由于中草药制剂具有天然、功效多、低毒副作用等优点，受到畜牧养殖业的广泛关注。中草药饲料添加剂能够有效改善畜产品品质，提升畜禽的抗应激能力和免疫力[1-2]。肉鸡的生长速度快，饲养过程中容易在外部的刺激下产生应激，引发疾病甚至是死亡，因此可以通过在日粮中添加中草药增强机体的抗氧化能力，提高肉鸡的免疫力，降低发病率，从而提高肉鸡的生产性能和经济效益[3]。菊粉又称菊糖，属于一种无法被消化的可降解的天然功能性膳食纤维，广泛存在于菊苣、芋、韭菜、洋葱等植物中[4]。研究表明，菊粉可以调节肠道微生物菌群，改善肠道的酸碱环境，增加肠道内有益细菌的数量和种类，提高机体抗氧化性能等生理功能[5-7]。此外，菊粉还能够促进机体吸收矿物质并合成维生素，提高新陈代谢速率，增强机体抵抗疾病的能力[8-9]。本试验旨在研究日粮中添加菊粉对肉鸡生长性能、肠道形态和盲肠微生物的影响，为菊粉在肉鸡生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料菊粉，有效成分含量≧90%，购自西安圣青生物科技有限公司。28日龄无基础疾病的817肉鸡购自江苏省南京市高淳区某鸡场。1.2试验设计选取108只28日龄体重相近的817肉鸡随机分为3组，每组6个重复，每个重复6只鸡。A组（对照组）肉鸡饲喂基础日粮，B组、C组分别在基础日粮中添加0.5%、1.0%菊粉。基础日粮组成及营养水平见表1。试验期14 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米62.07代谢能/(MJ/kg)13.19豆粕23.00粗蛋白/%19.60玉米蛋白粉6.00钙/%0.95豆油4.00有效磷/%0.39石粉1.20赖氨酸/%1.20磷酸氢钙2.00蛋氨酸/%0.45L-赖氨酸盐酸盐0.35蛋氨酸+胱氨酸/%0.76DL-蛋氨酸0.08食盐0.30预混料1.00注：1.预混料购自南京可莱威生物科技有限公司。2.营养水平均为计算值。1.3饲养管理试验对肉鸡笼养，定期对鸡舍进行消毒清理，鸡舍温度控制在21~25 ℃之间，相对湿度60%~70%，保持通风。肉鸡自由采食、饮水，具体饲养管理参照817肉鸡饲养标准。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能每天记录每个重复试验817肉鸡的采食量，统计饲料消耗量，计算平均日采食量（ADFI）。于试验第1、14 d称取每个重复中肉鸡体重，计算肉鸡的平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。ADFI=(F1+F2+F3+…+F14)/t (1)ADG=(Mt-M0)/t (2)F/G=(F1+F2+F3+…+F14)/(Mt-M0)(3)式中：Mt为肉鸡末重（g），M0为肉鸡初重（g），t为饲养时间（d），F为采食量（g），F1为试验第1 d肉鸡的采食量，以此类推。1.4.2肠道形态在试验第14 d，每个处理中选取6只平均体重相近的鸡进行屠宰。在无菌条件下，采集肉鸡的盲肠内容物，分别装在冻存管内，于-80 ℃冰箱保存，用于检测盲肠内容物。将肉鸡的十二指肠、空肠和回肠分离，剪取3~5 cm的十二指肠、空肠和回肠肠段，放入4%多聚田醛溶液中固定24 h，用石蜡包埋。使用Image Pro Plus软件测量肠段绒毛高度（VH）、隐窝深度（CD），计算绒毛高度/隐窝深度比值（绒隐比，VH/CD）。将十二指肠、空肠和回肠中段石蜡包埋块切片，贴片与烤片，切片脱蜡与水化，使用苏木精-伊红（HE）染色法进行染色，置于倒置荧光显微镜（OLYMPUS CKX53，日本）下观察并拍照。1.4.3盲肠微生物菌群测序在无菌条件下收集盲肠内容物送至基迪奥生物科技有限公司进行检测，基于Illumina平台上利用双端测序（PE250）的方法对盲肠内容物菌群基因组进行测序以及生物信息学分析，利用16S RNA测序技术分析测定肉鸡盲肠微生物群[10-14]。1.5数据统计与分析使用Office、Excel对试验数据进行整理，测序数据通过Omicemart软件进一步分类和分析，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和总标准误（SEM）表示，并对组间数据进行Welch's T检验分析，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1日粮中添加菊粉对肉鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，各组肉鸡的ADFI、ADG和F/G差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.T002表2日粮中添加菊粉对肉鸡生长性能的影响项目M0/(g/只)Mt/(g/只)ADFI/[g/(只·d)]ADG/[g/(只·d)]F/GA组681.351 272.2181.6542.041.94B组681.601 276.4682.3542.491.93C组680.781 270.8780.7342.081.91SEM0.405.043.461.780.05P值0.820.160.610.480.592.2日粮中添加菊粉对肉鸡肠道形态的影响（见表3）由表3可知，与A组相比，B组、C组的肉鸡十二指肠和空肠的VH和VH/CD值显著提高（P0.05），与B组相比，C组肉鸡的十二指肠VH显著增加（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.T003表3日粮中添加菊粉对肉鸡肠道形态的影响项目十二指肠空肠回肠VH/μmCD/μmVH/CDVH/μmCD/μmVH/CDVH/μmCD/μmVH/CDA组870.32c83.0910.47b418.26b39.9210.47b375.8435.4210.61B组927.41b82.5311.23a536.13a42.3512.65a384.7334.5911.12C组987.64a85.1211.60a540.74a41.6212.99a391.4333.7811.58SEM89.653.411.8657.934.432.2931.566.241.35P值0.010.350.020.040.630.020.090.810.34注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.3日粮中添加菊粉对肉鸡盲肠微生物菌群丰度和α多样性的影响（见表4、表5）本试验通过广州基迪奥生物科技有限公司的高通量测序平台对A组、B组和C组选出的共计18只肉鸡的盲肠内16S细菌可变的V3+V4区进行检测。由表4可知，试验共获得2 304 559条有效序列，2 299 092条高质量序列，19 458个OTUs。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.T004表4数据预处理及OTUs数量统计结果组别Raw ReadsClean ReadsOTUsA1133 281133 003888A2124 261123 9731 091A3122 156121 859758A4135 541135 2581 113A5123 409122 999905A6120 865120 566934B1134 172133 899794B2133 795133 497648B3123 136122 8811 149B4127 881127 5721 269B5132 417132 1181 228B6121 989121 6541 352C1132 792132 4621 280C2126 065125 7611 304C3132 347132 0141 114C4127 872127 6341 028C5130 350130 0101 320C6122 230121 9321 283注：Raw PE是原始的Pair End Reads对数；Clean PE是经过质控过滤后得到的高质量Pair-end Reads对数。由表5可知，与A组相比，B组、C组的Sobs、Chao值均上升，其中C组的Sobs、Chao值显著高于A组（P0.05），其中Good_coverage的值均大于0.99，达到了样本低丰度OTU的几乎全覆盖情况，覆盖较好；Sobs和Chao值的上升可以反映出样本物种丰度更具多样性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.T005表5α多样性指数结果项目SobsChaoGoods_coverageA组948.1671 056.4210.995 2B组1 073.3331 192.1140.994 7C组1 221.5001 340.3070.993 8P值（A组vs B组）0.3610.3360.601P值（A组vs C组）0.0040.0030.0852.4日粮中添加菊粉对肉鸡盲肠微生物β多样性的影响样本间Beta多样性指数分析见图1。由图1（a）可知，与A组相比，B组、C组热度颜色越来越趋于红色，表明物种间的相似度越来越小，变化程度越来越大。由图1（b）可知，与A组相比，B组和C组样本在物种的变化程度和丰度上均有较为明显的差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F001图1样本间Beta多样性指数分析注：利用R语言的Pheatmap包，以热图形式展示组间Unweighted-Unifrac、Weighed-Unifrac指数。基于unweighted_unifrac距离的Anosim分析结果见表6。由表6可知，A组与B组相比较的R值0.25，表明A组与B组间的差异较小，A组与C组相比较的R值0.75，表明A组与C组间有较大的差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.T006表6基于unweighted_unifrac距离的Anosim分析结果组别R值P值显著性A组-vs-B组0.411 10.024*A组-vs-C组0.885 20.004**注：R值为差异程度，一般介于（0，1）之间；P值0.05表明本次检验的可信度高；“*”表示P0.05，“**”表示P0.01。2.5Beta多样指数的PCoA散点分析结果（见图2）由图2可知，使用Weighted Unifrac进行配对，其中第一主要成分贡献值为42.51%，第二主要成分贡献值为15.70%，两个成分贡献值相加后占比接近50%，一般两个维度的贡献值之和达到50%比较好，A组、B组、C组的生物群落组成相似，但与A组相比，C组与A组的差异较大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F002图2Beta多样指数的PCoA散点分析结果2.6日粮中添加菊粉对肉鸡盲肠微生物各分类水平上序列构成的影响（见图3、图4）由图3、图4可知，每个肉鸡盲肠样品在科和属的分类水平上的Tags序列百分比和数目比较多，而在其余5个分类水平上的Tags序列百分比和数目居少。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F003图3盲肠微生物在各分类水平上的相对丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F004图4盲肠微生物在各分类水平上的序列构成针对科水平分类的情况进行统计，结果见图5。图5科水平物种分布堆叠图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F5a1（a）个体间物种分布 （b） 组间物种分布由图5可知，与A组相比，B组和C组肉鸡盲肠普雷沃氏菌科、莫拉氏菌科和肠杆菌科的相对丰度明显增加，而丹毒丝菌科和瘤胃球菌科相对丰度明显降低。与B组相比，C组肉鸡盲肠链球菌科相对丰度明显增加。属水平circos分析结果见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F006图6属水平circos分析由图6可知，A组、B组、C组盲肠的粪杆菌属、普拉梭菌和瘤胃球菌的丰度均占比较多。与A组相比，B、C组盲肠罕见小球菌属和丹毒丝菌属的相对丰度明显下降，但埃希氏菌-志贺氏菌和普氏菌属的相对丰度明显增加。与B组相比，C组盲肠链球菌属相对丰度明显增加。2.7肉鸡盲肠微生物的Venn、LEfSe与Indicator分析科水平Venn分析见图7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F007图7科水平Venn图由图7（a）可知，A组有2种特有的细菌科，B组有15种特有的细菌科。由图7（b）可知，A组有3种特有的细菌科，C组有14种特有的细菌科。A组VS B组、A组VS C组Venn图特有细菌科分析结果见表7、表8。由表7、表8可知，与A组相比，B、C两组中都出现了拟杆菌科（Bacteroidaceae）、拜叶林克氏菌科（Beijerinckiaceae）、双歧杆菌科（Bifidobacteraceae）、柄杆菌科（Caulobacteraceae）、螺杆菌科（Helicobacteraceae）等，其中拟杆菌科(Bacteroidaceae)、螺杆菌科（Helicobacteraceae）、螺旋体科（Spirochaetaceae）的指示性强，C组双歧杆菌科（Bifidobacteraceae）、螺旋体科（Spirochaetaceae）、韦荣球菌科（Veillonellaceae）的指示性远高于B组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.T007表7A组vs B组Venn图特有细菌科分析项目A组B组Acholeplasmatales_bacterium_canine_oral_taxon_31660Rubritaleaceae10Bacteroidaceae016Beijerinckiaceae05Bifidobacteriaceae06Caulobacteraceae01Chitinophagaceae01Corynebacteriaceae01Helicobacteraceae010Micromonosporaceae01Rikenellaceae03Sphingobacteriaceae01Sphingomonadaceae02Spirochaetaceae014Staphylococcaceae01Veillonellaceae040Weeksellaceae0110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.T008表8A组vs C组比较Venn图特有细菌科分析项目A组C组Mitochondria10Pseudomonadaceae10Rhizobiaceae10Aeromonadaceae01Bacteroidaceae015Beijerinckiaceae04Bifidobacteriaceae014Caulobacteraceae01Helicobacteraceae014Marinifilaceae01Rikenellaceae01Sphingobacteriaceae02Sphingomonadaceae02Spirochaetaceae032Veillonellaceae069Weeksellaceae01Xanthobacteraceae02分别将A组与B、C两组进行LEfse分析进行比较，见图8。由图8可知，A组的差异性物种数目最多。在A、B和C三组两两比较时，发现C组与A组的差异更为明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F009图8LEFse差异分析结果（b）A组vs C组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F008（a）A组vs B组属水平分组biomarker气泡分析结果，见图9。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.007.F010图9属水平分组biomarker气泡分析结果由图9可知，将3组进行Indicator分析比较，与A组相比，B组和C组的普雷沃菌属和不动杆菌属指示性远远大于A组，三组间的经黏液真杆菌属（Escherichia-Shigella）、丹毒丝菌属（Erysipelatoclostridium）和链球菌属（Streptococcus）的指示性差异显著（P0.05），其余菌属的指示性无明显差异。3讨论3.1日粮中添加菊粉对肉鸡生长性能的影响目前，菊粉作为饲料添加剂对动物生长性能的影响不尽相同。研究发现，日粮中添加菊叶和菊粉对肉鸡的生长性能无明显促进作用[15]。Zhou等[16]发现，在麻鸡饲粮中添加甘露寡糖对体重也无显著影响，但甘露寡糖添加量达到0.5 g/kg时，极显著降低了试验后期和全期麻鸡的饲料消耗量。还有研究发现，在日粮中联合使用功能性寡糖与抗菌肽能够提高肉鸡的平均日增重和体重，可显著降低试验各期肉鸡的料重比[17]。张艳[8]研究表明，在日粮中添加0.3%和0.8%对肉鸡生长性能具有促进作用。陈泽等[18]、李海英等[19]研究发现，日粮中菊粉添加量为0.6%~0.8%之间对肉鸡生产性能的影响效果最明显。本试验发现，各组肉鸡的平均采食量、平均日增重和料重比的差异不显著，与上述研究不一致。原因可能是本试验从肉鸡28日龄开始饲喂，试验期可能不够长，菊粉作用尚未完全发挥。3.2日粮中添加菊粉对肉鸡肠道形态的影响肠道是消化吸收的主要场所小肠黏膜是营养物质吸收的主要场所，也是抵御外来病毒、有害微生物的重要防线。小肠绒毛长度会直接影响小肠吸收面积和酶活性[20]。研究表明，VH、CD和VH/CD是衡量肠道消化吸收营养物质的能力以及健康状况的重要指标[21-22]。肠道绒毛边缘会分泌多种消化酶，因此VH越高，动物分泌消化酶能力愈强，消化吸收能力也愈强。CD反映了细胞生成率，隐窝浅代表细胞成熟率提高，肠道分泌功能增强。VH/CD越高表明肠道消化吸收能力越强，VH/CD值降低表明畜禽肠道的消化吸收能力减弱。有研究发现，饲粮中添加菊粉可以改善了肉鸡十二指肠VH、VH/CD，降低空肠的VH、CD与VH/CD，降低回肠的VH和CD，但VH/CD增加[23]。吴丽飞等[24]研究发现，日粮中添加迷迭香提取物能够提高肉鸡肠道VH，表明机体对营养物质的吸收加强。本试验发现，与A组相比，B组、C组均对肉鸡十二指肠和空肠的VH和VH/CD的作用较为显著，对CD作用不明显，回肠中的各组间VH、CD、和VH/CD差异均不明显，表明在饲粮中添加菊粉能提高肉鸡对营养物质的吸收能力，且C组对肠道改善效果优于B组。3.3日粮中添加菊粉对肉鸡盲肠微生物菌群的影响研究肠道的相对丰度和多样性对研究菊粉对肠道微生物菌群的影响具有重要意义。郑立康等[25]研究发现，在饲粮中添加0.1%、0.2%和0.3%的棉籽低聚糖均能增加白羽肉鸡的厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、蓝细菌门等优势菌属丰富度和多样性。本试验发现，试验组的肉鸡盲肠菌群多样性指数有明显提高，菌群丰富度有所增加，与Vandeputte等[26]的结果一致，表明菊粉的添加可以促进肉鸡肠道微生物的生长，提高其肠道内环境的稳定性和肠道健康指数。本试验发现，饲粮中添加菊粉增加肉鸡肠道的普雷沃氏菌和不动杆菌属的细菌丰度。普雷沃氏菌属是脊椎动物的肠道重要基石种属，包括50多个亚种，普雷沃氏菌有助于肠道分解蛋白质和碳水化合物。因此，推测添加菊粉可在一定程度上促进了肉鸡肠道的消化吸收功能，能够提高肉鸡盲肠微生物相对丰度。菊粉通过吸收肠道内脂肪形成脂肪-纤维复合物，最后通过粪便排出，从而降低血脂水平。菊粉中的益生元和肠道细菌在发酵过程中会产生大量短链脂肪酸，短链脂肪酸由肠道上皮细胞吸收进入血液，可以为机体提供能量，调节肠上皮细胞的增殖、分化和迁移，影响脂质代谢和糖代谢[27]。张璐等[28]观察高脂饲料中添加菊粉对小鼠肠道菌群的影响，结果发现，添加菊粉小鼠粪便中含有的细菌DNA量增多，短链脂肪酸含量增加，在添加菊粉的小鼠粪便中可以获得多种菌科，如毛螺菌科、S247菌科等，表明高脂饮食情况下短链菊粉的添加会改变小鼠肠道菌群，继而影响肠道菌群的功能。兰鲲鹏[29]在卵形鲳鲹的饲料中添加菊粉，观察卵形鲳鲹肠道内微生物的结构变化，结果表明，饲料中添加菊粉能够增加卵形鲳鲹肠道内部分有益菌的数量，与本试验结果相似。肉鸡肠道微生物菌群的健康直接影响着肉鸡的生长性能和免疫力[30]。有研究表明，盲肠细菌如双歧杆菌、乳酸菌和放线菌等有利菌群对肉鸡肠道菌群平衡和抗菌作用起重要的作用[31]。本试验发现，菊粉在一定的添加量下，能够有效地提高肉鸡盲肠微生物菌群的多样性及结构。但目前还没有明确的标准来规定菊粉的最佳添加量，因此未来的研究应该重点探讨不同添加量下，菊粉对肉鸡盲肠微生物菌群的影响，在生产实践中，应该根据具体情况选择合适的添加方式和添加量，以达到最佳的效果。4结论本研究结果表明，在日粮中添加菊粉对肉鸡的生长性能无显著影响，但可以促进肉鸡肠道的发育，添加菊粉可明显提高肉鸡盲肠菌群的丰富性与多样性，促进肠道优势细菌的生长。综合分析，肉鸡日粮中添加1%的菊粉较为适宜。