豆粕蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，是畜禽优质的蛋白质饲料来源；但未经处理的豆粕中含有抗胰蛋白酶、脲酶、植酸等多种抗营养因子，对动物的消化及饲料的利用会产生不良影响[1]。与热处理、化学处理方式相比，利用微生物对豆粕进行预处理，具有成本低、环保等优点[2]。除此之外，豆粕经微生物发酵处理后，部分抗营养因子被降解，适口性和营养价值显著提高，对维持畜禽肠道组织结构、提高免疫功能、改善畜禽生产性能具有积极作用[3-5]。微生物复合菌发酵豆粕比单一菌效果更好，是未来微生物发酵豆粕发展的趋势。嗜酸乳杆菌因具有调节肠道菌群、抑制有害微生物生长、提高机体免疫力等生理功能，被广泛应用于发酵豆粕生产中，但目前对豆粕复合菌种发酵的研究还不够深入。发酵豆粕中酸溶蛋白含量可以很好地反映大分子蛋白被分解的情况，在饲料行业中多用该指标评估小肽的含量。因此，本研究采用响应面分析法，以发酵豆粕酸溶蛋白为指标，分别利用产α-淀粉酶、蛋白酶、植酸酶以及β-甘露聚糖酶的功能性嗜酸乳杆菌对豆粕进行协同发酵，以期获得复合益生无抗蛋白肽的发酵豆粕，为其在畜禽生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂产α-淀粉酶、蛋白酶、植酸酶以及β-甘露聚糖酶的嗜酸乳杆菌为实验室筛选保藏菌种，用于豆粕发酵的菌液活菌数为3.28×109 CFU/mL；豆粕由江西某饲料企业提供，粉碎后过筛。1.2主要仪器设备Epsilon 1-42-4LSCplus冷冻干燥机（上海智尧仪器仪表有限公司），G154DS高压灭菌锅（致微（厦门）仪器有限公司），SW-CJ-2FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），H2100R高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），HBS-1096B酶标分析仪（上海卓好实验室设备有限公司），UV-6100双光束型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），Starter 3100/台式pH计（上海子期实验设备有限公司），SPX-250B-Z生化培养箱（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司），SH220F石墨消解仪（济南海能仪器股份有限公司），K1100全自动凯氏定氮仪（海能未来技术集团股份有限公司），L-3000型全自动氨基酸分析仪（苏州华美辰仪器设备有限公司）。1.3培养基的配制1.3.1MRS培养基葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、牛肉膏5.0 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、柠檬酸三铵2.0 g/L、醋酸钠5.0 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、吐温80 1.0 mL/L、琼脂15.0 g/L，pH值6.2~6.4，121 ℃高压灭菌15~20 min。1.3.2发酵种子液的制备从MRS固体培养基上挑取不同功能性嗜酸乳杆菌落接种至MRS液体培养基中，在37 ℃条件下培养48 h，之后按5%的比例将其接种至液体培养基扩大培养24 h，得到种子液。1.3.3发酵固体培养基的制备将50.0 g已粉碎豆粕装入250 mL三角瓶中，加入适量的水搅拌均匀，110 ℃高压灭菌30 min，具体液料比根据试验设计而定[6]。1.3.4发酵方法将已灭菌的发酵固体培养基充分混匀，等量分装于250 mL三角瓶中，把已培养好的发酵种子液按照一定比例接种至发酵固体培养基上，充分搅拌混匀后静置厌氧发酵[7]。1.4单因素试验发酵种子液中产α-淀粉酶、蛋白酶、植酸酶以及β-甘露聚糖酶的嗜酸乳杆菌接种比例为2∶2∶1∶1。发酵固体培养基的初始条件为菌液接种量12%、液料比1 L/kg、培养温度37 ℃、发酵时间为72 h。本试验以酸溶蛋白含量为指标分别研究菌液接种量（8%、10%、12%、14%、16%）、液料比（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 L/kg）、温度（33、35、37、39、41 ℃）、发酵时间（24、48、72、96、120 h）4个因素对豆粕发酵效果的影响，每个试验设置3个平行。1.5响应面试验根据单因素试验结果选取对酸溶蛋白含量影响较大的因素，以酸溶蛋白含量为响应值，应用Design-Expert 13.0.1软件的Box-Behnken设计3因素3水平试验。试验结束后，对所得结果进行方差分析及二次回归拟合，建立平方项和任意两个因素之间的数学模型，研究各因素与响应值（酸溶蛋白含量）之间的关系，从而确定最佳发酵条件[8]。响应面试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.T001表1响应面试验因素水平设计水平A菌液接种量/%B发酵时间/hC发酵温度/℃-1824330127237116120411.6发酵验证试验按照响应面设计所得的最佳优化条件进行验证试验，每个试验设置3个平行，验证并分析试验结果。1.7发酵固体培养基成分的分析分析在响应面最佳发酵条件下豆粕发酵后的相关成分，主要包括粗蛋白、酸溶蛋白、半纤维素、游离氨基酸含量、活菌数以及抗营养因子胰蛋白酶抑制剂、脲酶、植酸的降解情况。粗蛋白含量测定参照《饲料中粗蛋白的测定》（GB/T 6432—2018），酸溶蛋白含量测定参照《大豆肽粉》（GB/T 22492—2008），半纤维素含量测定参照《农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定》（NY/T 3494—2019），游离氨基酸总量测定参照《饲料中氨基酸的测定》（GB/T 18246—2019），活菌计数参照《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》（GB 4789.35—2016），胰蛋白酶抑制剂含量采用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺法检测[9]，脲酶活性的测定采用pH增值法[10]，植酸含量采用三氯化铁比色法测定[11]。1.8数据统计与分析运用SPSS 22.0软件对试验数据进行分析，结果以“平均值±标准差”表示；运用Origin 9.0软件制图；响应面优化设计试验及分析运用Design-Expert 13.0.1软件。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1菌液接种量对酸溶蛋白含量的影响（见图1）由图1可知，随着菌液接种量的增加，发酵豆粕中酸溶蛋白含量先升高后降低，最后呈现平缓的趋势；当接种量为12%时，酸溶蛋白的含量达到最高，为4.49%。产生上述现象是因为当接种量较小时，豆粕中嗜酸乳杆菌的含量较低，无法将其中的蛋白质充分降解；而接种量较大后，嗜酸乳杆菌间相互竞争豆粕中的蛋白及其他营养物，生长处于动态平衡状态，导致酸溶蛋白的含量趋于平缓。因此，发酵豆粕最适的菌液接种量为12%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.F001图1菌液接种量对酸溶蛋白含量的影响2.1.2发酵温度对酸溶蛋白含量的影响（见图2）由图2可知，随着温度的升高，发酵豆粕中酸溶蛋白含量先升高后降低。当温度为37 ℃时，酸溶蛋白的含量达到最高，为4.46%。产生上述现象的原因是当温度偏低时，豆粕中嗜酸乳杆菌生长缓慢；而温度偏高时，嗜酸乳杆菌生长受到抑制，造成酸溶蛋白含量降低。因此，发酵豆粕最适宜的发酵温度为37 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.F002图2发酵温度对酸溶蛋白含量的影响2.1.3发酵时间对酸溶蛋白含量的影响（见图3）由图3可知，随着发酵时间的增加，发酵豆粕中酸溶蛋白含量逐渐升高，在72 h达到最大值后降低。因此，发酵豆粕最适宜的发酵温度为72 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.F003图3发酵时间对酸溶蛋白含量的影响2.1.4液料比对酸溶蛋白含量的影响（见图4）由图4可知，液料比对发酵豆粕中酸溶蛋白含量的影响相比其他3个因素较小。随着液料比的增加，发酵豆粕中酸溶蛋白含量总体趋势较为平稳；当液料比为0.9 L/kg时，酸溶蛋白的含量达到最高，为4.10%。产生上述现象是因为当水分含量较低时，豆粕过于干燥，不利于嗜酸乳杆菌附着吸收其中的营养物质；而如果水分含量过高，豆粕不够疏松，容易黏成一团造成厌氧环境，嗜酸乳杆菌生长所需的氧气不足，生长受到抑制。试验结果表明，发酵豆粕最适宜的液料比为0.9 L/kg。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.F004图4液料比对酸溶蛋白含量的影响2.2响应面试验及方差分析结果2.2.1响应面试验结果（见表2）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.T002表2响应面试验结果序号ABC酸溶蛋白含量Y/%1-1-103.1421-103.433-1103.6841103.925-10-13.02610-12.947-1012.7281012.8890-1-12.911001-12.98110-112.68120112.74130004.49140004.32150004.42160004.51170004.69运用Design-Expert 13.0.1软件对试验数据进行分析后，可以得到以酸溶蛋白（Y）为响应值的二次多项式回归方程Y=4.49＋0.076 2A＋0.145B－0.103 7C－0.012 5AB＋0.06AC－0.002 5BC－0.440 5A2－0.503B2－1.16C2。回归模型的方差分析见表3。由表3可知，二次回归模型Pmodel0.000 1，差异极显著；失拟项P＝0.218 7，差异不显著，说明模型中没有异常的数据，模型建立成功。响应面的相关系数（R2）为0.976 7，回归方程校正决定系数（Adjusted R²）为0.946 8，变异系数（C.V.）为4.86%，信噪比（Adeq Precision）为14.612 6，说明试验模型的拟合度较好，数据之间误差较小，能够对发酵豆粕的条件进行分析和预测。除此之外，方差分析的结果还显示，发酵时间（B）对酸溶蛋白含量的影响显著（P0.05），A2、B2、C2对酸溶蛋白含量的影响极显著（P0.01）。根据F值可判断，各因素对发酵豆粕中酸溶蛋白含量影响程度顺序为发酵时间发酵温度菌液接种量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.T003表3回归模型的方差分析项目平方和自由度均方F值P值总计8.680 016模型8.480 090.942 432.630 00.000 1A0.046 510.046 51.610 00.245 0B0.168 210.168 25.820 00.046 6C0.086 110.086 12.980 00.127 9AB0.000 610.000 60.021 60.887 2AC0.014 410.014 40.498 50.503 0BC0.000 010.000 00.000 90.977 4A²0.817 010.817 028.280 00.001 1B²1.070 011.070 036.880 00.000 5C²5.620 015.620 0194.630 00.000 1残差0.202 270.028 9失拟项0.128 130.042 72.300 00.218 7纯误差0.074 140.018 5注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著；R2＝0.976 7，Adjusted R²＝0.946 8，C.V.＝4.86%，Adeq Precision＝14.612 6。2.2.2酸溶蛋白最优条件的确定和模型验证为了更加直观地了解发酵豆粕中酸溶蛋白含量结果，运用Design-Expert 13.0.1软件基于二次回归方程模型绘制影响发酵豆粕酸溶蛋白的等高线和三维图，见图5。图5各因素交互作用对酸溶蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.F5a1（a）菌液接种量与发酵时间对酸溶蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.F5a2（b）菌液接种量与发酵温度对酸溶蛋白含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.F5a3（c）发酵时间与发酵温度对酸溶蛋白含量的影响由图5可知，菌液接种量、发酵温度、发酵时间3个因素存在极值点。对二次多项回归方程求导，获得豆粕酸溶蛋白含量最佳的发酵条件为菌液接种量12.3%、发酵温度36.8 ℃、发酵时间78.9 h，此条件下获得酸溶蛋白含量为4.50%。考虑试验实际的可操作性，修正最佳发酵条件为菌液接种量12.3%、发酵温度为36.8 ℃、发酵时间78.9 h。为了验证响应面模型的准确性，在上述最佳发酵条件下进行3次平行试验，测得发酵豆粕中平均酸溶蛋白含量为4.54%，与预测值很接近，说明构建的响应面模型能够很好地反映不同功能性嗜酸乳杆菌对豆粕进行协同发酵的情况。2.3发酵豆粕成分分析结果在响应面优化的最佳发酵条件下，测定发酵后豆粕中粗蛋白、酸溶蛋白、半纤维素、游离氨基酸、胰蛋白酶抑制剂、脲酶、植酸含量以及活菌数，对比发酵前后豆粕各营养成分及抗营养因子的变化情况，见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.017.T004表4发酵前后豆粕中营养成分及抗营养因子测定结果项目发酵前发酵后粗蛋白/%43.7450.36酸溶蛋白/%2.724.54半纤维素/%3.572.68游离氨基酸/(μg/g)19.83230.47胰蛋白酶抑制剂/(mg/g)5.650.47脲酶活性/(U/g)2.080.09植酸含量/%1.860.30活菌数/(CFU/g)—1.37×1010注：“—”表示无此部分数据。由表4可知，豆粕经不同功能嗜酸乳杆菌协同发酵后，粗蛋白含量比发酵前提高了15.13%，酸溶蛋白含量提高了66.91%，半纤维素含量下降了24.93%，游离氨基酸含量是发酵前的11.62倍，胰蛋白酶抑制剂含量下降了91.68%，脲酶活性下降了95.67%，植酸含量下降了83.87%，发酵后豆粕中的活菌数为1.37×1010 CFU/g。3讨论近年来，随着国内饲用蛋白需求和成本的不断增加，开发具有优良性能的发酵豆粕逐渐成为学者们研究的热点。利用嗜酸乳杆菌对豆粕进行发酵，能够充分发挥乳杆菌的产酸特点，可以在降低豆粕pH值、抑制有害细菌生长和繁殖的同时，改善豆粕的适口性和风味，从而达到提高饲料利用率的目的[12-13]。相比于单一菌种发酵，多菌种复合协同发酵豆粕的发酵效果更好，但关键在于复合菌种的种类、比例及发酵所采用的工艺[14]。因此，研究复合嗜酸乳杆菌对豆粕协同发酵的效果以及发酵工艺对畜牧行业生产具有指导意义。侯楠楠等[15]发现，利用乳酸菌和酿酒酵母发酵豆粕72 h后的粗蛋白含量提高了6.07%，酸溶蛋白含量是对照组的3.87倍。阿布都如苏力·艾尔肯[16]研究表明，利用嗜酸乳杆菌发酵豆粕后，豆粕中粗蛋白含量比发酵前提高了10.53%，粗纤维含量有所降低。刘雅娜等[17]利用嗜酸乳杆菌等菌种复合发酵豆粕34 h后，豆粕中酸溶蛋白含量增加了26%，游离氨基酸含量提高了13倍。李春梅等[18]将豆粕经植物乳杆菌协同发酵120 h后，发现豆粕中游离氨基酸含量显著提高，活菌数达1010 CFU/g。徐力等[19]运用响应面法优化复合菌种发酵豆粕，发现豆粕在最佳发酵条件下粗蛋白含量比发酵前提高13.96%，脲酶活性降低了95.93%。马文强等[20]用乳酸菌对豆粕进行协同发酵后，粗蛋白和游离氨基酸的含量比发酵前显著升高，胰蛋白酶抑制因子、脲酶和植酸等其他抗营养因子得到彻底消除。本试验测得发酵豆粕中粗蛋白含量提高了15.13%，胰蛋白酶抑制剂含量下降了91.68%，脲酶活性下降了95.67%，与阿布都如苏力·艾尔肯[16]、马文强等[20]和徐力等[19]研究结果基本一致；酸溶蛋白、游离氨基酸及活菌数显著提高的趋势，也印证了侯楠楠等[15]、刘雅娜等[17]和李春梅等[18]的试验结果。与此同时，豆粕中半纤维素和植酸含量显著降低，说明产β-甘露聚糖酶及植酸酶的嗜酸乳杆菌在发酵过程中起到了很好的作用，能够有效消除甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，避免饲料中金属离子与植酸形成稳定的螯合物，从而极大提高了豆粕的利用率。4结论本试验分别对产α-淀粉酶、蛋白酶、植酸酶及β-甘露聚糖酶的嗜酸乳杆菌协同发酵豆粕中菌液接种量、液料比、发酵温度和发酵时间4个因素进行单因素试验，根据单因素试验结果设计响应面试验，获得豆粕最佳发酵条件为：菌液接种量12.3%，液料比0.9 L/kg，发酵时间78.9 h，发酵温度36.8 ℃。豆粕在最佳条件下发酵后酸溶蛋白含量为4.54%，比发酵前提高了66.91%；粗蛋白含量提高了15.13%；半纤维素含量下降了24.93%；游离氨基酸含量是发酵前的11.62倍；胰蛋白酶抑制剂含量下降了91.68%；脲酶活性下降了95.67%；植酸含量下降了83.87%；发酵后豆粕中的活菌数为1.37×1010 CFU/g。研究结果表明，利用不同功能嗜酸乳杆菌协同发酵豆粕，能够提高豆粕的有效营养成分，很好地去除抗营养因子，从而提高豆粕的利用率，为发酵豆粕的工业化生产提供参考。