硒是动物正常生长发育所必需的微量元素之一，在提高畜禽免疫功能、繁殖性能、生长性能和改善肉品质等方面发挥重要作用。亚硒酸钠是动物中应用最早、最广泛的无机硒补充剂；有机硒一般包括富硒食用菌、硒酵母、纳米硒等。与无机硒相比较，有机硒具有生物利用度高、安全性高、环境污染少等优点。目前，动物饲料中添加有机硒越来越普遍。断奶仔猪饲料中添加富硒蘑菇粉能够显著增加盲肠乳酸菌的相对丰度，降低瘤胃球菌的相对丰度[1]。饲料中添加硒酵母能够显著提高皖东黄牛血清总胆红素含量和血清总抗氧化能力[2]。补充硒酵母能够极显著增加羔羊采食量、肌肉中碳水化合物含量，极显著降低肌肉中脂肪含量[3]。日粮中补充0.45 mg/kg硒酵母能够显著增加50周龄繁殖公鸡的精子活力和射精量[4]。目前普遍利用物种特异性DNA微阵列技术阐明硒酵母影响动物特定组织的基因表达谱和细胞功能的机理。摄食含2 mg/kg硒酵母的日粮，虹鳟鱼肝脏中许多DEGs富集到脂质代谢、碳水化合物代谢和氧化磷酸化途径[5]。日粮中补充0.2 mg/kg硒酵母可以显著调节三黄鸡胸肌和大腿肌中肌肉纤维相关基因的表达水平（P0.05），改善肉质[6]。目前，关于补充硒酵母对畜禽生长发育等方面的研究较多，而硒酵母对肉鸡肝脏组织基因表达的分子机理的研究较少。本研究从GEO数据库获取基因表达谱数据集并进行生物信息挖掘，从分子水平探究硒酵母影响肉鸡肝脏组织DEGs的作用机理，为深入研究硒酵母对畜禽生长发育及健康调控机制提供参考。1材料与方法1.1芯片数据本研究数据来自美国国家生物信息中心GEO数据（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），编号：GSE 25151。其试验设计是从奥伯迪斯巴赫商业孵化场获得32只健康、体重接近一致的1日龄罗斯308肉仔公鸡，随机分为2组，每组16只，采用单层笼养方式饲养，自由采食和饮水。基础日粮参照美国NRC（1994）肉鸡营养需要量自行配制，1~21 d日粮代谢能13.39 MJ/kg、粗蛋白23.00%、钙1.00%、有效磷0.45%、赖氨酸1.10%、蛋氨酸0.50%、胱氨酸0.40%；22~42 d日粮中代谢能13.39 MJ/kg、粗蛋白钙20.00%、钙0.90%、有效磷0.35%、赖氨酸1.00%，蛋氨酸0.38%、胱氨酸0.34%。日粮中硒含量利用荧光法测定[7]。硒酵母添加剂购自奥尔泰克公司，补硒组在基础日粮中添加25 g/100kg硒酵母形式的有机硒，对照组硒实测值为70 μg/kg，补硒组硒含量为620 μg/kg[8]。饲喂35 d，每组各选取体重接近的5只肉鸡屠宰，分别测定对照组和补硒组肉鸡肝脏中的基因表达谱，样品表达量检测平台为GPL 3213。原作者仅筛选出DEGs做热图分析，本文利用DAVID 2021软件、STRING数据库及Cytoscape 3.9.1软件对GSE 25151基因表达谱数据深入分析，挖掘潜在的生物信息。1.2DEGs筛选及数据分析利用GEO数据库提供的GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）分析GSE 25151表达谱数据集，初步得出阈值标准P0.05且|log2FC|1的差异表达转录本，进一步筛查出注释完整且无重复的DEGs。利用DAVID 2021（https://david.ncifcrf.gov）对筛查出的DEGs进行GO生物学过程富集和KEGG通路分析。使用STRING数据库（https://cn.string-db.org）构建DEGs间的PPI，将互作数据导入Cytoscape 3.9.1软件，利用CytoHubba插件的BottleNeck、Between、Degree和Stress算法筛选出PPI网络中的前10个DEGs。利用维恩（http://bioinformatics.psb.ugent.be/Webtools/Venn/）对上述4种算法筛选出的PPI网络中前10个DEGs生成维恩图，最后筛选共同枢纽基因。此外，还利用MCODE插件挖掘出PPI网络中潜在的功能模块。2结果与分析2.1筛选DEGs筛选出表达上调的差异表达转录本有378个，其中366个有完整注释为DEGs，12个无注释；表达下调的差异表达转录本有240个，其中234个有完整注释为DEGs，6个无注释；在筛选的上调基因中，差异倍数对数（log2FC）变化在3~4、2~3和1~2的DEGs分别为6、82、278个；在筛选的下调基因中，log2FC变化在-4、-2~-3、-1~-2的DEGs分别为3、52、179个；上调基因中log2FC最大值是富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子4（SRSF4）（log2FC=3.55，P=2.9×10-4）；下调基因中log2FC最小值是细胞色素p450酶超家族成员（CYP2C8）（log2FC=-5.51，P=2.2×10-3）。2.2GO生物学过程富集与KEGG通路分析DEGs的GO生物学过程富集分析见图1。DEGs的KEGG通路富集分析见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.016.F001图1DEGs的GO生物学过程富集分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.016.F002图2DEGs的KEGG通路富集分析由图1可知，共有18个生物学过程显著富集。其中精子轴丝组件、精子鞭毛运动和piRNA代谢过程与生殖细胞精子有关，心脏发育、肢体发育与肌肉结构发育与组织器官发育有关；神经元迁移与神经元投射形态形成与神经系统组织有关；内质网应激反应中内在凋亡信号通路、腺苷酸环化酶激活G蛋白偶联受体信号通路、G蛋白偶联受体信号通路和Notch信号通路等5个生物学过程与信号传导有关；钙离子内流正调节和细胞钙离子稳态过程与钙离子有关。由图2可知，共有13条显著富集的通路。其中钙信号通路和神经活性配体受体相互作用，心肌细胞中肾上腺素能信号、磷脂酰肌醇信号系统、细胞外基质受体相互作用5个KEGG通路与信号转导或信号分子相互作用。代谢途径、谷胱甘肽代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、肌醇磷酸盐代谢、嘌呤代谢、花生四烯酸代谢6个KEGG通路与氨基酸、糖、核苷酸和脂质等物质代谢有关。2.3蛋白互作网络构建、枢纽基因及功能模块筛选（见图3、图4）在STRING数据库中构建包含546个节点和905个边的PPI网络，见图3（a）。将互作数据结果导入Cytoscape软件中，利用CytoHubba插件的BottleNeck、Between、Degree、Stress 4种算法筛选出PPI网络中的前10个DEGs，见图3（b）~3（e），生成维恩图，见图3（f）。最后筛选出6个共同的枢纽基因，分别为纤连蛋白1（FN1）、磷脂酶Cγ1（PLCG1）、肌球蛋白ⅢA（MYO3A）、整合素亚基α8（ITGA8）、赖氨酸去甲基化酶6A（KDM6A）、ATPase质膜Ca2+转运2（ATP2B2）。图3DEGs的PPI图构建及6个枢纽基因筛选10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.016.F3a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.016.F3a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.016.F3a3利用MCODE插件挖掘出PPI网络中存在的前4个功能模块（见图4）。模块1~4的MCODE评分依次为6.00、5.60、5.00和4.40。图44个功能模块筛选注：菱形为种子基因。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.016.F4a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.016.F4a2通过DAVID对各模块的基因进行GO生物学过程富集分析和KEGG通路分析，结果见表1。模块1包括7个节点和18个边，显著富集在胞浆钙离子浓度调节、声音感官感知、沿肌动蛋白丝进行囊泡运输、细胞钙离子稳态、肌动蛋白丝组织5个生物学过程和心肌细胞中肾上腺素能信号、钙信号通路2个KEGG通路中；模块2包括6个节点和14个边，显著富集在有丝分裂DNA复制检测点、有丝分裂G2DNA损伤检测点、电离辐射反应3个生物学过程和同源重组KEGG通路中；模块3包括5个节点和10个边，显著富集在磷脂酰肌醇3-激酶信号传导正调节、炎症反应负调节2个生物学过程和黏着斑KEGG通路中；模块4包括6个节点和11个边，仅在真核生物核糖体生物合成KEGG通路中显著富集。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.016.T001表14个功能模块基因的GO生物学过程和KEGG通路富集分析模块数据库生物学过程/通路基因数P值模块1GO胞浆钙离子浓度调节30.001声音感官感知30.001沿着肌动蛋白丝进行囊泡运输20.007细胞钙离子稳态20.022肌动蛋白丝组织20.038KEGG心肌细胞中肾上腺素能信号20.025钙信号通路20.04410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.016.T002续表1　4个功能模块基因的GO生物学过程和KEGG通路富集分析模块数据库生物学过程/通路基因数P值模块2GO有丝分裂DNA复制检测点20.002有丝分裂G2 DNA损伤检测点20.006电离辐射反应20.006KEGG同源重组20.007模块3GO磷脂酰肌醇3-激酶信号传导正调节20.016炎症反应负调节20.017KEGG黏着斑20.007模块4KEGG真核生物核糖体生物合成30.0013讨论饲料中补充有机硒有利于动物健康，提高生产性能。富硒畜禽产品能够解决缺硒给人们带来的健康问题。本研究从GEO数据库获取GSE 25151基因表达谱数据集，筛选出符合条件的差异表达转录本618个，其中有完整注释表达上调和下调的DEGs分别有366、234个，有9个DEGs的|log2FC|3，反映出补充硒酵母后从鸡肝脏中筛选到log2FC变化较大的DEGs较少，推测可能与不同硒源形式有关；未注释的差异表达转录本18个，初步推测是新的基因，有待进一步研究。3.1DEGs的功能注释和生物学解释功能富集分析可以揭示DEGs的潜在功能类别，DEGs的GO注释揭示一些与生殖细胞精子形成、组织器官发育以及钙离子G蛋白介导信号转导通路相关的生物学过程。精子轴丝组件、精子鞭毛运动和piRNA代谢过程与生殖细胞精子有关。精子轴丝组件是最显著富集的生物学过程，精子鞭毛是运动的驱动力，轴丝是精子鞭毛的中心结构。钙离子主要通过精子质膜上相关的钙离子通道对精子运动进行调节[9]。缺硒会降低畜禽精子活力，增加精子结构异常，补充有机硒可获得高质量的精液[10]。心脏发育、肢体发育、肌肉结构发育与组织器官发育有关。饲料中添加0.6 mg/kg硒酵母，白羽肉鸡鸡胸肉中氨基酸总量显著高于对照组（P0.05）[11]。饲料中添加0.3 mg/kg硒酵母能够显著提高4月龄育肥期公湖羊日增重，改善羊肉品质（P0.05）[12]。此外，神经元迁移、神经元投射形态发生与神经系统组织有关。小鼠敲除模型证实神经前体细胞摄取硒元素是运动介导神经元发生的关键[13]。上述研究表明，补充硒酵母可使钙离子相关生物学过程中的多数基因表达上调，激活机体内复杂的信号调控系统，促进鸡的生殖系统、心脏、肢体发育、肌肉结构发育和神经系统等组织器官的生长发育。对DEGs进行KEGG通路富集分析，进一步揭示了DEGs的生物学功能[14]。本研究中显著富集通路主要与信号传导、物质代谢和肌肉收缩有关。其中钙信号通路、神经活性配体受体相互作用和代谢途径通路主要与信号传导和物质代谢联系紧密。钙信号通路是P值最小、最重要的通路，能够显著富集5个通路，原因与信号转导或信号分子的相互作用有关。与氨基酸、糖、核苷酸和脂质等物质代谢有关的通路有6个。5周龄组和42周龄组的藏鸡肺组织上调的DEGs富集结果与钙信号通路有关[15]。寿光鸡骨骼肌中上调的DEGs能够显著富集到糖酵解/糖异生、钙信号通路和氨基酸生物合成等物质代谢过程通路[16]。牛肉肌内脂肪组织有关的DEGs能够富集到神经活性配体-受体相互作用的通路和钙信号通路[17]。机体硒水平及硒源形式均可影响硒蛋白表达，从而构成复杂的信号调控网络[18]。本研究中有4个KEGG通路中均为上调DEGs，6个KEGG通路中上调DEGs占绝大多数，说明补充硒酵母能够显著富集到通路中，能够使多数基因表达上调，从而激活动物器官正常发育所依赖的各种复杂信号调控网络，增强不同组织器官中的糖、脂、蛋白质和核酸等物质代谢过程，有利于肉鸡的生长发育。3.2枢纽基因及功能模块的作用机理分析网络分析已成为生物信息学分析中重要的一部分，通过各个节点在网络中的拓扑性质能够很好地诠释该节点的功能。将DEGs导入STRING数据库中构建了包含546个节点和905个边的PPI网络，利用Cytoscape中CytoHubba插件提供的4种算法筛选出PPI网络中的前10个DEGs，通过维恩图筛选出6个重要的共有枢纽基因。其中，FN1参与细胞迁移、黏附、伤口愈合和宿主防御等，在胚胎发育和器官形成等多个生命过程中发挥重要作用[19]。FN1标记的兴奋性神经元主要局限于小鼠海马腹侧下托，可作为研究下托主细胞异质性的指标[20]。PLCγ1能够显著减少缺陷型小鼠海马锥体神经元和纹状体多巴胺受体D1表达神经元的抑制性传递，表明PLCγ1对突触功能和可塑性尤为重要[21]。小鼠神经元祖细胞特异性敲除PLCγ1能够在胚胎发育过程中导致中脑背侧部分的轴突导向缺陷[22]。MYO3A属于肌球蛋白基因超家族，可以直接调节肌肉细胞表达和分化[23]。Myo3A在肌动蛋白突起中产生一个尖端导向力，ATP酶与肌动蛋白结合、尾部与膜的相互作用对于介导突起动力学非常重要[24]。ITGA8是鸡表观代谢能相关的核心基因之一，可以作为鸡表观代谢能和饲料转化率的生物标记物[25]。斑马鱼模型神经肥大毛细胞中存在ITGA8复合体，能够导致纤毛生物合成和内吞失调[26]。敲除KDM6A基因的雌性小鼠可出现轻度贫血和血小板减少[27]。KDM6A突变体诱导产生严重的细胞表型，DNA损伤以及有丝分裂缺陷增加[28]。随着雏鸡年龄的增长，ATP2B2在十二指肠、空肠和回肠中表达均增强[29]。ATP2B2基因富集到离子跨膜转运体活性，是参与深低温循环停止期间仔猪大脑保护的关键功能途径之一[30]。上述4种方法筛选出的6个枢纽基因可能代表了具有重要生物调控功能的关键候选基因。利用MCODE插件共挖掘出PPI网络中潜在的17个模块，为生物信息分析提供一个更加明确的方向。其中前4个模块MCODE评分≥4，其余13个模块中包含的节点及边较少或者模块评分较低。模块1基因在心肌细胞中肾上腺素能信号和钙信号通路显著富集，模块1的种子基因为VLGR1，编码黏附G蛋白偶联受体家族成员。VLGR1缺失导致小鼠组织和细胞中线粒体结合的内质网膜结构改变，内质网到线粒体的Ca2+瞬时调控失调[31]。心肌细胞β-肾上腺素能受体与其激动剂结合后，Ca2+流入、肌浆Ca2+释放再摄取等能力增加，心肌收缩力和心肌松弛率增强[32]。揭示添加硒酵母有助于细胞钙离子流动加强，增强心脏功能，有利于鸡的生长发育。模块2基因在同源重组通路中显著富集，种子基因RAD51编码RAD51蛋白家族成员。苏木化缺陷型RAD51突变体表达将导致RAD51正常功能减少，促进DNA同源重组修复[33]。成年小鼠中RAD51诱导敲除导致减数分裂双链断裂累积，粗线期精母细胞数量减少[34]。揭示添加硒酵母有助于细胞加强同源重组和DNA修复能力，加快细胞正常增殖，促进动物生长发育。模块3基因富集炎症反应负调节生物学过程和黏着斑通路，种子基因HGF编码分泌蛋白。HGF过表达可以减轻小鼠口腔溃疡面积和炎症，表现出较高水平的循环炎性细胞因子[35]。黏着斑对于细胞迁移有关的免疫反应至关重要[36]，揭示补充硒酵母可以减轻炎症反应，提高免疫力。模块4基因仅显著富集在真核生物核糖体生物合成通路中，种子基因TBL3编码含有保守WD40重复序列的蛋白质，参与rRNA加工和核糖体生物合成[37-39]。推测硒酵母上调TBL3基因表达，通过增强核糖体生物合成能力，增加机体蛋白质合成，促进鸡的生长发育。4个模块基因富集分析表明，添加硒酵母可以增强鸡心脏功能、加快细胞正常增殖，减轻炎症反应，提高免疫力，增加机体蛋白质合成。心肌细胞中肾上腺素能信号、钙信号通路、同源重组、黏着斑、真核生物核糖体生物合成是添加硒酵母影响鸡生长发育和健康的关键途径。4结论本研究从GEO数据库获取GSE 25151基因表达谱数据集并进行生物信息挖掘，筛选出与硒酵母有关的差异表达基因600个，进行GO生物学过程富集、KEGG信号通路分析及PPI分析，筛选出6个枢纽基因和4个基因模块，通过分析其分子作用机理，为深入研究硒酵母对肉鸡生长发育及健康的调控机制提供参考。