白头翁口服液现收录于《中华人民共和国兽药典》2020年版二部，由白头翁、黄连、秦皮、黄柏这四味中药组成，具有清热解毒、凉血止痢的功效。白头翁口服液常用于肠道疾病的治疗，在抗炎、抗菌和提高机体免疫力等方面具有重要作用[1-3]。吕颜枝等[4]利用白头翁口服液对人工感染鸡大肠杆菌模型进行治疗，结果表明，高剂量组在抗菌过程中具有明显作用，对鸡大肠杆菌的治愈率高达96%。张月姣等[5]研究发现，白头翁口服液能够降低大肠杆菌对硫酸新霉素的耐药性，提高新霉素的杀菌功效。目前药典中中草药提取的传统工艺采用水提醇沉法，在口服液提取澄清过程中存在提取率不高、有效成分损失大和能耗高等问题[6]。ZTC1+1是一种天然澄清剂，分为A、B两种组分，A组分的主要成分是淀粉酶，B组分的主要成分是含淀粉酶的复合酶。在水提液中加入一种组分之后，可通过分子间“架桥”连接使可溶分子迅速增大；另一组分在前一组分形成复合物的基础上再“架桥”，从而加快澄清过程[7]。ZTC1+1可帮助除去药液中鞣质、蛋白质、淀粉等杂质，且对中药中所含的黄酮、生物碱、苷类、多糖、氨基酸、维生素和矿物质等有效成分无影响[8]。为了尽可能提取和保留药材中的有效成分，本试验首先对中药材的水提工艺进行了优化，在此基础上对口服液的澄清工艺进行优化，为中草药提取物在动物养殖中的高效利用提供参考。1材料与方法1.1主要仪器1260Ⅱ高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），GM-0.33A隔膜真空泵（天津津腾实验设备有限公司），UV-6100紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），KH-500E超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），GC-20L-DI型超纯水机（深圳市广川科技有限公司），AUW220D型分析天平（岛津中国有限公司）。1.2主要试剂盐酸小檗碱对照品（11073-202015，纯度：85.9%）购自中国食品药品鉴定研究院，白头翁、黄连、秦皮、黄柏4种药材购自河北安国药材批发市场，经检验均符合2020版《中华人民共和国兽药典》该药材项下的有关规定，ZTC1+1天然澄清剂购自天津振天成科技有限公司，甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。1.3水提工艺单因素试验称取白头翁60 g、黄连30 g、秦皮60 g、黄柏45 g，固定提取次数3次，以浸泡时间30 min、提取时间60 min、液料比8 mL/g（首次加水应满足2倍吸水量）为基础工艺条件，在其他条件不变的情况下，单独调整各因素水平进行单因素试验，测定盐酸小檗碱含量。水提工艺单因素试验水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.T001表1水提工艺单因素试验水平水平A浸泡时间/minB提取时间/minC液料比/(mL/g)110407220508330609440701055080111.4水提工艺正交试验根据单因素试验结果，分别选取浸泡时间、提取时间、液料比的最佳提取参数进行正交试验，每个因素分别选取３个水平，Ｌ9(34)水提工艺正交试验因素水平设计见表2。根据盐酸小檗碱含量筛选最优水提工艺参数组合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.T002表2Ｌ9（34）水提工艺正交试验因素水平设计水平A浸泡时间/minB提取时间/minC液料比/(mL/g)D空白13050812406092350701031.5ZTC1+1澄清剂的配制及加入A组分的配制：先取少量蒸馏水将 淀粉酶搅成糊状，加入需要量的蒸馏水，溶胀24 h，搅拌，配制成1%黏胶液。B组分的配制：配制1%醋酸，利用少量1%醋酸溶解复合酶并搅成糊状，加入足够量的1%醋酸，溶胀24 h，搅拌，配制成1%黏胶液。组分的加样顺序取决于处理溶液的pH值。在pH值4.8的环境中，按照先A后B的顺序进行添加；在pH值4.8的环境中，按照先B后A的顺序进行添加。经测定药液的pH值4.8，按规定先A后B顺序添加澄清剂，A与B的比例为2∶1。先加入A组分，每30 min左右搅拌一次，可见药液明显变混，或可见小的絮状物；2 h后加入B组分，同时按一定速度搅拌。1.6检测波长的选择口服液在波长大于450 nm的吸收值较小且吸收曲线较平坦，说明此区域的吸收度受药液本身成分的影响较小，可以反映药液的澄清或混浊程度。本试验选择550 nm为测定波长，将待测液利用蒸馏水稀释１倍，以蒸馏水为空白，测定药液吸光度（A），A越小，说明药液澄明度越好，即澄清效果越好。1.7ZTC1+1澄清单因素考察以药液浓度1∶8 g/mL（生药量∶药液量）、澄清剂用量6%∶3%（A组分∶B组分）、絮凝温度70 ℃为基础工艺条件，在其他条件不变的情况下，单独调整各因素水平进行单因素试验，测定盐酸小檗碱含量，澄清工艺单因素试验水平见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.T003表3澄清工艺单因素试验水平水平A药液浓度/(g/mL)B澄清剂用量/%C絮凝温度/℃11∶62∶14021∶74∶25031∶86∶36041∶98∶47051∶1010∶5801.8ZTC1+1澄清正交试验设计考察根据单因素试验结果，分别选取澄清剂用量、药液浓度、絮凝温度的最佳提取参数进行正交试验，每个因素分别选取３个水平，Ｌ9(34)澄清工艺正交试验因素水平设计见表4。以加入澄清剂后药液吸光度和盐酸小檗碱保留率的加权综合评分为考察指标筛选最优澄清工艺参数组合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.T004表4澄清工艺正交试验因素水平设计水平A药液浓度/(g/mL)B澄清剂用量/%C絮凝温度/℃D空白11∶72∶160121∶84∶270231∶96∶38031.9不同工艺白头翁口服液的制备絮凝澄清工艺：根据组方配比称取各味药材，按照1.4中最优水提工艺进行口服液的水提，并按照1.8中最优澄清工艺进行口服液的澄清，滤过，浓缩至每1 mL口服液相当于1 g生药材，即得。传统醇沉工艺：根据组方配比称取各味药材，按照1.4中最优水提工艺进行口服液的水提，合并浓缩滤液，滤液中加入乙醇，使含醇量达到75%，静置24 h，滤过，滤液回收乙醇，加水调至每1 mL口服液相当于1 g生药材，即得。将絮凝澄清工艺和传统醇沉工艺制备的口服液进行比较，分别测定样品中盐酸小檗碱的保留率，对工艺可行性进行考察。1.10白头翁口服液中盐酸小檗碱含量测定1.10.1色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（50∶50）（每100 mL加十二烷基硫酸钠0.4 g，再利用磷酸调节pH值至4.0）为流动相，检测波长为347 nm。理论板数按盐酸小檗碱计算应不低于5 000。1.10.2盐酸小檗碱对照品配制取盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液制成每1 mL含盐酸小檗碱20 μg的溶液1.10.3供试品溶液及阴性对照溶液配制精密量取供试品溶液以及缺黄连、黄柏的溶液2 mL，分别置50 mL量瓶中，加甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液适量，超声处理10 min，放冷，加甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液至刻度，摇匀，滤过。2结果与分析2.1盐酸小檗碱专属性考察（见图1）由图1可知，盐酸小檗碱专属性好，阴性样品无干扰。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.F001图1盐酸小檗碱专属性考察结果2.2水提工艺单因素考察结果2.2.1浸泡时间对盐酸小檗碱含量的影响（见图2）由图2可知，在一定时间范围内，随着浸泡时间的延长，活性成分溶出越高，当浸泡时间为40 min时，药液小檗碱含量趋于平衡。因此，选择浸泡时间40 min进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.F002图2浸泡时间对盐酸小檗碱含量的影响2.2.2提取时间对盐酸小檗碱含量的影响（见图3）由图3可知，在一定时间范围内，随着提取时间的延长，活性成分溶出率增大，提取时间为80 min时，药液中小檗碱含量达到最大值，但与提取时间60 min小檗碱含量差异不明显。综合提取效率，选择提取时间60 min进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.F003图3提取时间对盐酸小檗碱含量的影响2.2.3液料比对盐酸小檗碱含量的影响（见图4）由图4可知，随着液料比的增高，活性成分的收率随之升高，液料比达到9 mL/g时，活性成分收率趋于最大值。综合考虑能耗等因素，选取液料比9 mL/g进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.F004图4液料比对盐酸小檗碱含量的影响2.3水提工艺正交试验结果（见表5、表6）由表5可知，水提工艺各因素水平对小檗碱含量影响程度排序依次是BCA，即提取时间液料比浸泡时间，提取盐酸小檗碱含量最高的工艺为A3B3C3。由表6可知，液料比对盐酸小檗碱含量影响显著（P0.05），提取时间对盐酸小檗碱含量影响极显著（P0.01），而浸泡时间对盐酸小檗碱含量无显著影响。考虑缩短生产周期和提高经济效益的需求，最终选择最优组合为A1B3C3，即满足2倍吸水量之后加10倍水，浸泡30 min，提取3次，每次提取70 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.T005表5水提工艺正交试验结果项目A浸泡时间B提取时间C液料比盐酸小檗碱含量/(g/L)11115.5921226.3131337.1242125.6952236.7362316.6373136.0583216.2393326.90k16.3405.7776.150k26.3506.4236.300k36.3936.8836.633R0.0531.1060.48310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.T006表6水提工艺试验方差分析结果项目偏差平方和自由度均方F值P值误差0.10020.005截距364.1741364.17474 659.7380浸泡时间0.00520.0020.4940.669提取时间1.85420.927190.0960.005液料比0.36720.18437.6420.026注：1.R2=0.995；F0.05（2，2）=19，F0.01（2，2）=99。2.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著；下表同。2.4澄清工艺单因素试验结果2.4.1药液浓度对盐酸小檗碱保留率的影响（见图5）由图5可知，在一定范围内，随着药液浓度的降低，小檗碱保留率逐渐增加，当生药量∶药液量为1∶8 g/mL时增加程度缓慢。考虑药液浓度过稀会造成后续浓缩困难，选取生药量∶药液量1∶8 g/mL进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.F005图5药液浓度对盐酸小檗碱保留率的影响2.4.2澄清剂用量对盐酸小檗碱保留率的影响（见图6）由图6可知，在一定范围内，随着澄清剂用量的增加，小檗碱的含量保留率逐渐增加，澄清剂用量为4% A、2% B时，小檗碱保留率显著增加。为节约生产成本，选取澄清剂用量4% A、2% B进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.F006图6澄清剂用量对盐酸小檗碱保留率的影响2.4.3絮凝温度对小檗碱保留率的影响（见图7）由图7可知，随着絮凝温度的升高，小檗碱保留率逐渐升高，但温度过高会降低小檗碱的含量保留率，因此，选取絮凝温度70 ℃进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.F007图7絮凝温度对小檗碱保留率的影响2.5澄清工艺正交试验结果（见表7、表8）由表7可知，澄清工艺各因素水平对综合评分影响依次是BAC，即澄清剂用量药液浓度絮凝温度，综合评分最高的工艺为A2B3C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.T007表7澄清工艺正交试验结果项目A药液浓度B澄清剂用量C絮凝温度吸光度盐酸小檗碱保留率/%综合评分11110.43761.7287.2521220.40364.9391.9331330.37467.7896.0542120.42964.9691.1652230.43167.3293.7762310.43370.6497.4773130.45862.3887.3583210.35158.6386.4093320.39167.4295.12k191.74388.58790.373k294.13390.70092.737k389.62396.21392.390R4.5107.6262.364注：综合评分=(1-吸光度)/(1-吸光度min)×20%+盐酸小檗碱保留率/盐酸小檗碱保留率max×80%。由表8可知，澄清剂用量对综合评分影响显著（P0.05），而药液浓度和絮凝温度对综合评分无显著影响，考虑生产成本以及耗能，最终选择最优组合为A1B3C1，即在药液浓度为1∶7 g/mL时，先加入6% A组分，再加入3% B组分，在60 ℃条件下进行澄清工艺。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.T008表8澄清工艺试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值误差1.84520.924截距75 900.250175 900.25082 140.1640药液浓度30.547215.27316.5290.057澄清剂用量93.029246.51550.3390.019絮凝温度9.77224.8865.2880.159注：R2=0.995；F0.05（2，2）=19，F0.01（2，2）=99。2.6工艺验证试验结果（见表9）由表9可知，絮凝澄清工艺除杂后，药液中盐酸小檗碱平均保留率为70.89%，醇沉工艺盐酸小檗碱的平均保留率只有56.72%，说明絮凝澄清工艺优于醇沉工艺，且三批次絮凝澄清工艺制备的口服液含量保留率RSD1.00%，说明该工艺稳定、可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.017.T009表9工艺验证试验结果项目批次盐酸小檗碱保留率/%RSD/%絮凝澄清工艺170.530.71271.46370.67平均值70.89醇沉工艺158.272.68256.65355.23平均值56.723讨论白头翁口服液临床应用广泛，主要应用于各种肠道菌引起的细菌性疾病，如大肠杆菌[9]、沙门氏菌[10]、痢疾杆菌[11]等。配方中白头翁味苦性寒，能入血分，清热解毒，凉血止痢，为君药；黄连清热解毒，燥湿厚肠，为治痢要药；黄柏善清下焦湿热，两药共助君药清热解毒，燥湿治痢，为臣药；秦皮苦寒而涩，清热解毒兼能收涩止痢，为佐使药[12]。以上4种药合用，制成口服液便于临床使用。盐酸小檗碱作为黄连和黄柏的共有成分[13-14]，在组方中占有很大比例，故选取盐酸小檗碱作为评价指标。中药口服液的效果受到提取工艺影响，中药材的提取精制将决定配制口服液的有效成分以及纯度[15]。在口服液提取工艺方面，对比水提和醇提方法的效果[16-19]，醇提在含量提取方面优于水提，但是在生产实际中存在耗资大、不安全等问题，继续沿用2020版《中国兽药典》收录的白头翁口服液水提工艺，对其进行优化。影响水提工艺的主要因素有浸泡时间、提取时间、液料比、提取次数等，但在正交设计中提取次数作为影响因素会间接影响其他因素水平，使正交表不符合均匀分散、整齐可比的特性[20]。因此，固定提取次数3次，选用浸泡时间、提取时间和液料比进行水提工艺的优化。目前，口服液的澄清方法主要有醇沉法、膜分离法、离心法、ZTC1+1絮凝法和壳聚糖絮凝法等[21-25]。药典中醇沉除杂法具有成本高、生产周期长、有效成分损失大等问题。ZTC1+1天然澄清剂属于食品添加剂，安全无毒且澄清速度快，保留成分更多，在降低成本、缩短工期及增强制剂的稳定性方面均具有显著作用[26]。孙姣等[27]研究表明，使用ZTC1+1天然澄清剂对养阴清肺糖浆水提液进行絮凝澄清可以代替醇沉法。刘秀华等[28]利用ZTC1+1天然澄清剂对参乌益气口服液进行澄清工艺的优选，结果表明，澄清前后各指标差异均不大且稳定。尚海斌等[29]利用ZTC1+1天然澄清剂对清热解毒口服液醇沉除杂工艺进行改进，结果表明，口服液澄清度好，黄芩苷的含量提高30%。上述研究表明，ZTC1+1广泛应用于中药口服液的澄清工艺并取得了良好的效果。影响ZTC1+1澄清剂使用效果的因素主要有药液浓度、澄清剂用量、絮凝温度、搅拌速度以及药材性质等[30]，选取药液浓度、澄清剂用量和絮凝温度作为主要因素进行絮凝澄清工艺的优化。4结论试验前期采用单因素结合正交试验设计优选白头翁口服液的最佳水提工艺，最佳工艺参数为液料比10 mL/g，浸泡时间30 min，提取3次，每次提取70 min。试验后期优选最佳絮凝澄清工艺，最佳工艺参数为药液浓度1∶7 g/mL，澄清剂用量6% A、3% B，絮凝温度60 ℃。本试验通过比较不同样品中盐酸小檗碱的含量，发现絮凝澄清工艺明显优于传统的醇沉工艺，且该工艺比较稳定，可为白头翁口服液的后续开发研究提供参考。