松针含有粗蛋白、粗脂肪、钙、磷和维生素等营养物质，也含有萜类、黄酮类、木脂素类、糖类等多种化学成分，这些生物活性物质具有抑菌、抗病毒和抗氧化等药理作用[1]。作为动物饲料，松针粉在单胃动物养殖中已取得显著效果[2]，但其在反刍动物饲养中的应用研究较少，且结果不一[3-4]。主要原因是松针中所含精油和单宁等生物活性物质的含量随日粮中松针比例提高而相应增加，使动物养分消化率降低[5]。日粮中添加植物精油或单宁会对体外瘤胃总挥发性脂肪酸浓度造成影响。Golbotteh等[6]研究发现，体外发酵试验中高剂量植物精油能够降低总挥发性脂肪酸浓度，并提高乙酸的比例。李志威等[7]研究发现，百脉根单宁降低了瘤胃氨态氮、酸、丙酸、丁酸的浓度，提高了乙酸/丙酸的比例。本试验采用体外发酵法，以松针和玉米青贮作为瘤胃体外发酵底物，探讨不同比例松针对体外瘤胃发酵的影响，为松针在反刍动物体内试验中应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料选取3只体重（41.20±1.46）kg的哈萨克母羊作为瘤胃液供体。根据《肉羊饲养标准》[8]（NY/T 816—2004）配制日粮。每日于10：00和19：00饲喂2次，自由饮水。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.004.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米青贮30.00消化能/(MJ/kg)11.59小麦秸秆20.00粗蛋白/%13.53玉米27.00中性洗涤纤维/%36.78棉粕3.50酸性洗涤纤维/%19.09麦麸12.00钙/%0.36豆粕5.00磷/%0.31石粉0.50食盐1.00预混料1.00注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 2 000 IU、VD 300 IU、VE 30 IU、铁50 mg、铜15 mg、锰40 mg、锌50 mg、碘1.5 mg、钴0.3 mg、硒0.3 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.2试验设计试验采用单因素试验设计，设置4组发酵底物，将松针和玉米青贮按不同比例组合，松针在发酵底物中所占比例分别为0（对照组）、5%（试验Ⅰ组）、10%（试验Ⅱ组）、15%（试验Ⅲ组），每个处理组设3个重复，同时设置3个空白组以校正发酵产气量。本试验所用松针为樟子松松针，干物质41.85%、消化能10.52 MJ/kg、粗蛋白9.57%、粗脂肪10.60%、中性洗涤纤维49.59%、酸性洗涤纤维34.30%、钙0.48%、磷0.09%。消化能为计算值，其余均为实测值。松针消化能（DE）的估测模型为DE（MJ/kg）=17.211-0.135NDF[9]。1.3培养溶液的配制培养溶液采用Menke等[10]的方法配制，包括微量元素溶液（A液）、碳酸缓冲液（B液）、磷酸缓冲液（C液）、0.1%刃天青溶液（D液）、Na2S还原溶液溶液（E液）。依次加H2O 400 mL、A液0.1 mL、B液200 mL、C液200 mL、D液1 mL、E液40 mL，充分混合，39 ℃水浴，持续通CO2 30 min以上，并调节pH值至6.8左右，直至人工液由蓝色变为红色到无色透明，说明已符合条件。人工瘤胃液配比为瘤胃液∶人工液=1∶2。1.4发酵底物制备将不同比例松针和玉米青贮混合底物于65 ℃烘干，粉碎，过40目筛，取样0.2 g于发酵器中。1.5培养液接种晨饲前采集瘤胃内容物，装入提前预温并充满CO2的保温瓶中，用4层纱布过滤。用100 mL的玻璃注射器作为发酵器。滤液与经39 ℃预热好的培养液以1∶2的比例混合。准确称取4个处理组各约200 mg（DM基础），送入体外产气管底部，加人工瘤胃液30 mL，将玻璃注射器内空气排尽，于39 ℃恒温振荡水浴锅中培养。1.6发酵参数的测定1.6.1pH值发酵结束，采用pH计（雷磁酸度计）测定发酵液的pH值。1.6.2产气量（GP）测定发酵第0、2、4、6、8、12、24、36、48 h的产气量，瘤胃体外产气模型参数采用DPS V7.05软件中一元非线性回归模型（Gompertz模型）进行计算[11]。X2=C1×exp[-C2×exp(-C3×X1)](1)式中：X2为产气量（mL）；C1为理论最大产气量（mL）；C2为产气速率（mL/h）；C3为产气延滞时间（ｈ）；X1为体外培养时间（ｈ）。1.6.3干物质降解率（DMD）、有机物消化率（OMD）发酵残渣使用蒸馏水冲洗干净后，在105 ℃烘箱中烘12 h至恒重，测定干物质降解率。DMD=[(样本干物质重-残渣干物质重+空白干物质重)/样本干物质重]×100%(2)OMD=0.986×GP＋0.0 606×CP＋11.03(3)式中：GP为24 h的产气量（mL）；CP为粗蛋白含量（％）[12]。1.6.4氨态氮（NH3-N）、微生物蛋白（MCP）和挥发性脂肪酸（VFA）浓度取1.0 mL的发酵液在4 ℃，10 000 r/min离心10 min，取上清液加0.3 mL的25%偏磷酸混匀于4 ℃静置30 min，然后10 000 r/min离心10 min，取上清液。发酵液中氨态氮浓度采用苯酚-次氯酸钠比色法[13]；微生物蛋白含量采用考马斯亮蓝法[14]测定；挥发性脂肪酸浓度采用气相色谱法[15]测定。1.7数据统计与分析试验数据用采用Excel 2019软件进行初步处理，SPSS 23.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误（SEM）表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1松针对瘤胃体外发酵液pH值、氨态氮浓度和微生物蛋白浓度的影响（见表2）由表2可知，体外发酵48 h后，各组发酵液的pH值差异不显著（P0.05）；试验Ⅲ组的氨态氮、微生物蛋白氮浓度显著低于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.004.T002表2松针对瘤胃体外发酵液pH值、氨态氮浓度和微生物蛋白浓度的影响项目pH值氨态氮/(mg/100 mL)微生物蛋白/(mg/100 mL)对照组6.2515.70a26.65aⅠ组6.2715.77a28.09aⅡ组6.2915.56a26.88aⅢ组6.3115.26b23.04bSEM0.010.070.63P值0.6720.0180.003注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2松针对瘤胃体外发酵液挥发性脂肪酸浓度的影响（见表3）由表3可知，试验Ⅲ组的总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸的浓度均显著低于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.004.T003表3松针对瘤胃体外发酵液挥发性脂肪酸浓度的影响项目总挥发性脂肪酸/(mmol/L)乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)乙酸/丙酸丁酸/(mmol/L)异丁酸/(mmol/L)戊酸/(mmol/L)异戊酸/(mmol/L)对照组68.06a41.47a17.44a2.388.21a0.84a0.67a0.55aⅠ组68.79a42.53a17.56a2.428.66a0.79a0.63a0.53aⅡ组65.30a40.34a16.40a2.468.65a0.81a0.64a0.54aⅢ组59.12b35.32b14.19b2.496.96b0.68b0.56b0.44bSEM1.390.840.460.030.230.020.010.01P值0.0260.0010.0220.5340.0020.0010.0060.0022.3松针对瘤胃体外发酵产气量、产气参数和干物质降解率的影响（见表4、表5）由表4可知，随着体外产气时间的延长，各处理组产气量逐渐升高，在发酵的第48 h达到高峰。试验Ⅲ组的48 h产气量显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.004.T004表4松针对瘤胃体外发酵产气量的影响项目GP2 hGP4 hGP6 hGP8 hGP12 hGP24 hGP36 hGP48 h对照组4.007.0011.0013.3318.67a25.67a31.67a35.33aⅠ组4.007.6710.3315.0018.33a24.33ab29.67ab32.33abⅡ组3.677.6710.6713.3315.67b22.67b27.33b31.32abⅢ组5.007.509.0012.0015.33b22.33b24.33b28.00bSEM0.240.230.330.470.530.630.880.97P值0.2410.7280.1320.1470.0130.0220.0100.027mL由表5可知，试验Ⅲ组理论最大产气量显著低于对照组（P0.05）；试验Ⅲ组产气速率显著低于其他组（P0.05）。试验Ⅲ组的干物质降解率显著低于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.22.004.T005表5松针对瘤胃体外发酵产气参数和干物质降解率的影响项目最大产气量/mL产气速率/(mL/h)产气滞留时间/h干物质降解率/%有机物消化率/%对照组34.54a2.20a0.1049.58a37.72aⅠ组30.51ab2.08a0.1148.27a35.42abⅡ组31.65ab2.15a0.1248.44a33.78bⅢ组27.77b1.85b0.1045.10b33.45bSEM0.960.140.010.570.61P值0.0020.0370.0700.0050.0223讨论3.1松针对瘤胃体外发酵液pH值、氨态氮浓度和微生物蛋白浓度的影响保持稳定的瘤胃pH值对确保最佳的瘤胃发酵和微生物生长至关重要。反刍动物瘤胃发酵pH值以6.2~6.8为最佳[16]。本试验中，各组瘤胃发酵pH值在6.25~6.31之间，均处于正常值范围内。细菌和原生动物将瘤胃中的蛋白质快速降解为肽、氨基酸和氨态氮。氨态氮浓度可反映瘤胃微生物对含氮物质的摄取和利用情况[17]。研究表明，瘤胃微生物生长最适氨态氮浓度应在0.35~33.92 mg/100 mL[18]。本试验中，各组氨态氮浓度在15.26~15.77 mg/100 mL之间，均在正常范围内。本试验中，15%松针组的氨态氮浓度显著低于其他组，可能是随着松针在日粮中比例的增加，植物精油和单宁含量逐渐提高所致。一般认为，植物精油降低脱氨酶的活性和氨的浓度的原因是其抑制了瘤胃超级产氨菌。库倩倩等[19]在体外瘤胃发酵试验中发现，100、150、200 mg/L的松针精油均可降低发酵液中氨态氮浓度。此外，单宁还可与发酵底物中的蛋白质结合，降低瘤胃微生物对蛋白质的分解产生氨的效率[20]。反刍动物瘤胃中微生物蛋白浓度直接体现饲料中氮的利用情况，提供了反刍动物50%左右的小肠可吸收蛋白[20-21]。本试验中，15%松针组的微生物蛋白浓度显著降低，表明瘤胃内氨态氮的利用率受到了影响，其原因可能是高浓度的精油可使瘤胃微生物生长受到抑制[22]。也有研究报道，高浓度单宁可直接影响微生物的细胞膜通透性，从而降低微生物蛋白含量[23]。3.2松针对瘤胃体外发酵液挥发性脂肪酸的影响碳水化合物发酵产生挥发性脂肪酸，可提供反刍动物60%以上的能量需要，是反刍动物重要的来源。总挥发性脂肪酸产量下降，不利于反刍动物营养。乙酸、丙酸和丁酸约占总挥发性脂肪酸的95%，若添加植物精油能够降低乙酸比例并且增加丙酸比例，则被视为精油对体外发酵有利。某些植物精油及其组分会改变各挥发性脂肪酸的比例[24]。Kim等[25]进行体外发酵发现，发酵底物中加5%的松针提取物降低了总挥发性脂肪酸产量、乙酸、丙酸和丁酸浓度。库倩倩等[19]的体外发酵试验结果也表明，松针精油浓度提高会导致总挥发性脂肪酸浓度相应降低，当松针精油达到200 mg/L时显著下降。本试验结果与之相似，15%松针组总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸浓度显著降低。可能是由于松针精油抑制了瘤胃微生物以及细胞间酶活性，从而降低了总挥发性脂肪酸的浓度[26]。高水平单宁可抑制微生物对植物细胞壁的分解作用[27]，单宁对瘤胃总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸浓度的影响与其来源有关。赵栋等[28]试验表明，葡萄籽单宁对绵羊瘤胃液总挥发性脂肪酸、乙酸和其他酸浓度无显著影响。Battelli等[29]研究也表明，缩合单宁和水解单宁对瘤胃总挥发性脂肪酸浓度无影响。而李志威等[7]发现，百脉根单宁可降低瘤胃总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸和丁酸的浓度，提高乙酸/丙酸的比例。因此，松针单宁对瘤胃挥发性脂肪酸浓度影响还有待进一步研究。3.3松针对瘤胃体外发酵产气量和底物干物质降解率的影响产气量可反映瘤胃微生物活性。当发酵底物中的营养物质有利于微生物生长时，产气量会相应提高。体外产气量能够直观地反映饲料在瘤胃内的降解程度[30]。干物质降解率反映饲料的可利用率。高浓度的植物精油和单宁会使瘤胃微生物的生长受到影响，随着精油和单宁比例增加，微生物活性被抑制的程度也不断增强[31]。本试验表明，15%松针组的产气量、产气速率和干物质降解率显著降低，其原因是较高水平的松针精油和单宁对瘤胃内微生物及原生动物产生抑制作用，从而降低了瘤胃产气量和干物质降解率。4结论本试验条件下，松针占发酵底物比例为15%时，氨态氮浓度、挥发性脂肪酸浓度、产气量和干物质降解率均下降，表明对体外瘤胃发酵产生了负面影响。因此，松针对体外瘤胃发酵特性的影响还需进一步探讨。