女贞子（Fructus ligustri L.）是女贞的成熟果实，又名女贞实、白蜡树子、冬青子等[1-2]，主要分布于我国华东、华南、西南及华中各地，是我国传统中药[3-4]。研究发现，女贞子中富含多糖、萜类化合物、黄酮等主要活性成分[5-7]。女贞子中黄酮类化合物含量较高，该化合物具有抗菌、降血糖、保护肝脏、增强免疫以及抗氧化等多种药理活性[8-10]。总黄酮作为天然的饲料抗氧化剂能够显著提高畜禽的生长性能，增强动物机体免疫力，促进动物体内脂代谢进程，提高机体抗氧化能力[11-13]。赵小伟等[14]研究表明，给泌乳中期荷斯坦奶牛补饲150 g/d女贞子，可以显著提高泌乳奶牛乳脂含量，显著降低血液中甘油三酯含量，调节奶牛脂类代谢。Rsgaaqe等[15]研究表明，在青贮饲料中添加女贞子总黄酮提取液可以显著提高山羊的产奶量、改善其生长性能和免疫功能。因此，女贞子总黄酮提取物作为一种新型饲料添加剂具有较大开发价值和广阔的应用前景。目前，关于植物中黄酮的提取方法主要有超声波提取法[16]、回流提取法[17]、微波提取法[18]、酶提取法[19]等。酶提取法是利用生物酶对样品细胞壁中的纤维素等成分进行降解，促进黄酮类化合物溶出，提取条件温和、效率高[20]。超声波提取法是利用声波产生高速、强烈的空化效应和搅拌作用，破坏植物细胞，促使黄酮类化合物溶出，提取时间短、黄酮得率高[21]。超声波-酶协同提取法同时具备2种方法的优点，已被广泛应用于植物天然产物的提取领域中。采用超声波与纤维素酶协同作用提取女贞子中总黄酮的报道较少。基于此，本文以女贞子为原料，采用超声波-酶协同提取女贞子中总黄酮，并对其提取工艺进行优化，为女贞子在饲料生产中的开发与利用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂女贞子：湖南省湘西自治州农业科学研究所提供。芦丁标准品，纯度≥98.0%（合肥博美生物科技有限责任公司）；维生素C（VC，定州百克赛斯生物科技有限公司）；纤维素酶，活性400 U/mg（南宁庞博生物工程有限公司）；DPPH（福州飞净生物科技有限公司）；ABTS（上海联迈生物工程有限公司）；氢氧化钠，分析纯（沧州巴蒂恰化工产品有限公司）；硝酸铝、乙醇、浓盐酸、冰醋酸、过二硫酸钾、亚硝酸钠等均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。1.2仪器设备UH4150紫外可见分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）、TGF-9075A电热恒温鼓风干燥箱（北京维根技术有限公司）、DFY-200A高速固体样品粉碎机（上海达洛科学仪器有限公司）、XPR10电子分析天平（瑞典百欧林科技有限公司）、300 mm标准试验筛（上海过望化工有限公司）、SMART系列超纯水仪（北京普析通用仪器有限责任公司）、KYX-480HQG超声清洗机（重庆科亦欣贸易有限公司）。1.3试验方法1.3.1样品预处理将女贞子样品放入50 ℃烘箱中烘干，使用粉碎机研磨后过300 mm筛。取适量样品于索氏提取仪中，采用沸点为30~60 ℃石油醚萃取3次，脱脂处理后晾干放入洁净玻璃器皿中保存。1.3.2样品中总黄酮的提取准确称取1.0 g经脱脂处理的女贞子样品粉末于100 mL锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液，加入纤维素酶，加入缓冲溶液调节pH值至5.5，在50 ℃水浴锅中酶解55 min，沸水浴中灭酶5 min后冷却至室温。在一定温度下进行超声提取45 min，提取期间每间隔5 min取出剧烈振荡1次，超声功率150 W。提取完毕后8 500 r/min离心15 min，取上清液即为黄酮提取液。1.3.3样品中总黄酮含量的测定精确称取已烘至恒重的芦丁标准品5 mg（精确至0.01 mg）于50 mL棕色容量瓶中，采用70%乙醇溶液定容至刻度，于超声波中辅助溶解，即得质量浓度为0.1 g/L标准储备液。使用移液枪分别吸取0、100、200、300、400、500 μL于10 mL容量瓶中，分别用70%的乙醇溶液补充至4 mL左右，依次加入0.5 mL的5% NaNO2溶液，摇匀后静置10 min，加入0.5 mL的10%Al(NO3)3溶液，摇匀后静置10 min，加入4 mL的4% NaOH溶液，摇匀后静置10 min，使用70%的乙醇溶液定容至刻度，摇匀后静置10 min，于510 nm处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.896 6x+0.075 6（R2=0.999 96）。吸取1 mL女贞子黄酮提取液于10 mL容量瓶中，按照标准曲线的步骤进行显色反应，其黄酮含量计算公式为：黄酮提取得率=c×f×Vm×1 000×100% (1)式中：c为待测液样品中总黄酮含量（g/L）；f为稀释倍数；V为定容体积（mL）；m为女贞子样品质量（g）。1.3.4单因素试验1.3.4.1乙醇浓度对女贞子中总黄酮提取得率的影响准确称取1.0 g经脱脂处理的女贞子样品粉末于100 mL锥形瓶中，以液料比20 mL/g加入一定浓度乙醇溶剂，继续加入浓度为0.3 g/L纤维素酶，酶解完毕后放入超声辅助提取仪中提取，浸提温度为50 ℃，分别考察60%、70%、80%、90%和100%乙醇浓度对女贞子中总黄酮提取得率的影响。1.3.4.2液料比对女贞子中总黄酮提取率的影响准确称取1.0 g经脱脂处理的女贞子样品粉末于100 mL锥形瓶中，按照一定液料比加入80%乙醇溶剂后继续加入浓度为0.3 g/L纤维素酶，酶解完毕后放入超声辅助提取仪中提取，浸提温度为50 ℃，分别考察10、15、20、25、30 mL/g液料比对女贞子中总黄酮提取率的影响。1.3.4.3纤维素酶对女贞子中总黄酮提取率的影响准确称取1.0 g经脱脂处理的女贞子样品粉末于100 mL锥形瓶中，按照20 mL/g液料比加入80%乙醇溶剂后，继续加入一定浓度的纤维素酶，酶解完毕后放入超声辅助提取仪中提取，浸提温度为50 ℃，分别考察0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L不同浓度的纤维素酶对女贞子中总黄酮提取率的影响。1.3.4.4超声辅助提取温度对女贞子中总黄酮提取率的影响准确称取1.0 g经脱脂处理的女贞子样品粉末于100 mL锥形瓶中，按照20 mL/g液料比加入80%乙醇溶剂后，继续加入0.3 mg/L浓度的纤维素酶，酶解完毕后放入超声辅助提取仪中提取，分别考察40、45、50、55、60 ℃超声辅助浸提温度对女贞子中总黄酮提取率的影响。1.3.5响应面试验在单因素试验基础上选取乙醇浓度（A）、纤维素酶浓度（B）、超声辅助提取温度（C）为优化因素，以女贞子中总黄酮提取率为响应值，采用Box-Behnken的原理设计三因素三水平响应面试验，因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.T001表1响应面试验因素水平设计水平A乙醇浓度/%B纤维素酶浓度/(g/L)C超声温度/℃-1700.2450800.3501900.4551.3.6女贞子总黄酮的抗氧化活性研究1.3.6.1DPPH自由基清除试验参考文献[22]的方法进行女贞子总黄酮对DPPH自由基的清除试验，以VC为阳性对照，计算IC50。DPPH自由基清除率计算公式为：DPPH自由基清除率=1-A1-A2A0×100% (2)式中：A0为2 mL 100 mg/L DPPH溶液+2 mL无水乙醇的吸光度；A1为2 mL 100 mg/L DPPH溶液+2 mL样品溶液的吸光度；A2为2 mL无水乙醇+2 mL样品溶液的吸光度。1.3.6.2ABTS+自由基清除试验参考文献[23]的方法进行女贞子总黄酮对ABTS+自由基的清除试验，以VC为阳性对照，计算IC50。ABTS+自由基清除计算公式为：ABTS+自由基清除率=1-A1-A2A0×100% (3)式中：A0为5 mL ABTS溶液+1 mL去离子水的吸光度；A1为5 mL ABTS溶液+1 mL样品总黄酮提取液的吸光度；A2为6 mL去离子水+1 mL样品总黄酮提取液的吸光度。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1乙醇浓度对女贞子总黄酮提取率的影响（见图1）由图1可知，随着提取溶剂乙醇浓度的提高，女贞子总黄酮提取率呈先上升后降低的趋势。当乙醇浓度为80%时，女贞子总黄酮提取率达到最大值，为4.98%。黄酮类化合物极性较低，当乙醇浓度小于80%，随着乙醇浓度的提高，其极性逐渐降低，根据相似相容原理，乙醇浓度在60%~80%范围内，总黄酮提取率随乙醇浓度提高而上升；当乙醇浓度大于80%时，继续增加乙醇浓度，女贞子中有大量脂溶性与醇溶性物质溶出，与黄酮目标物溶出形成竞争性抑制作用[24]，故女贞子总黄酮提取率反而降低。因此，选择70%、80%、90%乙醇浓度进行响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.F001图1乙醇浓度对女贞子总黄酮提取率的影响2.1.2液料比对女贞子总黄酮提取率的影响（见图2）由图2可知，当液料比为10~20 mL/g，随着液料比的提高女贞子总黄酮提取率呈现出急剧提高趋势；当液料比为20~30 mL/g时，女贞子总黄酮提取率反而降低。可能是随着提取溶剂用量的逐渐增加，女贞子中总黄酮能够更加顺利溶出，故在一定范围内总黄酮提取率呈现出急剧增加趋势[25]；过量的提取剂可能会溶出大量杂质，阻止了总黄酮的溶出，故女贞子中总黄酮提取率有所降低。因此，选择液料比为15、20、25 mL/g进行响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.F002图2液料比对女贞子总黄酮提取率的影响2.1.3纤维素酶浓度对女贞子总黄酮提取率的影响（见图3）由图3可知，随着纤维素酶浓度的增加女贞子总黄酮提取率呈现先增加后降低的趋势。当纤维素酶浓度在0.1~0.3 g/L时，随着纤维素酶浓度增加女贞子总黄酮提取率逐渐上升；当纤维素酶浓度为0.3 g/L时，女贞子总黄酮提取得率达到最大值，为4.88%；继续增加纤维素酶浓度时，女贞子总黄酮提取率反而降低。原因是当酶浓度较低时，增加纤维素酶浓度，有助于酶破解样品细胞壁，促使目标提取物黄酮溶入溶剂中，故随着酶用量增加总黄酮提取得率上升；当纤维素酶浓度大于0.3 g/L时，总黄酮提取得率反而降低，其原因是酶解部分纤维素和过多的酶附着在女贞子粉末上，阻碍了总黄酮溶出。因此，选择0.2、0.3、0.4 g/L纤维素浓度进行响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.F003图3纤维素酶浓度对女贞子总黄酮提取率的影响2.1.4超声温度对女贞子总黄酮提取率的影响（见图4）由图4可知，随着提取温度升高总黄酮提取率呈先增大后降低的趋势。当提取温度为40~50 ℃时，随着提取温度升高总黄酮提取率上升；当提取温度为50 ℃时，总黄酮提取率达到最大值，为5.01%；当提取温度大于50 ℃时，继续提高提取温度，总黄酮提取率反而降低。原因是在提取温度较低时，提高提取温度有助于分子间的热力学运动加速，从而促进总黄酮的溶出[26]；当提取温度大于50 ℃时，继续升温会导致黄酮类化合物在高温下被破坏，导致总黄酮提取率有所降低。因此，选择45、50、55 ℃提取温度进行响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.F004图4超声温度对女贞子总黄酮提取率的影响2.2响应面优化女贞子总黄酮提取工艺试验结果2.2.1响应面试验结果及方差分析结果（见表2、表3）对表2数据进行响应面分析可得到各因素对女贞子总黄酮提取率影响的回归方程：Y=4.92-0.015A-0.017B+0.16C+0.21AB+0.17AC+0.40BC-0.49A2-0.53B2- 1.14C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.T002表2响应面试验结果试验号ABC黄酮提取率/%10004.8720004.9830004.7840-113.1251104.15601-12.587-1103.658-1013.289-1-104.08100004.9511-10-13.45120113.87131013.47140-1-13.451510-12.98161-103.74170005.01由表3可知，模型的F值=66.09，P0.000 1，失拟项P=0.161 80.05，说明此模型可以预测女贞子总黄酮提取得率[27-28]。模型的相关系数R2=0.988 4，表明该模型与实际试验具有高度相关性；调整系数Radj2=0.973 4，表明该模型准确性和通用性较好。由F值大小可知，3个单因素对女贞子总黄酮提取得率影响大小的主次关系为超声温度（C）纤维素酶浓度（B）乙醇浓度（A）。显著性分析检验结果显示，交互项AB、AC对女贞子黄酮提取得率影响达到显著。一次项C、交互项BC、二次项A2、B2、C2等均对女贞子总黄酮提取得率具有极显著影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.T003表3方差分析结果变异来源平方和自由度均方F值P值模型9.46091.05066.090.000 1A1.800×10-311.800×10-30.110.746 4B2.450×10-312.450×10-30.150.706 4C0.20010.20012.880.008 9AB0.18010.18011.090.012 6AC0.11010.1106.850.034 6BC0.66010.66041.250.000 4A21.00011.00062.660.000 1B21.17011.17073.390.000 1C25.44015.440341.950.000 1残差0.11070.016失拟项0.07730.0262.950.161 8纯误差0.03548.670×10-3总变异9.57016注：1.R2=0.988 4，Radj2=0.973 4。2.P0.01表示影响极显著。2.2.2各因素交互作用对女贞子总黄酮提取率的影响（见图5）响应面图曲面的坡度及等高线形状可直观反映两因素间的交互效应，响应面图越陡峭或等高线图呈椭圆形，表明两因素交互作用越显著[29-30]；反之表示两因素交互作用对黄酮提取得率影响不显著。由图5可知，两因素交互作用响应面图开口均向下，且响应面3D图上均存在最大响应值。在响应面图中固定一因素水平，总黄酮提取率随着另一因素水平的提高呈现出先增大后降低趋势。图5（c）的响应曲面陡峭，且等高线呈扁椭圆形，表明纤维素酶浓度与超声温度交互作用对总黄酮提取率的影响极显著；图5（a）、图5（b）的响应曲面较陡峭，且等高线呈胖椭圆形，表明乙醇浓度与纤维素酶浓度、乙醇浓度与超声温度交互作用对总黄酮提取率影响显著。这与表3中交互项P值分析结果一致。图5各因素交互作用对女贞子总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.F5a1（a）乙醇浓度和纤维素酶浓度对女贞子总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.F5a2（b）乙醇浓度和超声温度对女贞子总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.F5a3（c）超声温度和纤维素酶浓度对女贞子总黄酮提取率的影响2.2.3最优工艺参数条件的验证试验经Box-Behnken试验得到女贞子总黄酮提取得率的最优工艺参数为乙醇浓度80.4%、纤维素酶浓度0.301 g/L、超声温度50.5 ℃，此时女贞子总黄酮提取得率的预测值为4.98%。根据试验的可操作性，将其修正为乙醇浓度为80%、纤维素酶浓度0.3 g/L、超声温度50 ℃。在此条件下重复测定3次，女贞子总黄酮提取得率的平均值为4.93%，与预测值基本一致。因此，采用响应面优化所得最优工艺参数准确可靠，具有实际应用价值。2.3女贞子总黄酮抗氧化活性结果2.3.1女贞子总黄酮对DPPH自由基的清除率（见图6）由图6可知，不同浓度的女贞子总黄酮对DPPH自由基清除率存在良好的正相关关系，即女贞子总黄酮浓度越高，对DPPH自由基清除率越好。以VC为阳性对照，在同一浓度下VC对DPPH自由基清除率明显优于女贞子总黄酮。通过计算得到女贞子总黄酮对DPPH自由基清除率IC50值为186.6 mg/L，表明女贞子总黄酮提取物具有较好体外抗氧化能力，但略低于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.F006图6女贞子总黄酮对DPPH自由基的清除率2.3.2女贞子总黄酮对ABTS+自由基的清除率（见图7）由图7可知，不同浓度女贞子总黄酮对ABTS+自由基清除率存在良好的正相关关系，即女贞子总黄酮浓度越高，对ABTS+自由基清除率越好。以VC为阳性对照，在同一浓度下VC对ABTS+自由基清除率明显优于女贞子总黄酮。通过计算得到女贞子总黄酮对ABTS+自由基清除率IC50值为166.8 mg/L，表明女贞子总黄酮提取物对ABTS+自由基具有较好的清除率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.018.F007图7女贞子总黄酮对ABTS+自由基的清除率3结论本研究以女贞子为原料，采用超声波-酶协同提取女贞子总黄酮工艺，在单因素试验基础通过响应面试验优化女贞子总黄酮提取工艺参数，得出最优工艺参数为乙醇浓度80%、纤维素酶浓度0.3 g/L、超声温度50 ℃。在此条件下重复测定3次，女贞子总黄酮提取率的平均值为4.93%。抗氧化试验结果表明，女贞子总黄酮对DPPH自由基和ABTS+自由基均具有一定的清除能力，其IC50值分别为186.6、166.8 mg/L。本研究结果可为女贞子提取物作为天然抗氧化活性物质的应用研究提供参考，为饲料添加剂新资源的开发提供思路。