真菌多糖是一种由各种中性糖或糖醛酸通过糖苷键复杂聚合而成的碳水化合物长链[1]，营养价值和药用价值极高[2-4]。近年来，随着我国畜牧养殖业发展和养殖集约化程度提高，健康养殖、畜产品质量安全愈发受到消费者重视。因此，绿色环保、安全性高的真菌多糖作为一种新型饲料添加剂，在促进畜禽生长、提高免疫能力等方面备受关注[5-7]。裂褶菌胞外多糖（SPG）是裂褶菌最主要的活性成分之一，是一种主链为1-3连接、侧链为1-6糖苷键的葡聚糖[8]，具有提高机体细胞免疫功能[9]、抗免疫器官萎缩、提高小鼠体内超氧化物歧化酶（SOD）活性等功能[10]，具有广阔的应用前景。但由于裂褶菌存在生产周期较长、生物转化率较低、产量及品质不稳定等问题，导致裂褶菌的活性产物的开发利用受到限制。与人工栽培、固体发酵相比，SPG的深层发酵周期短，多糖产量高且提取简便[11]。本试验以提取自发酵液的裂褶菌胞外多糖产量为参数，对培养基成分进行优化，并进一步探究裂褶菌胞外多糖的生物活性，旨在为裂褶菌胞外多糖作为饲料添加剂在畜禽养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1菌种裂褶菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均由中国农业大学烟台研究院微生物实验室分离保藏。1.1.2主要试剂马铃薯浸粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、蛋白胨、牛肉膏、麦芽浸粉；大豆蛋白胨、油酸、L-谷氨酸、NAA、3-吲哚丁酸；海藻酸钠；聚乙二醇（200）；丙三醇、乙酸钾、碳酸钾、硫酸铵。羟基自由基清除试剂盒、DPPH自由基清除试剂盒、多糖含量测定试剂盒均购自苏州格锐思生物科技有限公司。1.1.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂（PDA培养基）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL，pH值自然。基础发酵培养基：葡萄糖20 g、酵母膏6 g、维生素B1 0.001 g、KH2OP4 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、蒸馏水1 000 mL，pH值6.0。种子培养基：马铃薯浸粉8 g、蛋白胨2 g、葡萄糖20 g、牛肉膏2 g、酵母膏2 g、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO4 2 g、水1 000 mL，pH值6.0。1.1.4仪器设备高压蒸汽灭菌锅（SHENAN公司），恒温培养箱、恒温摇床（苏州培英实验设备有限公司），冷冻干燥机（北京德天佑科技发展有限公司），冷冻离心机（湘仪集团），恒温干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），均质机（江苏天翎仪器有限公司），分光光度计（Thermk Fisher Scientific），酶标仪（赛默飞公司）。1.2试验方法1.2.1裂褶菌胞外多糖发酵培养基优化1.2.1.1裂褶菌胞外多糖发酵及提取工艺将4 ℃保存的裂褶菌菌种接种到PDA培养基上，25 ℃培养3~5 d。用Φ1 cm打孔器打取4个菌丝块，接种到装液量为150 mL种子培养基中，25 ℃、160 r/min培养5 d。取培养液按5%接种量接种于新鲜种子培养基中，相同条件再培养5 d得到种子液。取种子液以5%的接种量接种到基础发酵培养基中，25 ℃、160 r/min培养7 d。发酵液6 000 r/min离心10 min，取上清液加入三倍体积的95%乙醇沉淀过夜，6 000 r/min离心10 min，取沉淀于50 ℃烘箱中烘干至恒重，称重并计算多糖产量。1.2.1.2胞外多糖发酵单因素试验在其他原料不变的情况下，将基础发酵培养基的碳源改变为蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉，筛选最佳碳源；设置最佳碳源的浓度为10、20、30、40、50 g/L，考察碳源含量对多糖产量的影响。将基础发酵培养基的氮源改变为牛肉膏、蛋白胨、马铃薯浸粉、大豆蛋白胨，筛选最佳氮源；设置最佳氮源的浓度为4、6、8、10、12 g/L，考察氮源含量对多糖产量的影响。将基础发酵培养基的生长因子改变为L-谷氨酸、α-萘乙酸、油酸、3-吲哚丁酸，筛选最佳生长因子；设置最佳生长因子的浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，考察生长因子含量对多糖产量的影响。1.2.1.3正交试验设计以乳糖、大豆蛋白胨、3-吲哚丁酸为试验因子，通过正交试验优化高产胞外粗多糖发酵培养基，正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.T001表1正交试验因素及水平水平A乳糖B大豆蛋白胨C 3-吲哚丁酸12080.5230101.0340121.5g/L1.2.2裂褶菌胞外多糖生物活性测定1.2.2.1羟基自由基清除率将裂褶菌胞外多糖配制为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L的溶液，按试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司）说明书测定并计算羟基自由基清除率。羟基自由基清除率=[1-(A测定-A对照)/A空白]×100%(1)1.2.2.2DPPH自由基清除率将裂褶菌胞外多糖配制成1.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0 g/L的溶液，按试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司）说明书测定并计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=[1-(A测定-A对照)/A空白]×100%(2)1.2.2.3裂褶菌胞外多糖抑菌性试验将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种到新鲜的NA斜面培养基上，37 ℃培养24 h，用接种环挑菌种一环，接入NB培养基中，37 ℃、90 r/min培养24 h。取适量菌液用蒸馏水稀释至A560 nm值在0.4~0.6之间，得菌悬液。配制0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L的裂褶菌胞外多糖溶液，在无菌条件下各取0.5 mL，分别注入8 mL的大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的菌悬液中，以加入等量蒸馏水为对照，37 ℃、70 r/min培养12 h，测定560 nm处吸光度。以同浓度青霉素钠作为阳性对照，3次平行试验，并统计半数抑制浓度（IC50）。抑菌率=[菌悬液的吸光度-(菌悬液加多糖的吸光度-多糖的吸光度)]/菌悬液的吸光度×100%(3)1.2.2.4裂褶菌胞外多糖吸湿性试验称取裂褶菌胞外多糖、聚乙二醇（200）、丙三醇、海藻酸钠各0.500 0 g于直径3 cm的称量瓶（开口）中，置于装有饱和乙酸钾溶液（RH 43%）、饱和碳酸钾溶液（RH 60%）和饱和硫酸铵溶液（RH 81%）[12-13]的干燥器内，（25±1）℃放置1、2、4、8、12、16、24 h，测定样品放置前、后的质量（m0、m1），计算吸湿率。吸湿率=(m0-m1)/m0×100%(4)1.2.2.5裂褶菌胞外多糖保湿性试验称取裂褶菌胞外多糖、聚乙二醇（200）、丙三醇、海藻酸钠各2.000 0 g于直径3 cm的称量瓶中，加入1 mL蒸馏水混匀，置装有干硅胶的干燥器内，（25±1）℃放置1、2、4、8、12、16、24、48 h，测定样品放置前、后的水分质量（m0、m1），计算保湿率。保湿率=m1/m0×100%(5)1.3数据统计与分析每个试验处理3个重复，试验数据采用Microsoft Excel 2016软件进行处理，Graphpad prism 9软件进行分析；采用Graphpad prism 9软件进行绘图。2结果与分析2.1裂褶菌高产胞外多糖发酵培养基优化结果2.1.1发酵培养基碳源筛选及最佳浓度确定（见图1）由图1（a）可知，当乳糖作为碳源时，多糖产量最高，为（9.58±0.40）g/L，显著高于其他碳源（P0.05）。由图1（b）可知，当乳糖浓度在10~30 g/L时，裂褶菌胞外粗多糖产量随乳糖浓度的增加而增大，当乳糖浓度为30 g/L时，多糖产量达到最大，为（12.05±0.14）g/L。随着乳糖浓度增加，裂褶菌胞外粗多糖产量迅速降低，说明过量的乳糖对多糖产量具有抑制作用。图1发酵培养基碳源筛选及最佳浓度确定注：“*”表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F1a1（a）碳源种类 （b） 乳糖浓度因此，确定正交试验中乳糖的3个水平为20、30、40 g/L。2.1.2发酵培养基氮源筛选及最佳浓度确定（见图2）由图2（a）可知，当氮源为大豆蛋白胨时，胞外多糖产量最高，为（7.51±0.27）g/L，因此确定大豆蛋白胨为最佳氮源。由图2（b）可知，随着大豆蛋白胨浓度的提高，多糖产量先呈快速上升，再增速趋缓后开始下降的趋势，当大豆蛋白胨浓度为10 g/L时，粗多糖产量达到最大值，为（9.26±0.31）g/L。因此，确定高产裂褶菌胞外多糖正交试验中大豆蛋白胨的三水平为8、10、12 g/L。图2发酵培养基氮源筛选及最佳浓度确定10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F2a1（a）氮源种类10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F2a2（b）大豆蛋白胨浓度2.1.3发酵培养基生长因子筛选及最佳浓度确定（见图3）由图3（a）可知，不同生长因子对外粗多糖产量影响的排序为3-吲哚丁酸维生素B1油酸α-萘乙酸L-谷氨酸。当生长因子为3-吲哚丁酸时，粗多糖产量为（5.57±0.28）g/L。因此，确定3-吲哚丁酸为高产裂褶菌胞外粗多糖培养基的最佳生长因子。3-吲哚丁酸是一种常见的植物生长调节剂，其促生长的机制可能是3-吲哚丁酸可调节细胞有丝分裂信号通路和调控代谢物产物的合成途径，通过加快细胞周期进程，进而促进真菌细胞的生长[14-15]。由图3（b）可知，3-吲哚丁酸浓度从0.5 mg/L上升到1.0 mg/L时，粗多糖产量随之增加，达到最高值（4.80±0.74）g/L；当浓度从1.0 mg/L上升到1.5 mg/L时，粗多糖产量基本保持不变；当浓度大于1.5 mg/L时，多糖产量快速下降。因此，高浓度生长因子会抑制多糖的产生，确定高产裂褶菌胞外多糖正交试验中3-吲哚丁酸的3个水平为0.5、1.0、1.5 mg/L。图3发酵培养基生长因子筛选及最佳浓度确定10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F3a1（a）生长因子种类10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F3a2（b）3-吲哚丁酸浓度2.1.4正交试验及方差分析结果（见表2、表3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.T002表2正交试验结果项目ABC空列粗多糖含量/(g/L)111118.57212227.49313337.354212313.245223111.776231211.137313215.128321313.419332113.96k17.8012.3111.0411.43k212.0510.8911.5611.25k314.1610.8111.4111.33R6.361.490.530.19由表3可知，各因素影响多糖含量的主次顺序为乳糖（A）大豆蛋白胨（B）3-吲哚丁酸（C）；优化高产胞外粗多糖发酵培养基的最佳条件为A3B1C2，即乳糖40 g/L、大豆蛋白胨8 g/L、3-吲哚丁酸1 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.T003表3正交试验方差分析结果项目Ⅲ类平方和自由度均方F值P值修正模型67.64611.27430.640.05A62.94231.471 202.080.01B4.2622.1381.410.05C0.4420.228.440.12误差0.0520.02修正总计67.698注：P0.05表示影响显著。由表3可知，对试验数据进行方差分析和F检验结果显示，因素A和B对裂褶菌胞外粗多糖产量的影响显著（P0.05），C对裂褶菌胞外粗多糖产量的影响不显著（P0.05）；模型整体具有显著性（P0.05）。根据优化结果进行验证试验，基础培养基在25 ℃培养7 d后，裂褶菌胞外粗多糖产量为（5.28±0.57）g/L；而优化后的培养基的多糖产量达到（16.01±0.38）g/L，为基础培养基的3.03倍。2.2裂褶菌胞外多糖的抗氧化性测定结果（见图4）由图4可知，裂褶菌胞外多糖羟基自由基清除能力小于同浓度条件下VC溶液，原因是VC相比多糖更易接受电子或通过提供氢基的途径中和体系中的活性氧（ROS）[16]。裂褶菌胞外多糖对羟基自由基的清除能力随浓度的升高而升高，当多糖浓度为3.0 g/L时，对羟基自由基的清除率达到（49.57±0.71）%，IC50为3.146 g/L；当多糖浓度为6.0 g/L时，对DPPH自由基的清除率达到（43.24±0.86）%，IC50为8.291 g/L。图4裂褶菌胞外多糖的抗氧化性测定结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F4a1（a）羟基自由基 （b）DPPH自由基2.3裂褶菌胞外粗多糖的抑菌性测定结果（见图5）由图5（a）可知，裂褶菌胞外多糖溶液对大肠杆菌具有较好的抑制作用，随着多糖浓度升高，多糖抑菌率迅速上升；当多糖浓度达到4 g/L时再提高浓度，多糖抑菌率提高变缓；当多糖浓度为8 g/L时，其抑菌率达到（67.43±0.45）g/L，接近青霉素钠的抑菌效果，其IC50为3.516 g/L。由图5（b）可知，随裂褶菌胞外多糖浓度增加，裂褶菌胞外多糖溶液对金黄色葡萄球菌的抑制作用增加，其IC50为9.732 g/L。图5裂褶菌胞外粗多糖的抑菌性测定结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F5a1（a）大肠杆菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F5a2（b）金黄色葡萄球菌2.4裂褶菌胞外粗多糖在不同环境中的吸湿性测定结果（见图6）选择常用保湿剂丙三醇、聚乙二醇、海藻酸钠为对照，探究裂褶菌胞外粗多糖的保湿性能。由图6可知，在RH 43%环境中，0~8 h内，粗多糖、海藻酸钠吸湿性为零；8 h后，所有物质吸湿性数据均有较明显的上升趋势；36 h后，吸湿性趋于平缓。在RH 60%环境中，0~12 h内，除丙三醇外，粗多糖、聚乙二醇、海藻酸钠吸湿率上升趋势均较缓和；12 h后，丙三醇、聚乙二醇、海藻酸钠、粗多糖吸湿率增速较快。在RH 81%环境中，0~24 h内粗多糖与海藻酸钠的吸湿性且差异不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F006图6裂褶菌胞外粗多糖在不同环境中的吸湿性测定结果综合比较4种材料的吸湿性由大到小为丙三醇聚乙二醇粗多糖海藻酸钠。2.5裂褶菌胞外粗多糖的保湿率测定结果（见图7）由图7可知，在0~2 h，4种材料的保湿率均缓慢下降，裂褶菌胞外多糖的保湿率与甘油和聚乙二醇无明显区别；当时间超过2 h时，裂褶菌胞外多糖的保湿率迅速下降，明显低于丙三醇和聚乙二醇，但仍高于海藻酸钠；当时间为48 h时，裂褶菌胞外多糖保湿率仍能达到82.5%，4种试材保湿率由大到小为丙三醇聚乙二醇粗多糖海藻酸钠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.017.F007图7裂褶菌胞外粗多糖的保湿率测定结果3讨论真菌多糖作为天然活性成分，可提高动物的生长性能、免疫功能及抗氧化等性能[17-18]。本试验中，经培养基优化后，裂褶菌胞外多糖产量大幅增加，为其大规模发酵生产提供了参考。在相同浓度区间，裂褶菌胞外多糖对羟基自由基的清除能力高于枸杞多糖；对DPPH自由基的清除能力与枸杞多糖相当[19]。研究发现，枸杞多糖可以提高动物的消化能力[20-21]，提示裂褶菌胞外多糖同样具有良好的应用前景。裂褶菌胞外多糖吸湿保湿性与香蕉多糖和桃胶多糖[22-23]相当，具有一定的抑菌作用。裂褶菌胞外多糖可用于开发成为具有免疫效果、提高抗病能力的功能性饲料添加剂[24]，或用于延长饲料保质期，提高适口性[25]。本试验仅初步优化了裂褶菌胞外多糖高产培养基，研究了多糖的生物活性，未来需探究发酵条件，进一步提高多糖得率；对其进行纯化和组分分离，研究各组分的结构和生物学性质，特别是促进畜禽生长、提高机体免疫力等活性，为裂褶菌胞外多糖在饲料添加剂研发领域提供新思路。4结论本试验以发酵液中的裂褶菌胞外多糖产量为指标，优化了高产胞外多糖培养基配方，其配方为乳糖40 g/L、大豆蛋白胨8 g/L、3-吲哚丁酸1 mg/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L，pH值6.0，且进一步证明其具有较好的抗氧化性、抗菌性、吸湿性和保湿性，在饲料研究领域具有较好的应用价值。