x+8964.54.9~92.30.99990.0500.0155.72.400.79以信噪比(S/N)约为3时相应的试样浓度为检测限(LOD)，以信噪比约为10时相应的试样浓度为定量限(LOQ)。LOD在0.005~0.015 ng/mL之间，LOQ在0.015~0.050 ng/mL之间。取线性试验低、中、高不同浓度的混合对照品溶液连续进样6次，测定峰面积，计算7个成分RSD。RSD在0.41%~5.80%之间，符合2020年版《中国药典》中不超过10%的要求，表明进样精密度符合要求。取对照品溶液分别于0、4、8、12、16、24 h进样，测定峰面积，计算7个成分RSD，结果在1.9%~3.8%之间，表明对照品溶液在24 h内稳定性较好。由于样品中未检出待测成分，回收率是通过在供试品(输液器批号：220301)中加入待测成分限度的50%、100%、150%三个水平，按“1.3.3供试品溶液的制备”方法，分别平行制备3份，测定并计算回收率及其RSD，以验证方法的准确度。当待测成分含量较低（10-9级）时，依据《药品质量标准分析方法验证指导原则》要求，回收率应在70%~125%之间，RSD应不大于15%。表3为7种异氰酸酯的回收率结果。从表3可以看出，供试品中PI、CI、HMDI、2,6-TDI、1,5-TDI、2,4-TDI、4,4’-MDI的测定准确度符合要求。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.T003表37种异氰酸酯的回收率试验结果（n=9）Tab.3The recovery results of seven isocyanate compounds（n=9）化合物加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%123123PI9.0867.0236.9577.46677.376.682.284.36.616.5213.49013.64015.19081.782.691.928.9125.78026.00025.35089.289.987.7CI10.448.2997.9648.26379.576.379.178.63.718.9814.17014.23015.50074.775.081.733.2225.94026.49027.59078.179.783.1HMDI11.219.4529.3809.61184.383.785.786.44.020.3816.64016.93018.66081.683.191.635.6631.64032.09031.60088.790.088.62,6-TDI11.1410.14010.01010.5091.089.994.392.53.120.2618.21018.41020.05089.990.999.035.4632.92033.08032.27092.893.391.01,5-TDI10.9413.04012.76012.780119.2116.6116.8106.98.419.8919.90019.54022.220100.198.2111.734.8035.54034.60033.990102.199.497.72,4-TDI10.427.5667.0047.39272.667.270.978.08.618.9414.50015.08016.57076.679.687.533.1428.29027.97027.02084.383.380.44,4'-MDI10.698.7948.5989.31382.380.487.187.24.919.4416.62016.81018.45085.586.594.934.0230.43030.63030.14089.490.088.62.4抗氧剂1010与1076测定方法的验证2.4.1专属性实验图2为阴性样品、混合对照品及供试样品的HPLC谱图。从图2可以看出，与阴性样品相比较，混合对照品及供试样品中2个目标成分在对应的位置无干扰，表明该法专属性良好。图2阴性样品、混合对照品及供试样品的HPLC谱图Fig.2HPLC chromatograms for negative sample, mixed reference standards solution and TPU infusion devices sample注：2-抗氧剂1010；8-抗氧剂107610.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.F2a1（b）混合对照品10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.F2a2（c）供试品10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.F003（a）阴性样品2.4.2线性实验、检测限、定量限、精密度、溶液稳定性和回收率以质量浓度为横坐标，待测成分的峰面积为纵坐标，计算回归方程。抗氧剂1010在0.152 0~118.600 0 μg/mL范围内，回归方程y=0.300 8x-0.149 5，r=1；抗氧剂1076在0.392 0~122.600 0 μg/mL范围内，回归方程y=0.547 5x-0.169 8，r=1，均呈现良好的线性关系。以信噪比为3时相应的试样浓度为检测限(LOD)，以信噪比比为10时相应的试样浓度为定量限(LOQ)。抗氧剂1010和1076的LOD和LOQ分别为0.456 ng/mL、1.570 ng/mL和1.520 ng/mL、3.920 ng/mL。取线性实验低、中、高不同浓度的混合对照品溶液连续进样6次，测定峰面积，计算抗氧剂1010和1076峰面积的RSD，抗氧剂1010的RSD分别为6.10%、0.18%和0.03%，抗氧剂1076的RSD分别为6.30%、0.83%和0.09%，符合2020年版《中国药典》中不超过10%的要求。取对照品溶液，分别于0、4、8、12、16、24 h进样，测定峰面积，计算抗氧剂1010和1076的RSD，结果分别为0.28%和0.89%，表明对照品溶液在24 h内稳定性良好。取TPU材质输液器（批号：220301）的样品约3.5 g，精密称定，平行称取9份，3份一组，置于具塞锥形瓶中，分别加入对照品（1010、1076质量浓度分别为25.40 μg/mL、33.06 μg/mL）0.3、0.6、0.9 mL，按“1.4.3供试品溶液的制备”法制备样品，测定并计算回收率。依据要求，回收率应在75%~120%之间。表4为抗氧剂的回收率试验结果。从表4可以看出，9组供试品测得的1010、1076平均回收率分别为92.0%与101.0%，表明方法准确度较好。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.T004表4抗氧剂的回收率试验结果（n=9）Tab.4The recovery results of antioxidant1010 and 1076 （n=9）成分样品含量/μg加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%12312312310100.6200.6190.6207.6217.9287.7897.57695.994.191.32.10.6200.6200.61915.2414.41014.42014.35090.490.690.192.00.6190.6200.62022.8621.63021.81021.34091.992.790.61076———9.91910.45010.2909.949105.3103.8100.32.1———19.8419.72019.82019.74099.499.999.5101.0———29.7629.89030.15029.420100.4101.398.9注：“—”表示提取液中目标物浓度低于检测限。2.5方法的灵敏度评价判断评价方法的灵敏度是否符合要求，依据《化学药品与弹性体密封件相容性研究技术指导原则(试行)》规定，通过每日允许暴露量(PDE)或安全性阈值(SCT)，并结合药品的每日最大剂量分析评价阈值(AET)。表5为异氰酸酯与抗氧剂的分析评价阈值。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.T005表5异氰酸酯与抗氧剂的分析评价阈值Tab.5Analytical evaluation threshold of isocyanates and antioxidants成分LOD/（ng·mL-1）LOQ/（ng·mL-1）SCT/（μg·d-1）AET/（ng·mL-1）PI0.0050.0151.52.75CI0.0050.0151.52.75HMDI0.0150.0501.52.752,6-TDI0.0050.0151.52.751,5-TDI0.0150.0501.52.752,4-TDI0.0150.0501.52.754,4'-MDI0.0150.0501.52.75抗氧剂10100.0051.5201.5192.50抗氧剂10760.0053.9201.5192.50从表5可以看出，依据SCT值(1.5 μg/d)，计算得到异氰酸酯类成分的AET值为2.75 ng/mL，抗氧剂1010与1076的AET值为192.50 ng/mL。结果显示，异氰酸酯类成分与抗氧剂的检测限与定量限远低于AET值，表明方法的灵敏度达到了检测要求。2.6提取与溶出结果分析依据《化学药品与弹性体密封件相容性研究技术指导原则（试行）》[8]要求，分别对TPU输液器中可能残留的7种异氰酸酯类成分的残留情况及抗氧剂在GDLI注射液中的溶出情况进行测定。按照1.3.3供试品溶液的制备，采用二氯甲烷振荡提取[18]，并采用9-N-甲氨甲基蒽进行衍生的方法进行提取与保存。表6为PU输液器中异氰酸酯的提取结果。从表6可以看出，3批TPU输液器均未检出异氰酸酯类成分。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.T006表6TPU输液器中异氰酸酯的提取结果Tab.6Extraction results of isocyanate components成分测定量样品220301样品220603样品220805PI0.0050.0050.005CI0.0050.0050.005HMDI0.0150.0150.0152,6-TDI0.0050.0050.0051,5-TDI0.0150.0150.0152,4-TDI0.0150.0150.0154,4'-MDI0.0150.0150.015ng·mL-1ng·mL-1取输液器（批号：220301、220603、220805）碎段（长度小于0.2 cm）约7 g，按“1.4.3供试品溶液的制备”方法制备样品。表7为抗氧剂溶出实验结果。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.10.020.T007表7TPU输液器中抗氧剂的溶出实验结果Tab.7Dissolution of antioxidant 1010 and 1076 in TPU infusion device批号成分测定量GDLI 220601GDLI 220801GDLI 22090122030110100.180.170.181076———22060310100.150.150.161076———22080510100.110.120.131076———注：“—”表示提取液中目标物浓度低于检测限。μg·g-1（μg·g-13结论以银杏二萜内酯葡胺注射液(GDLI)为载体，建立了TPU输液器中可提取物异氰酸酯类成分和溶出物抗氧剂的检查方法和验证实验，得出方法的专属性、准确性和精密度符合2020年版《中国药典》的技术要求。通过SCT和AET值的比较，方法的灵敏度符合要求。实验为TPU输液器与注射液的相容性实验研究提供可借鉴的方法，但由于不同厂家的输液器的工艺和起始物料与添加物的不同以及各品种注射液成分的差异，相容性实验中目标成分的检查仍需要不断探索。