目前，已知的氨基酸种类超过200种，在饲料中比较常见的有17种，包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸等，其中含硫氨基酸如胱氨酸（cystine，Cys）和蛋氨酸（methionine，Met）对畜禽的生长发育具有显著的影响，在动物养殖过程中合理配制畜禽日粮，可以有效改善畜禽的肉品质，提高生产性能，降低饲养成本[1-3]。随着饲料质量安全要求日益严格，监控饲料中含硫氨基酸的含量至关重要。通常酸水解法[4]能够测定蛋白质中的绝大多数氨基酸，但其会破坏部分含硫氨基酸，使检测结果偏低[5-6]；氧化水解法[7-9]主要是将含硫氨基酸中的胱氨酸[(Cys)2]氧化水解为磺基丙氨酸（cysteic acid，CysA）、将Met氧化水解为蛋氨酸砜[methionine sulfone，Met(O)2]，经离子交换色谱分离后检测。不确定度是指由于存在测量误差，而对测量结果不确定的程度，是对结果质量进行定量说明的一个参数，可用于衡量测定结果的准确性[10-12]。本文依据GB/T 15399—2018[13]离子交换色谱法对牧草粗饲料中的含硫氨基酸进行测定，并对其测定结果进行不确定度评定，为此试验方法在实验室饲料质量控制中的应用提供参考。1材料与方法1.1仪器与试剂S4300氨基酸分析仪（北京塞卡姆）、MS205DU万分之一精密电子天平（梅特勒-托利多公司）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、平行蒸发仪-旋转蒸发仪联用型（BUCHI）。L-CysA标准品（批号21110040，纯度99.3%，坛墨质检科技股份有限公司）、L-Met(O)2标准品（批号22100116，纯度99.9%，坛墨质检科技股份有限公司）。盐酸、氢氧化钠均为优级纯，甲酸浓度为88%，氢溴酸浓度为48%，氨基酸分析仪专用试剂（钠系统缓冲溶液，北京塞卡姆），水为一级纯水。样品为市售牧草粗饲料。1.2试验方法1.2.1仪器工作参数色谱柱为LCA K06/Na离子交换柱。流动相：柠檬酸钠A=0.04 mol/L，pH值3.45；B=0.066 7 mol/L，pH值10.85；D为再生液。梯度洗脱：0~3.5 min，100% A；3.5~12.0 min，100%~85% A；12.0~18.0 min，85%~80% A；18.0~24.0 min，80%~67% A；24.0~28.0 min，67%~20% A；28.0~30.0 min，20% A；30.0~31.0 min，80%~100% B；31.0~42.0 min，100% B。流速：洗脱泵0.45 mL/min；衍生泵0.25 mL/min。温度：柱温58~47 ℃梯度控温；衍生化温度150 ℃。检测波长：570 nm。1.2.2标准物质溶液的制备精密称取标准物质L-CysA、L-Met(O)2适量，置于10.0 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，分别配制成浓度为0.820、0.925 mg/mL的储备液。分别精密吸取上述储备液各0.1 mL于10 mL容量瓶中，使用钠系统样品稀释液稀释并定容至刻度，得到L-CysA、L-Met(O)2混合标准物质溶液。1.2.3样品前处理方法依据GB/T 15399—2018进行样品前处理，得供试品溶液。1.3测量不确定度的数学模型及来源分析1.3.1数学模型试样中(Cys)2、Met含量以其质量分数w（g/100 g）表示，计算的数学模型为：wi=n×Ai×V×c×Mi×VstAst×m×Vi×Mst×100 (1)式中：Ai为试样溶液中CysA、Met(O)2峰面积；V为试样水解液体积（mL）；c为标准工作液中CysA、Met(O)2浓度（mg/mL）；Vi为试样溶液进样体积（μL）；n为试样水解液稀释倍数；Vst为氨基酸标准溶液进样体积（μL）；Ast为氨基酸标准溶液中CysA、Met(O)2的峰面积；m为试样质量（mg）；Mi为(Cys)2、Met的摩尔质量（g/mol），M(Cys)2=240.3，MMet=149.2；Mst为CysA、Met(O)2的摩尔质量（g/mol），MCysA=169.16，MMet(O)2=181.21。1.3.2不确定度来源分类根据测定含硫氨基酸含量的数学模型及实际测量过程[14-16]，其测量不确定度的来源主要有氨基酸摩尔质量引入的相对不确定度urel(M)；样品前处理过程中其称量urel(m1)和定容urel(m2)引入的相对不确定度urel(m)；标准物质配制过程中其纯度urel(p1)、称量urel(p2)、定容和稀释urel(p3)引入的相对不确定度urel(p)；样品测定重复性引入的相对不确定度urel(r)；方法回收率引入的相对不确定度urel(Rec)。为明确试验流程中对检测结果可能产生影响的各种因素的关联性，将检测过程用鱼骨图表示，见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.023.F001图1不确定度来源分析过程2结果与分析2.1氨基酸摩尔质量的相对不确定度urel（M）(Cys)2、Met、CysA和Met(O)2的分子式分别为C6H12N2O4S2、C5H11NO2S、C3H7NO5S、C5H11NO4S，通过合成各组成元素原子量的不确定度即可得到上述分子的摩尔质量的不确定度。依据原子量表[17]（2009 IUPAC），得到每一个元素的相对原子质量和不确定度，按矩形分布进行处理（k=3），具体见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.023.T001表1氨基酸摩尔质量的相对不确定度urel（M）结果项目相对原子质量不确定度标准不确定度碳（C）12.010 7（最小12.009 6，最大12.011 6）±0.001 000.0013=0.000 580氢（H）1.007 94（最小1.007 84，最大1.008 11）±0.000 140.000 143=0.000 081氧（O）15.999 4（最小15.999 03，最大15.999 77）±0.000 370.000 373=0.000 210氮（N）14.006 7（最小14.006 43，最大14.007 28）±0.000 420.000 423=0.000 240硫（S）32.065（最小32.059，最大32.076）±0.008 500.008 53=0.004 900根据表1可合成得到(Cys)2、Met、CysA和Met(O)2的摩尔质量的相对不确定度，属于B类评定，结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.023.T002表2氨基酸的摩尔质量及其相对不确定度项目分子式摩尔质量/(g/mol)标准不确定度u(M)相对不确定度urel(M)(Cys)2C6H12N2O4S2240.300 50.010 4900.000 043 65CysAC3H7NO5S169.156 40.005 3400.000 031 57MetC5H11NO2S149.211 30.005 7830.000 038 76Met(O)2C5H11NO4S181.210 10.005 8290.000 032 172.2样品前处理引入的相对不确定度urel(m)2.2.1样品称量引入的相对不确定度urel(m1)本次测定的牧草粗饲料样品为均匀的粉末，具充分的代表性，产生的不确定度可忽略不计。电子天平称量引入的不确定度属于B类评定，根据校准证书得到称量所用的万分之一电子天平最大允许误差为±0.05 mg，服从均匀分布（k=3），则其标准不确定度为u1(m1)=0.05/3=0.028 9 mg，天平分辨率为0.01 mg，区间半宽度为0.005 mg，服从均匀分布，故分辨率引入的标准不确定度u2(m1)=0.005/3=0.002 89 mg。由以上两项合成为一次样品称量的不确定度为u(m1)=u12m1+u22m1=0.028 92+0.002 892=0.0290 mg。称量不确定度应重复计算两次，一次为空盘，一次为盘加样品，样品称样量约75 mg，故样品称量的相对不确定度为urel(m1)=2×u(m1)/m=2×0.029 0/75=0.000 55。2.2.2样品定容体积引入的相对不确定度urel(m2)试验中牧草粗饲料样品水解完成后，定容至50 mL容量瓶中，过滤后吸出2.0 mL水解液，蒸干，定容至2.0 mL。试验所用50 mL容量瓶、2 mL分度吸量管均为A类玻璃器皿，其相对不确定度属于B类评定，主要由量具的校准不确定度及温度不确定度构成。50 mL容量瓶、2 mL分度吸量管的最大容量允差可通过《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[18]得到，量具的不确定度见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.023.T003表3量具的不确定度项目移取或定容体积/mL允许的最大误差/mL校准不确定度/mL温度不确定度/mL相对不确定度50 mL容量瓶50±0.050 00.056=0.020 4150×2.1×10-4×33=0.018 190.020 412+0.018 19250=0.000 552 mL分度吸量管2.0±0.01 20.0126=0.004 902.0×2.1×10-4×33=0.000 730.004 902+0.000 7322.0=0.002 4810 mL容量瓶10.0±0.02 00.0206=0.008 1610×2.1×10-4×33=0.003 640.008 162+0.003 64210.0=0.000 8920~200 μL移液枪0.100±0.00 20.0026=0.000 820.1×2.1×10-4×33=0.000 0360.000 822+0.000 03620.100=0.008 17注：体积假设分布为三角分布（k=6）；温度假设分布为均匀分布（k=3）；溶剂为水，膨胀系数2.1×10-4/℃[19]；实验室配备空调，温度波动范围为（20±3）℃。由表3得到样品前处理过程中体积引入的相对不确定度为urel(m2)=0.000 552+0.002 482+0.002 482=0.003 54。将上述2项不确定度合成，得到样品前处理引入的相对不确定度为urel(m)=urel2m1+urel2m2=0.000 552+0.003 542=0.003 59。2.3标准物质引入的相对不确定度urel(p)2.3.1标准物质纯度引入的相对不确定度urel(p1)CysA标准物质纯度为99.3%，不确定度为0.5%，假定为矩形分布（k=3），则纯度引入的相对标准不确定urel(p1CysA)=0.5/99.3/3=0.002 91，属于B类评定。Met(O)2标准物质纯度为99.9%，不确定度为0.5%，假定为矩形分布（k=3），则纯度引入的相对标准不确定urel[p1Met(O)2]=0.5/99.9/3=0.002 89，属于B类评定。2.3.2标准物质称量引入的相对不确定度urel(p2)电子天平称量引入的不确定度属于B类评定，根据校准证书得到称量所用的万分之一电子天平最大允许误差为±0.05 mg，服从均匀分布（k=3），则其标准不确定度为u1(p2)=0.05/3=0.028 9 mg，天平分辨率为0.01 mg，区间半宽度为0.005 mg，服从均匀分布，故分辨率引入的标准不确定度u2(p2)=0.005/3=0.002 89 mg。由以上两项合成为一次样品称量不确定度为：u(p2)=u12p2+u22p2=0.028 92+0.002 892=0.029 0 mg。称量不确定度应重复计算两次，一次为空盘，一次为盘加样品，CysA标准物质称样量为8.26 mg，其相对不确定度urel(p2CysA)=2×u(p2)/mCysA=2×0.029 0/8.26=0.004 97；Met(O)2标准物质称样量9.26 mg，其相对不确定度urel[p2Met(O)2]=2×u(p2)/ mMet(O)2= 2×0.029 0/9.26=0.004 43。2.3.3标准物质定容、稀释引入的相对不确定度urel(p3)试验用10.0 mL量瓶配储备液，之后用20~200 μL移液枪和10 mL量瓶配制工作液，所用玻璃器皿均为A类，其相对不确定度属于B类评定，主要由量具的校准不确定度及温度不确定度构成。10 mL容量瓶的最大容量允差可通过《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[18]得到，20~200 μL移液枪的最大容量允差可通过《移液器》（JJG 646—2006）[20]得到，具体标准不确定度见表3。得到配制过程体积引入的相对不确定度urel(p3)=0.000 892+0.008 172+0.000 892=0.008 27。由以上3项合成为标准物质配制过程引入的相对标准不确定度为urel(p)=urel2p1+urel2p2+urel2p3，urel(pCysA)=0.002 912+0.004 972+0.008 272=0.010 08，urel[pMet(O)2]=0.002 892+0.004 432+0.008 272=0.009 82。2.4测定重复性引入的相对不确定度urel（r）按测定方法，对7份牧草粗饲料样品进行测定，u(r)=S(w)/7，urel(r)=u(r)/w¯，属于A类评定，具体结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.023.T004表4重复性测定的相对不确定度项目测定值均值w¯/(g/100 g)测定值标准偏差S(w)/(g/100 g)标准不确定度u(r)/(g/100 g)相对标准不确定度urel(r)(Cys)20.390.006 550.006 55/7=0.002 480.002 48/0.39=0.006 35Met0.210.004 470.004 47/7=0.001 690.001 69/0.21=0.008 052.5方法回收率引入的相对不确定度urel(Rec)因样品前处理不完全或处理过程中(Cys)2和Met的损失，对已知含量的牧草粗饲料样品进行加标试验（n=7），添加量(Cys)2为0.18 g/100 g，Met为0.12 g/100 g。(Cys)2回收率为95.83%~103.47%，根据u2=(b++b-)2/12计算，其中b+=0.034 7，b-=0.041 7，得到相对标准不确定度urel[Rec(cys)2]=(0.041 7+0.034 7)/12=0.022 05；Met回收率96.45%~104.29%，根据其中b+=0.042 9，b-=0.035 5，得到相对标准不确定度urel(RecMet)=(0.035 5+0.042 9)/12=0.022 63；属于B类评定。2.6含硫氨基酸含量测定的合成标准不确定度和扩展不确定度通过对上述各不确定度分量进行合成，得到合成相对标准不确定度：urel=urel2M+urel2m+urel2p+urel2r+urel2Rec合成标准不确定度为u(w)=urel×w，具体见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.023.T005表5合成标准不确定度项目urel(Mi)urel(Mst)urel(m)urel(p)urel(r)urel(Rec)urelu(w)(Cys)20.000 043 650.000 031 570.003 590.010 080.006 350.022 050.025 320.39×0.025 32=0.009 87Met0.00 003 8760.000 032 170.003 590.009 820.008 050.022 630.026 200.21×0.026 20=0.005 50按照《化学分析测量不确定度评定》（JJF 1135—2005）[21]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[22]的要求，各成分质量分数的扩展不确定度为U=u(w)×k，一般测量可以取k=2。因此，U(Cys)2=0.009 87×2=0.019 74，UMet=0.005 50×2=0.011 00。需要注意的是扩展不确定度的修约通常只进不舍，且有效位数最多为2位，给定的测量结果位数应与其保持一致。故测定的牧草粗饲料中(Cys)2含量的结果为（0.39±0.02） g/100 g，Met含量的结果为（0.21±0.02） g/100 g。3讨论目前，不确定度评定已被广泛应用于食品[23]、药品[24]、土壤[25]、饲料[26]等多个领域的分析检测，不确定度的评定能够判断饲料中营养物质是否不足[27]、猪肉有害物质是否超限[28]。本试验对表5不确定度各分量的分析可见，方法回收率urel(Rec)和标准溶液配制urel(p)的相对不确定度数值较大，是测量误差的主要来源；样品前处理urel(m)和样品测定重复性urel(r)的影响较小；氨基酸摩尔分子质量引入的不确定度urel(M)基本可以忽略。张云等[29]、张敏[30]试验表明，标准溶液的配制和加标回收率是不确定度的主要来源，与本试验结果一致。《判定规则和符合性声明指南》（CNAS-GL015：2022）[31]指出，扩展测量不确定度越大，错误接受的风险越高。因此，可通过分析各不确定度分量，采取有效措施降低检验检测结果合格判定的风险。对于标准溶液配制引入的不确定度，可正确选择有证标准物质，适当加大标准品称样量，使用精度高的天平和量具，简化标准溶液的配制步骤，保证标准物质配制过程尽可能精准。此外，在实际检测分析中，为保证样品回收率应该加强培训，提高检测人员的技能水平，规范试验操作过程，减少样品前处理过程中的可能出现的各种损失，以确保检测结果的准确性。4结论本试验依据GB/T 15399—2018标准测定了牧草粗饲料中含硫氨基酸的含量，并对测定过程的不确定度分量进行计算，最终合成总不确定度。结果显示，牧草粗饲料中(Cys)2的含量为0.39 g/100 g，其扩展不确定度为0.02 g/100 g；Met含量为0.21 g/100 g，扩展不确定度为0.02 g/100 g，加标回收率和标准溶液的配制是其测量误差的主要来源。