桑叶为小乔木或灌木，树皮呈灰黄色或黄褐色；幼枝有毛，叶互生，卵形至阔卵形[1-3]。桑叶中主要有黄酮类、生物碱类及多糖类等活性物质。现代中医学认为，桑叶具有降血糖、降血压、抗氧化、抗癌、防止动脉硬化等多种功能[4-7]。桑树中有活性的生物碱是一类以1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）[8-10]为主的多羟基哌啶类生物碱，有很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有降血糖功效[11-13]。桑叶生物碱具有较好的抗氧化、抗炎、抑菌、预防高血脂等功效[14-16]，可促进畜禽生长、改善肉品质、提高机体抗氧化能力[17]。而且桑叶中含有单宁和植酸等活性成分，将其作为饲料添加剂不会降低动物对饲料的消化率，能够避免反刍动物胀气[18-19]。本研究以桑叶为原料，采用超声辅助提取桑叶中的生物碱，并对桑叶总生物碱的抗氧化活性及抑菌活性进行研究，旨在为将桑叶开发成安全稳定的功能性饲料提供参考。1材料与方法1.1试剂与仪器1.1.1主要试剂桑叶（自采），1-DNJ标准品（纯度≥98%，成都植标化纯生物技术有限公司），芴甲氧羰酰氯（纯度≥98%，南京都莱生物），甲醇（GR，北京百灵威科技有限公司）；乙腈（GR，安徽天地高纯溶剂有限公司），1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（纯度≥98%，阜阳生物技术有限公司），2, 2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）（纯度≥98%，南京源植生物技术有限公司），抗坏血酸（纯度≥98%，四川依科制药有限公司），无水乙醇、硼酸、氢氧化钾、甘氨酸、乙酸、过硫酸钾、酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、山梨酸均为分析纯。1.1.2主要仪器GW1030型超声波清洗机（深圳市冠博科技有限公司）、LD5-10型离心机（上海亚荣生化仪器厂）、BSA224S-CW型分析天平（多利斯科学仪器）、ZN-02型粉碎机（北京兴时利科技发展有限公司）、LC-2030型液相色谱仪（岛津公司）、DHP-9082型电热恒温培养箱（上海-恒科学仪器有限公司）、LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、SJ-CJ-2FD型超净工作台（苏州苏洁净化设备有限公司）、RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。1.2桑叶中总生物碱的提取及测定1.2.1原料的预处理将桑叶洗净，放入50 ℃烘箱干燥至恒重，用中药粉碎机粉碎后过40目筛网后放入棕色磨口瓶。1.2.2标准溶液与衍生化溶液的配制准确称取18 mg 1-DNJ标准品溶于体积分数70%的甲醇水溶液，定容至100 mL。以体积分数70%的甲醇水溶液稀释成5个不同质量浓度梯度的标准溶液（18、36、54、72、90 mg/L）。依次配制硼酸钾缓冲溶液（BBS）0.4 mol/L、芴甲氧羰酰氯-乙腈溶液5 mmol/L、甘氨酸溶液为0.1 mol/L、乙酸水溶液5%。1.2.3桑叶总生物碱的提取准确称取1.000 0 g桑叶粉末，按照液料比15 mL/g，加入体积分数为60%的乙醇水溶液，在提取温度为70 ℃的条件下超声辅助提取30 min。1.2.4总生物碱含量测定1.2.4.1柱前衍生反应取1-DNJ标准液（或桑叶提取液）200 μL置于离心管中，依次加入100 μL BBS溶液、200 μL芴甲氧羰酰氯-乙腈溶液，搅拌均匀后置于25 ℃水浴20 min，加入100 μL甘氨酸溶液反应20 min，最后加入400 μL乙酸水溶液，搅拌均匀，用0.22 μm过滤器过滤。1.2.4.2高效液相色谱法对生物碱的测定以Intsil C8-3（4.6 mm×150 mm，5 μm）为色谱柱；流动相A为乙腈溶液；流动相B为0.2%磷酸水溶液；A∶B=35%∶65%；柱温25 ℃，检测波长为265 nm；进样量5 μL，扫描时间20 min。1.3桑叶中总生物碱的提取条件优化提取桑叶总生物碱并检测其含量。在上述工艺基础上进行单因素试验，考察各因素对桑叶总生物碱提取量的影响。提取溶剂乙醇体积分数为20%、40%、60%、80%、100%；液料比为10、15、20、25、30 mL/g；提取温度为40、50、60、70、80 ℃；超声时间为20、30、40、50、60 min。据单因素试验的结果与分析，设计正交试验，4个因素分别为乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取温度（C）、超声时间（D），确定提取总生物碱的最佳工艺条件。正交试验水平及因素设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.T001表1正交试验水平及因素设计水平A乙醇体积分数/%B液料比/(mL/g)C提取温度/℃D超声时间/min1401550202502060303602570404703080501.4体外抗氧化活性研究1.4.1DPPH自由基清除试验准确称取DPPH 10 mg于烧杯中，加入50%的乙醇水溶液使DPPH充分溶解，转移至250 mL容量瓶中定容，该溶液现配现用，密封避光保存。将桑叶提取液和维生素C分别稀释配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L系列的溶液。取2 mL桑叶提取液，并加入2 mL的DPPH溶液，混匀后避光反应30 min，用紫外可见分光光度计在波长517 nm处测定吸光度，记为A1；用2 mL的无水乙醇代替DPPH溶液，加入2 mL的桑叶提取液中，作为空白对照，测定并记录吸光度为A2。再用2 mL的无水乙醇代替桑叶提取液，加入2 mL的DPPH溶液，作为阴性对照，测定其吸光度为Ax。每个样品测定3次，求取平均值。在同等条件下测定维生素C对DPPH自由基的清除能力。计算DPPH自由基清除率。清除率=1-A1-A2Ax×100% (1)1.4.2ABTS+自由基清除试验准确称取3 mg ABTS、1 mg K2S2O8，分别用0.8 mL、1.5 mL蒸馏水超声溶解，取以上两种溶液各0.8 mL混合均匀，避光反应16 h，用无水乙醇稀释40倍，室温下在743 nm吸收波长下测定其吸光度为（0.70±0.02），该溶液现配现用，密封避光保存。取2 mL桑叶提取液，并加入2 mL的ABTS溶液，混合均匀后避光反应30 min，用紫外可见分光光度计在波长为743 nm处测定吸光度，记为A1；用2 mL的无水乙醇代替ABTS溶液，置于2 mL的桑叶提取液中，作为空白对照，测定并记录吸光度A2。再用2 mL的无水乙醇代替桑叶提取液，加入2 mL的ABTS溶液，作为阴性对照，测定其吸光度Ax。每个样品测定3次，求取平均值。在同等条件下，测定维生素C对ABTS+自由基的清除能力。1.5抑菌性分析1.5.1提取液预处理按步骤1.3所得最佳工艺条件提取后，5 000 r/min离心机上离心10 min，上清液再经过减压旋蒸后得到浓缩的桑叶中总生物碱提取液（浓缩液的量应小于10 mL）。1.5.2培养基的制备与细菌活化取5.0 g胰蛋白胨、2.5 g酵母浸粉、5.0 g氯化钠、7.5 g琼脂于500 mL干燥锥形瓶中，加入纯净水搅拌至溶解，再用5 mol/L的NaOH溶液调节pH值为7.0~7.4，用耐高温的封口膜密封灭菌。将冷冻的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌用移液管移入培养基，使用涂布玻璃棒将其均匀推开（推开时多次旋转培养皿60°，再重复推开以保证细菌被均匀地涂抹在培养基表面），将培养皿封口后在37 ℃条件下恒温培养24 h，使其活化。用接种环挑取活化后培养基表面的菌种移于配置好培养基的锥形瓶中，用手振荡数分钟使活化的细菌充分转移至锥形瓶的培养液中。1.5.3桑叶提取物抑菌圈测定将培养基液体导入灭菌后的培养皿中（约为培养皿体积的1/3），冷却凝固后，用无菌吸管向培养皿中注入活化后的细菌悬浮液各0.5 mL，用涂布玻璃棒均匀推开后，用镊子夹取滤纸片在提取液、山梨酸对照品溶液、对应乙醇浓度溶液中浸渍5 min，将相应的滤纸片放入培养皿中，每个皿有4个滤纸片，相对放置（其中3个滤纸片为提取液或山梨酸，1个滤纸片为乙醇溶液），做好标记后封口，在37 ℃条件下恒温培养24 h后，观察滤纸片圆片周围抑菌圈，测量抑菌圈直径。1.5.4抑菌性判定标准以抑菌圈的直径作为判断抑菌效果的标准，抑菌性对照见表2[20]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.T002表2抑菌性对照抑菌圈直径敏感程度抑菌性强弱2 mm抑菌圈直径≤7 mm低度敏感一般7 mm认为没有抑菌性7 mm抑菌圈直径≤10 mm中度敏感中等抑菌圈直径10 mm高度敏感较强2结果与分析2.11-DNJ标准曲线测定结果按照1.2.4中方法与条件进行试验，得出1-DNJ峰面积与质量浓度线性拟合方程为A=2.791 22C-1.086，R2=0.999 7（18~90 g/mL），表明线性关系良好。2.2桑叶总生物碱单因素试验结果2.2.1提取液乙醇浓度对总生物碱提取量的影响（见图1）由图1可知，随着乙醇体积分数增大，生物碱的提取量先增加后减少，并在乙醇体积分数为60%时达到最大值。这可能是当乙醇浓度过低时，生物碱类化合物不易溶出，当乙醇浓度过高时，其他醇溶类杂质和色素溶解度增大，导致生物碱的溶出受阻[21]。因此，在提取过程中乙醇的体积分数控制在60%比较合适。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.F001图1乙醇体积分数对总生物碱提取量的影响2.2.2液料比对总生物碱提取量的影响（见图2）由图2可知，在液料比为20、25 mL/g时，桑叶中总生物碱的提取量达到最大，之后提取量随着液料比增大而呈先急剧增加后平缓下降的趋势。这可能是因为当液料比过小时，桑叶中的生物碱浸出不完全；而当液料比过大时，其他活性物质如黄酮、色素等物质也被浸出，影响生物碱类化合物的浸出。综合考虑成本等因素，液料比控制在20 mL/g比较适宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.F002图2液料比对总生物碱提取量的影响2.2.3提取温度对总生物碱提取量的影响（见图3）由图3可知，随着提取温度增加，桑叶中生物碱的提取量会呈现先增加后减少的趋势。当提取温度为60 ℃时，桑叶中生物碱的提取率达到峰值。而出现提取量先增大后减小的趋势可能是因为在一定范围内升高温度有助于提升分子扩散速率，从而增大提取率，但当温度过高时可能会增加其他杂质的浸出率或导致生物碱类化合物变性[21]。因此，提取温度控制在60 ℃为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.F003图3提取温度对总生物碱提取量的影响2.2.4超声时间对总生物碱提取量的影响（见图4）由图4可知，随着超声时间增加，生物碱的提取量呈先增大后减小的过程，超声时间为40 min时，生物碱提取量达到最高。而出现提取率先增大后减小的趋势可能是当提取时间小于40 min时，超声波辅助空化效应不完全导致桑叶中生物碱类化合物未完全浸出；当超声时间大于40 min时，生物碱含量有所降低可能是因为超声时间较长导致生物碱类化合物结构发生变化，或者其他活性物质、色素等浸出量增大，造成生物碱提取量略有降低。因此，初步选择超声提取时间水平为40 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.F004图4超声时间对总生物碱提取量的影响2.3正交试验及方差结果分析在单因素试验基础上设计L16(45)正交试验，以空白列为误差列，试验结果及极差分析见表2，方差分析见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.T004表3正交试验方差分析项目偏差平方和自由度均方F值显著性A1.60330.53414.186*B0.74830.2496.619C0.48930.1634.327D0.19330.0641.708误差0.11330.0381.000注：F值（a=0.05）=9.280。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.T003表2正交试验结果及极差分析项目ABCDE总生物碱提取量/(mg/g)1111114.342122224.713133335.274144443.895212345.256221435.357234125.058243215.339313424.8810324315.2111331245.2812342134.9013414234.1514423144.7115432414.8816441324.34k14.5534.6554.8274.7504.940k25.2454.9954.9354.8674.745k35.0685.1205.0485.0184.918k44.5204.6154.5754.7504.783R0.7250.5050.4730.2680.195由表2、表3可知，影响桑叶提取总生物碱因素的主次顺序为：乙醇体积分数＞液料比＞提取温度＞超声时间。最佳提取条件为：A2B3C3D3，即乙醇的体积分数50%、液料比25 mL/g、提取温度70℃、提取时间40 min。在此工艺条件下进行5次平行试验，可以得到总生物碱的平均提取量为5.69 mg/g。2.4体外抗氧化活性分析2.4.1桑叶中总生物碱对DPPH自由基的清除能力（见图5）由图5可知，桑叶中总生物碱和VC对于DPPH自由基的消除能力随着浓度增加而不断增加。当浓度为1.0 g/L时，桑叶中总生物碱对DPPH自由基消除率达到最大，为85.5%。桑叶中总生物碱和VC对DPPH自由基均具有良好的清除能力，表明生物碱类化合物具有良好的抗氧化能力，而且桑叶中总生物碱对DPPH自由基的清除率明显强于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.F005图5桑叶中总生物碱对DPPH自由基的清除能力2.4.2桑叶中总生物碱对ABTS+自由基的清除能力（见图6）由图6可知，桑叶中总生物碱和维生素C对于ABTS+自由基的消除能力随着浓度增加而不断增加。当浓度为1.0 g/L时，桑叶中总生物碱对ABTS+自由基消除能力达到最大，为96.3%。桑叶中总生物碱和VC对ABTS+自由基均具有良好的清除能力，且桑叶中总生物碱对ABTS+自由基的清除率明显强于VC，具有很好的抗氧化活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.F006图6桑叶中总生物碱对ABTS+自由基的清除能力2.5抑菌性分析（见表4）由表4可知，桑叶中总生物碱对于阳性菌金黄色葡萄球菌及阴性菌大肠杆菌的抑菌圈直径均大于10 mm，表明其对于两种细菌的生长均具有良好的抑制作用。在食品防腐剂山梨酸、60%乙醇水溶液作为对照的情况下，桑叶中总生物碱的抑菌效果强于食品防腐剂山梨酸和60%乙醇水溶液，结果表明，桑叶中总生物碱对细菌的抑制作用较强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.014.T005表4桑叶中总生物碱对供试菌种的抑菌圈直径项目金黄色葡萄球菌大肠杆菌桑叶提取液10.5011.2060%乙醇6.396.21山梨酸9.838.26mm3结论采用超声辅助法提取了桑叶中的总生物碱，通过单因素试验和正交试验得到了桑叶提取总生物碱的最佳提取条件：乙醇体积分数50%、液料比25 mL/g、提取温度70 ℃、超声时间40 min。体外抗氧化活性研究表明，在相同浓度下桑叶总生物碱对于DPPH自由基与ABTS+自由基的清除率均强于VC，具有良好的抗氧化活性。抑菌性研究表明，桑叶总生物碱对阳性菌金黄色葡萄球菌及阴性菌大肠杆菌的抑菌效果大于食品防腐剂山梨酸和60%乙醇水溶液，具有良好的抑菌活性。因此，可以将桑叶中总生物碱进一步开发为天然、低毒、高活性的功能性饲料添加剂。