兽用促生长类抗菌药物主要包括土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽、黄霉素等，这类药物的给药方式通常作为药物饲料添加剂混饲给药[1-2]，可以改善动物肠道菌群平衡，有利于饲料营养成分的消化吸收，促进动物增重[3-4]。随着促生长抗菌药物的广泛使用，致病菌耐药性问题日益严重[5-6]，抗菌药物残留涉及的食品安全和耐药性问题日益受到社会的广泛关注[7]。为确保动物源性食品安全和公共卫生安全，并全面推进全国兽用抗菌药使用减量化行动，我国农业农村部相继发布了第194号公告[8]和第246号公告[9]，规定禁止在饲料生产中添加抗生素。因此，本研究建立了超高效液相色谱法同时测定预混剂中6种促生长类抗菌药物的检测方法，对兽药饲料监管具有重要意义。1材料与方法1.1材料与试剂土霉素对照品（86.6%，中国兽医药品监察所）、恩拉霉素对照品（968 IU/mg，中国兽医药品监察所）、喹烯酮对照品（99.9%，中国兽医药品监察所）、维吉尼亚霉素对照品（2 347 IU/mg，中国兽医药品监察所）、那西肽对照品（984 IU/mg，中国兽医药品监察所）、黄霉素对照品（2 219 IU/mg，中国兽医药品监察所）、阿苯达唑伊维菌素预混剂（河北威远动物药业有限公司）、地克珠利预混剂（山东齐发动物药业有限公司）、莫能菌素预混剂（山东齐发动物药业有限公司）、乙腈、甲酸铵、甲酸（均为色谱纯，美国Fisher公司）。1.2仪器设备ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）、2998 PDA二极管阵列检测器（美国Waters公司）、AX205型电子天平（美国Mettler Toledo公司）、KQ-300E超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司）。1.3溶液的制备1.3.1溶剂以乙腈-0.25%甲酸水溶液（50∶50）为溶剂，其中0.25%甲酸水溶液由2.5 mL的甲酸置于1 000 mL的容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度制得。1.3.2对照品溶液分别精密称取土霉素对照品10 mg、恩拉霉素对照品50 mg、喹烯酮对照品5 mg、维吉尼亚霉素对照品10 mg、那西肽对照品5 mg、黄霉素对照品50 mg，均置于100 mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度。1.3.3空白样品溶液取阿苯达唑伊维菌素预混剂、地克珠利预混剂、莫能菌素预混剂空白样品0.1 g，加入10 mL溶剂，摇匀，300 W功率超声5 min，采用0.22 μm滤膜过滤。1.3.4检测限溶液精密量取对照品溶液适量，用溶剂分别稀释2、4、5、6、10倍制得。1.3.5线性溶液取土霉素对照品10 mg、恩拉霉素对照品50 mg、喹烯酮对照品5 mg、维吉尼亚霉素对照品10 mg、那西肽对照品5 mg、黄霉素对照品50 mg，精密称定，置于同一50 mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液1。精密量取线性溶液1各8、5、10、5 mL分别置于10、10、25、25 mL容量瓶中，稀释至刻度，作为线性溶液2~5。1.3.6回收率溶液向阿苯达唑伊维菌素预混剂、地克珠利预混剂、莫能菌素预混剂3种预混剂空白样品中分别添加80%、100%、120%浓度水平的6种促生长类抗菌药物，每个浓度水平平行制备3份溶液。1.4试验方法1.4.1色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）；流动相为0.05 mol/L甲酸铵水溶液（用甲酸调节pH值至3.8）（流动相A）-乙腈（流动相B）；流速为0.45 mL/min，梯度淋洗，梯度淋洗程序见表1；柱温为30 ℃，检测器为二极管阵列检测器，进样量为5 μL，采集波长为200~400 nm，提取波长为254 nm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.022.T001表1梯度淋洗程序时间/min流动相A/%流动相B/%088121.0088121.0175258.00703011.00703011.01584214.00584214.01564420.00564420.01307025.00307025.01881230.0088121.4.2样品检测对样品溶液色谱图中的各目标峰进行峰纯度检查，光谱图与光谱库进行匹配，若样品溶液色谱图中目标色谱峰的纯度角度均小于对应纯度阈值，确定目标色谱峰均为单一物质峰，若PDA匹配角度均小于匹配阈值，可认为是同一物质。2结果与分析2.1色谱条件的优化结果将流动相B由乙腈替换为甲醇后，所有对照品色谱峰的保留时间均有所延迟，且那西肽A峰、恩拉霉素A峰、维吉尼亚霉素M1峰和黄霉素A峰与周围峰之间的分离度变差，尤其是恩拉霉素A峰与维吉尼亚霉素M1峰完全重叠，无法分离。说明甲醇不适用于分离促生长类抗菌药物，因此选择乙腈作为流动相中的有机相部分。去掉流动相A中的甲酸铵后，恩拉霉素与黄霉素形成矮胖且不对称的混合物峰，两种抗菌药物无法分离，那西肽A峰与周围小组分峰的分离度变差，表明使用添加有甲酸铵的流动相，对于促生长类抗菌药物的分离效果较好。2.2提取溶剂的选择当乙腈-0.25%甲酸水溶液的体积比大于（60∶40）时，恩拉霉素、黄霉素不能完全溶解，试管底部有可见的未溶解固体，当乙腈-0.25%甲酸水溶液的体积比小于（50∶50）时，那西肽不能完全溶解，试管底部有可见的未溶解固体，因此选择乙腈-0.25%甲酸水体积比（50∶50）作为提取溶剂。2.3方法学验证2.3.1方法专属性6种促生长类抗菌药物色谱、光谱结果分别见图1、图2。由图1、图2可知，溶剂、空白样品溶液对应的色谱图中不存在目标对照色谱峰，表明溶剂及制剂空白对上述6种促生长类抗菌药物的检测无干扰。对照品溶液中6种药物的主成分峰与周围小组分或杂质峰分离良好，表明试验所用方法的专属性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.022.F001图16种促生长类抗菌药物色谱图注：1为土霉素，2为恩拉霉素A，3为喹烯酮，4为维吉尼亚霉素M1，5为那西肽A，6为黄霉素A。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.022.F002图26种促生长类抗菌药物光谱图2.3.26种促生长类抗菌药物的精密度考察结果（见表2）计算对照品溶液连续6次检测结果中6种促生长类抗菌药物的主成分峰保留时间RSD和主成分峰面积RSD。由表2可知，6次检测结果中促生长类抗菌药物的保留时间RSD均不大于0.2%，峰面积RSD均不大于0.9%，表明检测方法的精密度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.022.T002表26种促生长类抗菌药物的精密度考察结果项目主成分峰面积/(μV·s)主成分峰面积RSD/%保留时间/min保留时间RSD/%土霉素1 586 5180.91.8510.10恩拉霉素1 189 3680.35.9940.20喹烯酮2 035 0910.56.6800.10维吉尼亚霉素952 3470.39.4520.20那西肽993 6230.313.3780.04黄霉素1 599 8970.318.9000.202.3.36种促生长类抗菌药物检测限测定结果以检测限溶液光谱图未失真的最小浓度为检测限，本方法针对溶液中各促生长类抗菌药物的浓度检测限为土霉素0.02 g/L、恩拉霉素0.1 g/L、喹烯酮0.01 g/L、维吉尼亚霉素0.02 g/L、那西肽0.01 g/L、黄霉素0.1 g/L。各预混剂的配制浓度均为10 g/L，因此，将本方法针对溶液中各促生长类抗菌药物的浓度检测限转换为针对预混剂中各促生长类抗菌药物的添加检测限为土霉素2 mg/g、恩拉霉素10 mg/g、喹烯酮1 mg/g、维吉尼亚霉素2 mg/g、那西肽1 mg/g、黄霉素10 mg/g。2.3.46种促生长类抗菌药物的线性考察结果（见表3）将线性溶液1~5中各促生长类抗菌药物的溶液浓度，转换成制剂中各促生长类抗菌药物的添加浓度，并以各添加浓度对峰面积作图，进行统计学处理，分别得到6种促生长类抗菌药物的回归方程，并计算得到相关系数R2。由表3可知，在制剂添加浓度为2~100 mg/g的范围内，利用本方法检测得到的6种促生长类抗菌药物主成分的峰面积与制剂添加浓度呈良好的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.022.T003表36种促生长类抗菌药物的线性考察结果项目线性范围/(mg/g)R2土霉素4~201.000 0恩拉霉素20~1001.000 0喹烯酮2~101.000 0维吉尼亚霉素4~200.999 9那西肽2~100.999 4黄霉素20~1001.000 02.3.5耐用性结果取对照品溶液，调整流动相pH值为3.6、3.8、4.0；调整柱温为25、30、35 ℃；改变流速0.42、0.45、0.48 mL/min。在上述各色谱条件下，6种促生长类抗菌药物主成分峰与周围峰的分离度均大于1.5，且各主成分峰的纯度角度均小于纯度阈值，为单一物质峰，表明本方法具有良好的耐用性。2.3.6阿苯达唑预混剂中各浓度的各促生长类抗菌药物的回收率考察结果（见表4~表6）由表4~表6可知，本方法对3种预混剂中6种促生长类抗菌药物的平均回收率均在92%~105%之间，满足兽药检测中对回收率的要求，表明本方法适用于预混剂中6种促生长类抗菌药物的检测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.022.T004表4阿苯达唑预混剂中各浓度的各促生长类抗菌药物的回收率项目浓度/%回收率/%浓度/%回收率/%浓度/%回收率/%平均回收率/%土霉素8097.1010098.40120100.1699.199.1498.67100.3499.0698.44100.38恩拉霉素8097.4010098.74120100.2299.097.2299.72100.3197.6099.88100.14喹烯酮8097.4210099.76120100.3599.296.4199.91100.3698.60100.16100.02维吉尼亚霉素80100.13100100.30120100.76100.3100.21100.23100.52100.29100.40100.18那西肽8099.0410099.4212099.3099.699.4099.5299.9599.9499.7199.98黄霉素8098.1210099.61120100.2099.498.1799.58100.1599.0299.9499.9210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.022.T005表5地克珠利预混剂中各浓度的各促生长类抗菌药物的回收率项目浓度/%回收率/%浓度/%回收率/%浓度/%回收率/%平均回收率/%土霉素8093.0110092.7012091.7292.292.0992.1891.9392.2492.0392.32恩拉霉素80101.86100101.06120101.16101.3101.54101.25101.06101.48101.64101.12喹烯酮80102.61100101.21120101.50101.4101.22101.30101.17101.22101.76100.54维吉尼亚霉素80105.87100101.76120102.05102.1101.20101.80101.70101.29102.32101.04那西肽80101.31100101.50120101.79101.5101.56101.60101.54101.72102.16100.53黄霉素80101.50100101.40120101.54101.4101.26101.49101.30101.40101.86100.5810.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.022.T006表6莫能菌素预混剂中各浓度的各促生长类抗菌药物的回收率项目浓度/%回收率/%浓度/%回收率/%浓度/%回收率/%平均回收率/%土霉素8098.4210099.71120100.5299.6100.0699.68100.1699.4298.7699.44恩拉霉素80101.06100106.59120105.70104.6103.30106.11106.70102.64105.26104.10喹烯酮80100.08100100.78120101.30100.8100.10100.49101.34100.90101.14101.05维吉尼亚霉素8099.90100100.64120101.10100.599.90100.37100.98100.36100.56100.68那西肽8099.64100100.24120100.60100.399.76100.00100.94100.28100.62100.69黄霉素80101.72100102.47120102.62102.2101.80102.10102.40102.32102.35102.253讨论抗菌药物的检测方法主要为微生物法[10-11]，但微生物方法存在灵敏度低、检测时间长、操作复杂[12]等缺点。近年来，郑蓉等[13]建立了饲料中黄霉素残留量的高效液相色谱方法；侯林丛等[14]建立了高效液相色谱法测定饲料中喹烯酮的分析方法；曹文卿等[15]采用液质联用法快速测定饲料中维吉尼亚霉素的含量；曾玉勤等[16]采用高效液相色谱法测定预混剂中恩拉霉素的含量。但目前已有方法仅能够实现单种促生长类抗菌药物主成分的分离。抗菌药物多为发酵来源的抗生素，每种抗生素除主成分外均包含多种与主成分结构相似的小组分。在同一色谱条件下分离时，每种抗菌药物的主成分峰均可能受到自身小组分峰、自身杂质峰、其他抗菌药物的主成分峰、其他抗菌药物的小组分峰或杂质峰的干扰，分离难度大大增加。因此，本研究采用超高效液相色谱法，通过优化流动相种类、流动相pH值、梯度洗脱程序及色谱柱，得到最佳色谱条件，能够准确定位土霉素、恩拉霉素、喹烯酮、维吉尼亚霉素、那西肽和黄霉素的主成分峰的位置，实现对预混剂中抗菌药物的快速、准确检测。4结论本研究建立了超高效液相色谱法同时测定预混剂中6种促生长类抗菌药物的检测方法，以乙腈-甲酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，得到的色谱图基线平稳，各主成分峰峰形好，各主成分峰与周围峰之间分离度高，且可实现两种以上促生长类抗菌药物的良好分离。