瑶药血风基原植物为走马胎（Ardisia gigantifolia Stapf），别名走马风、山猪药等，为紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛属（Ardisia）植物，主要分布于广西、江西、广东、云南等地[1-2]。瑶药是我国瑶族人民在生产生活实践中形成的独特民族医药[3]。常用的瑶药包括“五虎、九牛、十八钻、七十二风”，其中瑶药血风为老班瑶药“七十二风”中的风类药物[4]，黄酮和三萜类物质是其主要活性成分[5-6]。瑶药相关典籍中记载，走马胎具有祛风补血、活血散瘀、消肿止痛，外敷可用于痈疖溃烂等功效，可作兽药使用[7-8]。中草药饲料添加剂具有绿色、安全和药物残留低等特点[9-11]以及抗氧化、抗菌以及促进生长等功效[12-14]，极具开发潜力和利用价值。氧化应激、细菌感染、慢性炎症等是畜发病率增加和繁殖障碍的重要原因，能够影响动物生长性能，导致禽畜肉品质下降[15-17]。天然存在的黄酮类物质普遍具有较强的抗氧化能力[12]和一定的抗菌活性[18-19]。一般紫金牛属植物中含有山柰酚与槲皮素，其黄酮类活性组分具有抑菌和抗炎作用[20-21]。目前尚无关于瑶药血风黄酮的抗氧化、抑菌活性的研究。因此，本试验利用响应面法优化瑶药血风黄酮提取工艺，初步研究其抗氧化、抑菌活性，为瑶药血风的深入研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料与设备1.1.1试验材料瑶药血风购自广西壮族自治区金秀瑶族自治县瑶医医院。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌ATCC菌株，购自环凯生物集团。芦丁标准品购自上海麦克林生化科技股份有限公司；乙醇、亚硝酸钠、九水硝酸铝、氢氧化钠、甲醇、高氯酸、冰乙酸、乙酸乙酯、二甲基亚砜等常规试剂均为分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司；琼脂粉等培养基购自环凯生物集团；总抗氧化能力检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。1.1.2主要仪器设备R-1001VN型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司），KH-100DE型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司），ATY224型电子天平（岛津菲律宾工厂），H1850型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），WJX-100型高速多功能粉碎机（永康市红太阳机电有限公司），V-5600型可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），HH-4型恒温水浴锅（常州天瑞仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1原料预处理将瑶药血风根茎清洗去除杂质，烘干，得到干燥原材料后进行切片粉碎处理，过100目筛，制得干燥瑶药血风粉末，密封保存。1.2.2标准曲线的制作参考张芳[22]、陈勇[23]的方法并进行适当修改，测定黄酮含量。以芦丁（纯度≥95%）作为标准品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[24]进行标准曲线的制作。用无水乙醇溶解，精确称取0.100 0 g芦丁标准品（纯度≥95%），置于40 ℃热水浴完全溶解，降至室温后定容至500 mL，配得0.2 g/L的芦丁标准溶液。精密移取0、0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6 mL芦丁标准溶液于5 mL EP管中，分别向EP管中加入150 μL的5% NaNO2溶液，混匀避光放置6 min，加入150 μL的10% Al(NO3)3溶液，混匀避光放置5 min，再加入2 mL的4% NaOH溶液，以蒸馏水定容至5 mL刻度线，摇匀，室温避光显色15 min，碱性条件下血风中黄酮化合物与铝盐发生显色反应，使用紫外-可见分光光度法[25]测定其在510 nm的吸光度，每组进行3次平行测定，计算平均值。绘制标准曲线，横坐标为芦丁浓度C（g/L）、纵坐标为吸光度A。芦丁标准品浓度见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.T001表1芦丁标准品浓度芦丁体积/mL00.10.40.71.01.31.6浓度/(g/L)00.0040.0160.0280.0400.0520.0641.2.3血风黄酮含量的测定精密吸取血风黄酮提取液160 μL，同上述标准曲线制作法，在510 nm处测定吸光度，结合芦丁标准曲线计算黄酮质量浓度，根据公式计算黄酮含量。M=cVnm (1)式中：M为超声辅助提取血风黄酮含量（mg/g）；c为通过芦丁标准曲线计算的血风黄酮质量浓度（g/L）；V为试验中提取液体积（mL），本试验为100 mL；n为提取液测定时稀释倍数，本试验为25；m为血风粉末的质量（g）。1.2.4超声辅助提取血风黄酮工艺的研究1.2.4.1提取溶剂的选择试验试验选择蒸馏水、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯4种常用的提取溶剂提取，参照金钟[26]方法，并进行适当修改，测定黄酮含量。精确称取2.000 0 g瑶药血风粉末，分别加入蒸馏水、甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯100 mL，在温度为60 ℃、液料比为50 mL/g、超声功率为300 W的条件下，超声辅助提取15 min，比较提取溶剂提取血风黄酮的效果。试验平行操作测定3次，取平均值，计算血风黄酮含量。1.2.4.2单因素试验以干燥备用的瑶药血风粉末为试验原料，提取溶剂为无水乙醇，在固定提取温度为60 ℃条件下控制变量，单因素试验设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.T002表2单因素试验设计试验条件变量试验条件固定乙醇溶液与血风粉末液料比50 mL/g，超声功率300 W，提取时间15 min乙醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%、80%固定乙醇体积分数60%，乙醇水溶液与血风粉末液料比50 mL/g，超声功率300 W超声提取时间5、10、15、20、25、30 min固定乙醇体积分数60%，超声功率300 W，提取时间15 min乙醇溶液与血风粉末液料比30、40、50、60、70、80 mL/g固定乙醇体积分数60%，乙醇溶液与血风粉末液料比60 mL/g，提取时间15 min超声功率100、200、300、400、500 W1.2.4.3响应面试验设计依据单因素试验结果，选取乙醇体积分数（A）、提取时间（B）、液料比（C）、超声功率（D）作为响应面试验设计因素，选择适当的单因素水平范围，以血风黄酮含量为响应值M，应用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken中心组合设计四因素三水平的试验，对超声辅助提取血风黄酮工艺进行优化得到最佳工艺参数，响应面试验因素与水平设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.T003表3响应面试验因素与水平设计水平A/%B/minC/(mL/g)D/W-150550100060156020017025703001.2.4.4超声辅助提取验证试验根据响应面优化试验得出的最佳工艺参数组合进行重复试验，比较试验值和预测值，验证最佳提取工艺。1.2.5血风黄酮的总抗氧化能力测定使用试剂盒测定血风黄酮的总抗氧化能力。反应在酸性条件下，可以抑制内源性的一些干扰物质，样品中抗氧化物对Fe3+-TPTZ进行还原，形成蓝色的Fe2+-TPTZ，在波长593 nm处测定其吸光度，计算血风中黄酮物质的总抗氧化能力。Q=xV反总V样 (2)式中：Q为总抗氧化能力（mmol/L）；x为Fe2+浓度（mmol/L）；V反总为反应总体积，1.02 mL；V样为反应中样本体积，0.03 mL。1.2.6血风黄酮的抑菌活性试验1.2.6.1药敏片的制备由于部分提取物中存在有机溶剂，所以选用自制药敏片扩散法[27-28]评价抑菌水平。精确称取待测血风黄酮的粗浸膏0.400 0 g，用提取溶剂溶解成80 g/L的待测样品原液，阳性对照为氨苄西林和硫酸链霉素（用无菌水配制成0.10 g/L的溶液），空白对照为56%的乙醇水溶液。将空白药敏片在各溶液中浸泡30 min后，溶液挥发干净制成药敏片，紫外杀菌。1.2.6.2抑菌活性测定抑菌活性测定参照Bouaziz等[29]的方法并作适当调整。以细菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为指示菌，吸取菌悬液100 μL均匀涂布于LB固体培养基上，使用无菌镊子将自制药敏片夹置培养基表面至完全贴服。37 ℃倒置培养16 h，观察培养基，并对透明抑菌圈的直径进行准确测量并记录。所有样本均重复3次，以“平均值±标准差”表示该阶段的试验结果，分析血风黄酮的抑菌活性。1.2.6.3最小抑菌浓度（MIC）测定采用定量测定的液体稀释法[27,30]，并参照马志宏等[31]的方法并做出适当调整。取样品原液进行二倍稀释，以80 g/L作为起始抑菌试验浓度，得到80、40、20、10、5、2.50、1.25、0.63、0.31 g/L的样品溶液。向高压灭菌的试管分别加入无菌的LB液体培养基5 mL，样品溶液500 μL，菌悬液500 μL，阳性对照分别使用氨苄西林钠和硫酸链霉素，空白对照为56%乙醇水溶液。混匀后放置恒温生化培养箱中37 ℃培养24 h以上。在光线充足条件下，将试验组和对照组进行比较观察，观察每管的菌膜生长情况，无菌膜生长的临界试验管所对应的样品浓度为样品对该指示菌的最低抑菌浓度（MIC）。2结果与分析2.1芦丁标准曲线测定结果（见图1）由图1可知，芦丁标准曲线拟合得到线性回归方程为y=11.444x+0.002 7，R2=0.999 2，表明芦丁质量在0.004~0.064 g/L的范围内与吸光度具有良好的线性关系，适用于黄酮含量的计算。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F001图1芦丁标准曲线测定结果2.2不同提取剂对血风黄酮含量的影响（见图2）由图2可知，甲醇提取得到血风黄酮含量最高，为（40.44±0.70）mg/g，其次为无水乙醇，提取得到黄酮含量为（39.82±0.89）mg/g，乙酸乙酯提取得到血风黄酮含量仅为（16.38±0.80）mg/g，效果较差，蒸馏水的提取效果最差为（5.71±0.11）mg/g。由于甲醇和无水乙醇提取得到血风黄酮含量相差较小，均能最大限度地提取血风中黄酮物质，但考虑在提取溶剂选择时的一般要求其无毒无害，不存在爆炸腐蚀等风险，价低易得，去除容易，回收性好。与甲醇相比，无水乙醇性价比更高、不易发霉变质又安全环保。因此，本试验以无水乙醇为提取溶剂，对血风黄酮提取工艺进行优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F002图2不同提取剂对血风黄酮含量的影响2.3单因素试验结果2.3.1乙醇体积分数对血风黄酮含量的影响（见图3）由图3可知，乙醇体积分数在30%~60%的范围内，随着乙醇体积分数的增大，血风黄酮含量呈快速上升趋势，黄酮含量在乙醇体积分数为60%时可达52.29 g/L，当乙醇体积分数大于60%时，超声辅助提取黄酮含量逐渐减少。原因可能是当乙醇水体积分数过大时，溶出杂质较多与黄酮类物质竞争溶剂，脂溶性溶出物增多，检测得到黄酮溶出物降低；也可能是因为血风中黄酮类物质主要存在形式为苷类物质，苷类物质具有一定亲水性，在中等乙醇体积分数溶液中溶解度较高，继续升高乙醇体积分数时，其溶解度逐渐降低。本试验乙醇体积分数为60%血风黄酮含量最高，因此初步确定60%乙醇水体积分数为该因素最佳水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F003图3乙醇体积分数对血风黄酮含量的影响2.3.2提取时间对血风黄酮含量的影响（见图4）由图4可知，提取时间在5~30 min范围内，随提取时间延长，血风黄酮提取含量先升高后降低，20 min后处于平缓的状态。在提取时间15 min时，黄酮提取含量最大，为49.97 mg/g，超过15 min后，黄酮提取含量逐渐减小。开始提取阶段样品内外存在较高浓度差，溶剂进入细胞而黄酮物质溶出较多；提取时间的延长，促使提取溶剂挥发，杂质溶出，乙醇体积分数也有降低的可能，从而降解部分黄酮，黄酮提取含量下降；提取时间过长，样品内外浓度差趋于一致，提取含量基本保持稳定状态。因此初步确定15 min为该因素最佳水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F004图4提取时间对血风黄酮含量的影响2.3.3液料比对血风黄酮含量的影响（见图5）由图5可知，随液料比不断增大，血风黄酮提取含量呈先上升后下降的趋势，液料比为60 mL/g时，血风黄酮提取含量达到最大，为50.71 mg/g。液料比增加可以使提取的有效成分和提取剂充分接触，促使黄酮物质的溶出；但液料比增大至一定比例后，已浸出的黄酮可以对未浸出的黄酮进行协同浸提，液料比继续增大对于协同浸提不利，而且溶剂过多使其对超声波的吸收产生一定影响，导致血风黄酮提取含量随液料比的增大逐渐降低。因此，初步确定液料比为60 mL/g是该因素的最佳水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F005图5液料比对血风黄酮含量的影响2.3.4超声功率对血风黄酮含量的影响（见图6）由图6可知，超声功率为200 W时，血风黄酮含量可达51.28 mg/g，其他功率条件下的血风黄酮提取含量均较低。提高功率可以增加声波对血风中黄酮物质的溶解，加快了分子间运动，增强提取效果，提高了黄酮提取含量。超声功率超过200 W后，超声功率过高会升高提取溶液的温度，使部分黄酮分解，造成提取液中黄酮的损失。因此初步确定200 W为该试验因素的最佳水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F006图6超声功率对血风黄酮含量的影响2.4响应面优化试验和方差分析结果2.4.1响应面分析法试验设计方案和回归模型的建立响应面试验结果见表4。利用响应面软件Design-Expert 8.0.6对表4数据进行方差分析，结果见表5。将上述所得数据回归拟合得到血风黄酮含量的多元回归方程为：M=52.32-1.90A-0.17B+1.60C+0.74D-0.08AB-1.55AC+0.78AD+0.86BC+0.26BD-0.22CD-3.14A2-3.34B2-2.56C2-3.22D2，表明各变量和血风黄酮含量间存在复杂的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.T004表4响应面试验结果试验号ABCD血风黄酮含量/(mg/g)1-1-10047.832100-142.953010-144.254-100147.135-100-147.7960-10146.5270-10-144.998-110048.09900-1-144.4510010146.8311001-147.6512100145.43131-10044.251401-1043.0715000051.8816-10-1045.6517000053.3218000051.60190-1-1045.69200-11047.782110-1044.3422001148.682300-1146.3524101044.2825110044.1926011048.5927-101051.8028000052.5829000052.2310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.T005表5方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型255.1901418.23051.6600.000 1A43.510143.510123.3200.000 1B0.35010.3500.9800.338 3C30.820130.82087.3400.000 1D6.54016.54018.5400.0007AB0.02610.0260.0730.7916AC9.64019.64027.3200.000 1AD2.46012.4606.9900.019 3BC2.94012.9408.3400.011 9BD0.28010.2800.7800.391 7CD0.19010.1900.5400.476 0A263.770163.770180.7500.000 1B272.440172.440205.3100.000 1C242.530142.530120.5400.000 1D267.440167.440191.1300.000 1残差4.940140.350失拟3.150100.3200.7100.702 8误差1.79040.450总计260.1302851.660注：1.相关系数R2=0.981 0，校正决定系数R2Adj=0.962 0，预测决定系数R2Pred=0.919 5，信噪比22.911。2.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。由表5可知，试验模型达到极显著水平（P0.01），失拟项不显著（P0.05），总决定系数R2为0.981 0、校正决定系数R2Adj为0.962 0，均接近于1，表明模型构建成功。一次项A、C、D，交互项AC、AD、BC和二次项对血风黄酮含量影响均达到显著（P0.05）或极显著（P0.01）水平。根据F值判断各因素影响血风黄酮含量顺序依次为ACDB。2.4.2各因素交互作用对血风黄酮含量的影响（见图7）由图7可知，6个响应面图的曲面图开口向下，均有最高点，并且可以在等高线图最小椭圆中心找到中心点，表明在各因素设置的范围内提取得到的血风黄酮含量有极值存在，因此可以作进一步优化。根据响应面曲面的坡度和等高线的密度，可见各个因素间交互作用对响应值影响的显著性程度顺序依次为ACBCAD；而BD、CD、AB对黄酮含量的影响最小。分析结果与上述回归模型系数的显著性分析结果一致。图7各因素交互作用对血风黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F7a1（a）乙醇体积分数与提取时间对血风黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F7a2（b）乙醇体积分数和液料比对血风黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F7a3（c）乙醇体积分数与超声功率对血风黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F7a4（d）提取时间和液料比对血风黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F7a5（e）提取时间和超声功率对血风黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F7a6（f）液料比和超声功率对血风黄酮含量的影响2.4.3响应面验证试验结果分析使用Design-Expert分析得出血风叶黄酮最佳提取工艺为无水乙醇作为提取剂，乙醇体积分数为55.93%、提取时间为15.38 min、液料比为64.41 mL/g、超声功率205.13 W。结合实际条件的可操作性，适当调整参数为乙醇体积分数56%、提取时间15 min、液料比64 mL/g、超声功率200 W。进行3次平行试验，提取得到血风黄酮含量为（52.52±0.25）mg/g，与理论值53.08 mg/g相比，相对偏差为1.06%，与模型预测拟合效果较好，适用于血风黄酮含量的提取。2.5血风黄酮总抗氧化能力试验结果（见图8）由图8可知，血风黄酮质量浓度在试验剂量范围内与其抗氧化活性呈正相关。初步表明，血风黄酮具有一定的总抗氧化能力，但始终小于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.F008图8不同浓度的血风黄酮及Vc的总抗氧化能力2.6血风黄酮抑菌活性试验结果2.6.1血风黄酮的抑菌圈直径（D）（见表6）由表6可知，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对血风黄酮样品原液都表现为低度敏感（8 mm≤D15 mm）。血风黄酮对大肠杆菌抑制效果较好，其次为金黄色葡萄球菌，而大肠杆菌属于革兰氏阴性菌、金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，硫酸链霉素和氨苄西林钠分别表现出更强的抑菌能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.T006表6血风黄酮的抑菌圈直径项目大肠杆菌金黄色葡萄球菌样品原液9.83±0.589.17±0.57空白对照——阳性对照12.66±0.7612.50±0.50注：“—”表示抑菌圈直径（D）8 mm。2.6.2血风黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度（见表7）由表7可知，阳性对照组无菌膜生长，空白对照组菌膜生长良好，血风黄酮对大肠杆菌的抑制效果优于金黄色葡萄球菌，MIC为1.25 g/L，对金黄色葡萄球菌的MIC为2.50 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.018.T007表7血风黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度项目黄酮浓度/(g/L)空白对照阴性对照阳性对照5.002.501.250.630.31大肠杆菌---++-+-金黄色葡萄球菌--+++-+-注：“-”表示无菌膜生长，“+”表示有菌膜生长。3结论试验采用瑶药血风为原材料，通过超声辅助提取血风黄酮，选择无水乙醇为提取溶剂。考察乙醇体积分数、提取时间、液料比、超声功率这4个因素对超声辅助提取血风黄酮含量的影响。使用Box-Behnken响应面法设计四因素三水平响应面试验优化血风黄酮提取工艺参数，确定乙醇体积分数56%、提取时间15 min、液料比64 g/L、超声功率200 W为超声辅助提取血风黄酮的最佳工艺，提取量达（52.52±0.25）mg/g，相对误差为1.06%，与预测值接近，说明该工艺优化条件稳定可行。对最佳提取条件下的黄酮提取物的抗氧化、抑菌活性进行初步研究。结果表明，血风黄酮具有一定的总抗氧化能力，但在质量浓度为0.1~0.5 g/L时，总抗氧化能力始终低于同等浓度VC的总抗氧化能力；血风黄酮对常用2种受试细菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）均具有一定的抑制效果，在同一浓度下对这大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC分别为1.25、2.50 g/L。本试验表明，瑶药血风具有抗氧化和抑菌双重作用，具有良好的开发利用价值和应用前景，也为瑶药血风活性成分的进一步研究提供参考。