抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒和抗肿瘤细胞活性[1]。两栖类动物皮肤直接暴露在复杂的环境中，构成了抵御外来病原菌侵袭的第一道防线，为抗菌肽分泌提供了有利条件[2]。但天然抗菌肽存在稳定性差、毒性高等问题，因此掌握抗菌肽的生物学特性可为抗菌肽的改造提供参考。蛙皮素抗菌肽是在欧洲铃蟾皮肤中发现Bombinin，由22个氨基酸组成[3]。随后在非洲爪蟾、澳洲树蛙、中国林蛙和牛蛙等两栖动物皮肤中均发现了具有生物活性的多肽[4-5]。蛙皮素抗菌肽具有提高畜禽机体生产性能、改善肠道菌群结构、增强免疫能力的作用，还可防治因病毒引起的疾病[6]。李登云等[7]在育肥猪日粮中添加300 g/t蛙皮素抗菌肽Dermaseptin-M，发现与对照组相比，蛙皮素抗菌肽Dermaseptin-M组育肥猪的平均日增重提高了4.64%，料重比降低了4.71%。在仔猪日粮中添加蛙皮素抗菌肽可有效降低肠道有害菌群丰度，增加双歧杆菌、乳酸杆菌等有益菌群丰度，从而改善断奶仔猪肠道微生物菌群结构，降低仔猪腹泻发病率[8]。抗菌肽Brevinin可提高肉仔鸡胸腺指数和法氏囊指数，增强免疫力[9]。利用细胞感染方法研究蛙皮素抗菌肽的抗病毒作用，发现抗菌肽Dermaseptin S4对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒具有抑制作用[10]。目前，Caerin类抗菌肽表现出较好的抗菌、抗病毒特性，成为抗菌肽研究中较多的一类多肽。Caerin类抗菌肽来自澳洲树蛙皮肤的分泌物，由12-26氨基酸组成，根据氨基酸序列组成不同分为Caerin 1、Caerin 2、Caerin 3和Caerin 4[11]。有研究推测，抗菌作用与生物学特性有关，进而引起细胞膜变化从而导致病原菌死亡[12]。本研究利用生物信息学在线软件，对Caerin 2.1的氨基酸组成、理化性质、二级结构、跨膜区和信号肽、糖基化和磷酸化位点、两亲性进行预测分析，以期为天然抗菌肽的改造以获得稳定、安全的抗生素替代品提供参考。1材料与方法1.1试验材料蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1氨基酸序列来自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/，其序列为GLVSSIGRAL GGLLADVVKS KGQPA。1.2试验方法1.2.1氨基酸组成和理化性质分析利用ProParam软件，输入蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1氨基酸序列，分析氨基酸数目及含量、相对分子质量、等电点、正电荷氨基酸总数（Arg+Lys）、负电荷氨基酸总数（Asp+Glu）、在哺乳动物细胞中半衰期、在酵母菌中半衰期、在大肠杆菌中半衰期、不稳定指数、脂溶性指数和亲水性平均系数等。1.2.2二级结构分析利用SOPMA软件，输入蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1氨基酸序列，预测其二级结构。1.2.3三级结构分析PEP-FOLD 3.5软件，输入蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的氨基酸序列，对蛋白质的空间构象进行建模。1.2.4跨膜区和信号肽分析利用DeepTMHMM软件，在NCBI上查找蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的Fasta格式，输入软件，预测蛋白质跨膜区。利用SignalP-5.0软件，输入蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1氨基酸序列，选择真核生物，预测蛋白质信号肽。1.2.5糖基化和磷酸化分析利用NetOGlyc-4.0软件，输入蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的Fasta格式，预测糖基化位点。利用NetPhos-3.1软件，输入蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的Fasta格式，预测磷酸化位点。1.2.6两亲性分析利用ProtScale软件，输入蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的氨基酸序列，选择Hydropath./Kyte & Doolittle，分析氨基酸的亲水性和疏水性。利用HeliQuest软件，输入蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的氨基酸序列，选择α-螺旋形结构进行螺旋轮分析。蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1生物信息学在线分析工具见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.015.T001表1蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1生物信息学在线分析工具分析内容工具名称网址氨基酸组成和理化性质ProParamhttps://web.expasy.org/protparam/二级结构SOPMAhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html三级结构PEP-FOLD 3.5https://mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py#forms::PEP-FOLD3跨膜区DeepTMHMMhttps://dtu.biolib.com/DeepTMHMM信号肽SignalP-5.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/糖基化NetOGlyc-4.0https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetOGlyc-4.0/磷酸化NetPhos-3.1https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/两亲性ProtScalehttps://web.expasy.org/protscale/螺旋轮HeliQuesthttps://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py2结果与分析2.1蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的氨基酸组成和理化性质分析（见表2、表3）由表2、表3可知，利用ProParam在线工具对蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的氨基酸组成和理化性质进行分析，其分子式为C105H185N31O32，由25个氨基酸残基、11种氨基酸组成，分子量为2 393.81 u，等电点为9.99。蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1在哺乳动物细胞中半衰期为30 h，在酵母菌中半衰期大于20 h，在大肠杆菌中半衰期大于10 h，不稳定指数为29.700，亲水性平均系数为0.496。由此可知，蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1为稳定性多肽，亲水平均系数为正数，总体呈疏水性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.015.T002表2蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的氨基酸组成序号氨基酸数量/个含量/%1丙氨酸（A）312.02精氨酸（R）14.03天冬氨酸（D）14.04谷氨酰胺（Q）14.05甘氨酸（G）520.06异亮氨酸（I）14.07亮氨酸（L）416.08赖氨酸（K）28.09脯氨酸（P）14.010丝氨酸（S）312.011缬氨酸（V）312.010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.015.T003表3蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的理化性质项目结果氨基酸数量/个25.00分子量/u2 393.81等电点9.99正电荷氨基酸总数（Arg+Lys）/个3.00负电荷氨基酸总数（Asp+Glu）/个1.00在哺乳动物细胞中半衰期/h30.00在酵母菌中半衰期/h＞20在大肠杆菌中半衰期/h＞10不稳定指数29.700脂溶性指数124.800亲水性平均系数0.4962.2蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的二级结构预测（见图1）由图1可知，经SOPMA在线软件预测，蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的二级结构中α-螺旋结构占比76%，β结构占比8%，无规则卷曲占比16%。蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的二级结构主要呈α-螺旋结构。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.015.F001图1蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的二级结构预测注：大写字母为氨基酸的简称；h和长竖线为α-螺旋结构；中竖线和t为β结构；短竖线和c为无规则卷曲。2.3蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的三级结构预测（见图2）三维结构预测可更直观了解多肽的结构，常用于预测蛋白质三维结构的方法包括从头预测法和同源建模的方法。利用PEP-FOLD 3.5软件，使用同源建模的方法对蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1三维结构进行预测。由图2可知，Caerin 2.1的三维结构以α-螺旋结构为主，与二级结构预测结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.015.F002图2蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的三级结构预测2.4蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的跨膜区和信号肽预测经DeepTMHMM和SignalP-5.0在线工具预测，蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1没有跨膜区和信号肽，为细胞内表达。2.5蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的糖基化和磷酸化位点预测（见表4、图3）由表4、图3可知，经NetOGlyc-4.0在线软件分析，蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1不存在糖基化位点，其中丝氨酸（S）残基有3个磷酸化位点。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.015.T004表4蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1磷酸化位点的预测序号磷酸化位点催化激酶（得分）位点氨基酸14丝氨酸（S）cdc2（0.521）25丝氨酸（S）CKI（0.500）320丝氨酸（S）unsp（0.744）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.015.F003图3蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1磷酸化位点的预测分析2.6蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的两亲性预测（见图4、图5）由图4可知，经ProtScale在线软件分析，蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1为两亲性结构，疏水性值为0.287，疏水力矩为0.399，净电荷为+2；最大疏水指数为1.922，位于第14位氨基酸；最小疏水指数为-1.022，位于第20位氨基酸。抗菌肽Caerin 2.1的总体疏水性大于亲水性，总体呈疏水。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.015.F004图4蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的两亲性预测螺旋轮可分析α-螺旋结构中疏水氨基酸和亲水氨基酸分布情况，直观地反映多肽极性面和非极性面的氨基酸分布。由图5可知，蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1为两亲性结构，主要呈疏水性，与两亲性预测结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.015.F005图5蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1的螺旋轮分析注：黄色为非极性疏水性氨基酸残基；蓝色为极性带正电荷氨基酸残基；淡红色为极性不带电荷中性酰胺类氨基酸残基；紫色为极性不带电荷中性含羟基类氨基酸残基；灰色为极性不带电荷疏水性氨基酸残基；红色为极性带负电荷酸性氨基酸。3讨论3.1氨基酸序列长度与组成分析抗菌肽氨基酸序列长度一般在6~50个氨基酸残基，长度增加有利于提高抗菌活性，但过长反而会降低抗菌活性[13]。以中国林蛙中分离获得的Brevinin-2CE为模板肽，通过截短氨基酸序列的方法获得不同大小的改造肽。抑菌活性研究发现，随着序列变短，抑菌活性逐渐降低[14]。在NCBI中收录的蛙皮素抗菌肽Caerin含12~26个氨基酸残基，其中Caerin 2.1含25个氨基酸残基，该肽链长度有利于其发挥抗菌活性。氨基酸组成可影响蛋白的构象，参与细胞信号转导，进而影响多肽的活性。脯氨酸参与许多细胞信号转导途径，对抗菌肽的表达、免疫调节、抗氧化性能具有重要意义，同时可降低对宿主细胞的毒性[15]。脯氨酸与精氨酸残基结合可形成复合结构，插入病原菌细胞发挥作用[16]。有研究表明，富含脯氨酸多肽（PR-AMPs）可作为胞内靶向肽抑制癌症细胞增殖[17]。因此，抗菌肽氨基酸序列中富含脯氨酸可提高抗菌活性。蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1中富含脯氨酸和精氨酸。此外，氨基酸的组成与多肽的阳离子性和疏水性有关，其中色氨酸可提高多肽的阳离子性，芳香氨基酸可增强多肽的疏水性[18]。因此，可通过改变多肽的氨基酸组成增强其活性。3.2抗菌肽的电荷数分析抗菌肽呈阳离型有利发挥抗菌活性，且不产生耐药性，不损伤动物机体健康，与抗菌肽的抗菌机制有关。一般病原菌细胞膜呈负电性，抗菌肽在静电作用下聚集在膜两侧，形成桶板，使胞内容物外泄，杀灭病菌[19]。蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1呈现阳离子型，有利于杀灭病原菌。一般认为，随着等电点和净电荷的增加，抗菌活性增强[20]。因此，分析掌握多肽的等电点和净电荷是改造多肽中需考虑的关键因素之一。3.3抗菌肽的结构特征分析抗菌肽的二级结构不是由单一氨基酸残基决定，而是多个氨基酸残基互相作用的结果。其中大部分抗菌肽呈α-螺旋结构，可通过干扰细胞膜通透性发挥抗菌活性[21]。利用氨基酸替代的方法，将抗菌肽Melittin氨基酸序列中的甘氨酸替换为亮氨酸，可增强α-螺旋结构，对比母肽增加了抗菌活性和溶血活性[22]。蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1二级结构中以α-螺旋结构为主，还存在少量的β结构和无规则卷曲，符合对多肽理想二级结构的预期。同时，对蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1三级结构进行同源建模预测，三级结构中α-螺旋结构也占主要部分，为其抗菌活性发挥提供了结构基础。跨膜区预测可分析蛋白质的定位，一般跨膜结构域为疏水性，而膜外结构为亲水性。如多肽含有跨膜区则可能为膜蛋白，构建表达蛋白可考虑真核表达系统[23]。信号肽分析可预测蛋白质向分泌通路转移的短肽链，分泌性蛋白质合成后由信号肽引导，使其穿过合成所在的细胞到其他组织细胞中[24]。信号肽的预测有助于分析蛋白质功能域及蛋白质细胞定位。蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1无跨膜区和信号肽，为膜内表达蛋白。3.4抗菌肽的两亲性分析抗菌肽的两亲性包括亲水性和疏水性，其中亲水基团插入病原体细胞膜内侧，疏水基团在细胞膜外侧，以破坏膜完整性杀灭病原体[25-26]。疏水基团在破坏膜完整性上发挥重要作用，一般认为抗菌肽疏水性增强，抗菌活性也会随之增加[27]。但疏水性增强也会对动物机体产生毒副作用，这是由于抗菌肽与哺乳动物细胞的结合依靠疏水基团[28]。因此，确保抗菌肽合适的疏水力尤为重要。也有研究表明，完全两亲性抗菌肽的活性高于不完全两亲肽；对鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌模板肽进行改造，优化了极面上带正电荷残基的数量和位置，以及非极面上疏水分子的数量、位置和类型，发现新获得4条完全两亲性改造肽对比模板肽具有较好的抗菌活性和降低溶血性[29]。但抗菌肽两亲性与抗菌活性及红细胞毒性关系复杂且尚不明确[30]。基于两亲性和螺旋轮结果分析，蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1总体呈疏水性，有利于发挥抑菌活性。3.5抗菌肽的稳定性分析氨基酸序列中的磷酸化和糖基化位点，起到改变蛋白质构象和增加蛋白稳定性的作用[31]。经预测，蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1存在3个磷酸核位点，这对增强其稳定性、调节生物学功能具有重要作用。此外，氨基酸序列长度、阳离子型、二级结构和两亲性等因素决定了抗菌肽的稳定性。确保多肽稳定性可保证其在不同离子浓度、温度、酸碱环境中发挥抑菌活性[32]，经预测蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1多肽属于稳定性多肽，为在畜牧、食品及医疗等领域应用提供了先决条件。4结论文章经生物信息学方法分析预测，蛙皮素抗菌肽Caerin 2.1为含25个氨基酸残基的阳离子型多肽，二级结构中主要包含α-螺旋和少量β结构及无规则卷曲，理论等电点为9.99，具有较好的稳定性，呈疏水性，为细胞内表达，具有3个磷酸化位点。这些生物学特性确保抗菌肽Caerin 2.1较好地发挥抗菌、抗病毒、抗肿瘤细胞活性，为深入研究蛙皮素类抗菌肽提供了信息学参考。