菊科属多年生草本植物甜叶菊（Stevia rebaudiana（Bertoni） Hemsl.）又名甜茶、甜菊[1]。甜叶菊主要用于提取甜叶菊糖苷作为甜味剂或药品辅料，但提取甜菊糖苷后会产生的大量甜叶菊废渣。目前甜叶菊废渣的处理方式通常为燃烧，不仅污染环境，还会造成甜叶菊废渣中丰富活性成分和营养物质的浪费[2-3]。甜叶菊废渣中的活性成分主要为绿原酸、新绿原酸等绿原酸类化合物[4]。这些活性成分具有良好的抗氧化[5]、抗炎[6-7]、抗菌[8-9]、提高牲畜繁殖性能[10-11]、增强动物免疫力[12-13]、提高动物采食量[14]及日增重[15]、降低料重比[16]等功能。为实现甜叶菊资源的综合利用，通过工艺创新在提取甜叶菊中甜菊糖苷的同时，分离纯化绿原酸类活性成分，获得甜叶菊提取物。甜叶菊提取物需按照《植物提取物类饲料添加剂申报指南》的要求制定特征图谱，以表征其有效组分和其他组分，确保不同批次甜叶菊提取物的质量均一和稳定。本研究收集不同来源的甜叶菊提取物产品，通过HPLC建立分析方法，构建甜叶菊提取物的特征图谱[17]，通过对照品对甜叶菊提取物特征图谱中特征峰指认，为甜叶菊提取物的质量控制提供参考。1材料与方法1.1试验仪器Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），Centrifuge 5430R高速离心机（德国Eppendorf公司），KQ5200DE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），Zorbax C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm，美国Agilent公司），Unitary C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm，浙江华谱新创科技有限公司），Sunfire C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm，美国Waters公司）。1.2试验试剂与样品无水甲醇（AR，Merck）、乙腈（AR，Merck）、色谱级甲酸（AR，Merck）、超纯水（AR，德国ELGA）、微孔滤膜（0.22 μm，上海安谱科技仪器有限公司）。绿原酸对照品（批号20011401）、异绿原酸A（批号20072204）、异绿原酸B（批号20045804）、异绿原酸C（批号20046308）、隐绿原酸（批号20074609）、新绿原酸对照品（批号20042205）均购自中国食品药品检定研究院，所有甜叶菊提取物试样分别由两家公司提供，甜叶菊原料来源信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T001表1甜叶菊原料来源信息序号编号产地采购地点序号编号产地采购地点1TYJ-L2106-1广西桂林12TYJ-L2106-12广西桂林2TYJ-L2106-2广西桂林13TYJ-L2106-13广西桂林3TYJ-L2106-3广西桂林14TYJ-L2106-14广西桂林4TYJ-L2106-4广西桂林15TYJ-L2106-15广西桂林5TYJ-L2106-5广西桂林16TYJ-L2106-16广西桂林6TYJ-L2106-6广西桂林172-0969-230214河北邯郸7TYJ-L2106-7广西桂林182-0969-230215河北邯郸6TYJ-L2106-6广西桂林192-0969-230216河北邯郸9TYJ-L2106-9广西桂林202-0969-230217河北邯郸10TYJ-L2106-10广西桂林212-0969-230218河北邯郸11TYJ-L2106-11广西桂林1.3质控样品制备从21批甜叶菊提取物试样中等量取适量混合均匀，即得质控样品，用于分析方法的建立。1.4溶液制备1.4.1试样溶液的制备称量样品0.025 00 g（精确至0.000 01 g）于50 mL容量瓶，加入50%甲醇约50 mL，超声30 min（功率250 W，频率40 kHz）至样品溶解，冷却至室温后利用50%甲醇定容，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，待HPLC测定。1.4.2参照物溶液的制备分别精准称定异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸对照品10 mg（精确至0.000 01 g），置于25 mL棕色容量瓶，加甲醇超声溶解冷却至室温，定容至刻度，制成浓度为0.4 g/L的参照物溶液储备液。1.5色谱条件的优化按1.4.1制备溶液，对样品进行检测波长选择以及流速、柱温、进样量、色谱柱考察。首先对质控样品进行二极管阵列检测器（DAD）全波长扫描，观察分析最大吸收波长，且在最大吸收波长下测定样品色谱峰数量及响应程度，以确定最佳色谱波长；分别考察不同品牌色谱柱（Zorbax C18、Unitary C18、Sunfire C18）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱温（25、30、35 ℃）和不同进样量（3、5、10、15 µL）对甜叶菊提取物中主要色谱峰分离的影响，对其分离度、峰形、出峰时间、响应度等因素进行评估，选择最合适的色谱条件。最后进行数据采集时间考察，取质控样品溶液，按照已确定的色谱条件进样，将数据采集时间设为测定方法中采集时间的2倍，记录得到采集时间为80 min的色谱图，验证方法设定的数据采集时间是否合理。1.6方法学考察将特征图谱作为定性鉴别方法，主要开展精密度、稳定性、重复性的方法学验证试验，考察各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性[17-18]。精密度试验：按照已建立的色谱条件，取同一质控样品溶液连续进样6次，记录6次色谱图结果，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差（RSD）。稳定性试验：按照已建立的色谱条件，取同一质控样品溶液分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。重复性考察：按照已建立的色谱条件，取同一样品平行制备成6份质控样品溶液，分别进样，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD。1.7测定结果的评判图谱轮廓：试样图谱应与甜叶菊提取物的对照特征图谱进行比对，从特征峰的数量、色谱图轮廓上进行目测比较，相吻合则初步判定为合格。相对保留时间（RRT）：各批次样品中各特征峰的相对保留时间均在规定值的±10%以内则判定为合格。特征峰与S峰相对保留时间测定值与规定值的偏差计算公式为：x=(RRT测定值-RRT规定值)/RRT规定值×100%(1)2结果与分析2.1HPLC分析方法色谱条件优化2.1.1检测波长的选择（见图1）由图1可知，采用二极管阵列检测器（DAD）对样品进行全波长扫描，甜叶菊有效成分的最佳吸收波长为327 nm，在该波长下，样品测定结果中色谱峰数量及响应程度均优于其他波长。因此，选择327 nm作为数据采集波长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F001图1波长优化结果2.1.2色谱柱的考察结果（见图2）由图2可知，取样品溶液，分别考察Unitary C18、Waters C18、Zorbax C18这3根常见色谱柱对样品中主要色谱峰分离的影响，结果显示，Zorbax C18色谱柱的分离效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F002图2色谱柱考察结果2.1.3流速的考察结果（见图3）由图3可知，取质控样品溶液，分别考察0.8、1.0、1.2 mL/min流速对甜叶菊提取物中主要有效成分分离的影响。结果表明，流速为1.2 mL/min时出峰时间略有偏差，0.8 mL/min与1.0 mL/min相近。综合考虑，选择流速为1.0 mL/min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F003图3流速考察结果2.1.4柱温的考察结果（见图4）由图4可知，取质控样品溶液，分别考察柱温25、30、35 ℃对甜叶菊提取物中主要有效成分分离的影响。结果表明，柱温30 ℃时色谱峰的分离情况最好，故选择柱温30 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F004图4柱温考察结果2.1.5进样量的考察结果（见图5）由图5可知，取质控样品溶液，分别考察进样量为3、5、10 μL对甜叶菊提取物有效成分分离的情况。结果表明，进样量为3、5 μL时甜叶菊提取物有效成分色谱峰响应偏低，故选择10 μL作为试验进样量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F005图5进样量优化结果2.1.6数据采集时间的考察结果（见图6）取质控样品溶液，根据已确定的色谱条件进行数据采集时间考察，将数据采集时间设为测定方法中采集时间的2倍，记录得到采集时间为80 min的色谱图。由图6可知，在测定方法采集时间后无色谱峰出现，样品中的化合物已在方法规定的时间内全部显示，说明方法设定的数据采集时间合理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F006图680 min（2T）下的HPLC色谱结果优化后得到的液相色谱条件：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%的甲酸水；流速为1.0 mL/min；Agilent色谱柱，柱温为30 ℃；检测波长为327 nm；进样量为10 μL。参照药典和文献等相关资料记录的测定方法，并对其进行优化，最终确定的梯度洗脱条件见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T002表2色谱梯度洗脱条件时间/min流动相A/%流动相B/%0~7.0010.0~17.090.0~83.07.00~10.0017.0~17.083.0~83.010.00~15.0017.0~25.083.0~75.015.00~16.0025.0~26.575.0~73.516.00~21.0026.5~26.573.5~73.521.00~25.0026.5~28.573.5~71.525.00~30.0028.5~95.071.5~5.030.00~35.0095.0~95.05.0~5.035.00~35.1095.0~10.05.0~90.035.10~40.0010.0~10.090.0~90.02.2方法学考察结果（见表3~表8）使用优化后的色谱条件对质控样品进行精密度、稳定性和重复性考察。由表3~表8可知，各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均分别小于3%、5%，说明在该特征图谱测定方法下，甜叶菊提取物的6个特征峰具有较好的保留重现性和稳定性，仪器精密度符合要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T003表3精密度相对保留时间项目1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰RSD/%0.1440.1690.1530.0000.0260.036精密度10.3640.5070.5291.0001.0441.096精密度20.3630.5060.5271.0001.0431.095精密度30.3630.5060.5261.0001.0441.096精密度40.3620.5050.5261.0001.0441.095精密度50.3630.5060.5271.0001.0431.095精密度60.3630.5060.5271.0001.0431.09510.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T004表4精密度相对峰面积项目1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰RSD/%1.3521.2211.2440.0000.3921.066精密度10.1670.4170.2311.0000.9231.561精密度20.1670.4160.2301.0000.9161.561精密度30.1660.4160.2311.0000.9211.567精密度40.1920.4260.2361.0000.9251.593精密度50.1920.4270.2361.0000.9261.595精密度60.1920.4270.2361.0000.9261.59410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T005表5重复性相对保留时间项目1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰RSD/%0.1450.2320.1950.0000.0560.131重复性10.3740.5000.5211.0001.0421.096重复性20.3740.5000.5211.0001.0421.096重复性30.3750.4970.5191.0001.0401.094重复性40.3740.5000.5211.0001.0421.097重复性50.3750.5000.5211.0001.0421.096重复性60.3750.5000.5211.0001.0421.09710.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T006表6重复性相对峰面积项目1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰RSD/%4.4273.9494.0670.0002.4700.396重复性10.1660.4200.2321.0000.9361.560重复性20.1660.4190.2311.0000.9431.562重复性30.1940.4290.2391.0000.9161.561重复性40.1640.4110.2271.0000.9361.566重复性50.1640.4150.2301.0000.9351.579重复性60.2060.4570.2531.0000.6631.56710.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T007表7稳定性相对保留时间项目1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰RSD/%0.6410.5700.5470.0000.1070.0630 h0.3620.5050.5261.0001.0431.0952 h0.3650.5060.5301.0001.0451.0974 h0.3660.5110.5321.0001.0441.0966 h0.3650.5070.5291.0001.0431.0958 h0.3640.5070.5291.0001.0451.09612 h0.3640.5060.5261.0001.0431.09624 h0.3900.5140.5351.0001.0441.09748 h0.3630.5050.5271.0001.0421.09410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T008表8稳定性相对峰面积项目1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰RSD/%1.9451.6161.5690.0000.6641.5930 h0.1920.4270.2371.0000.9211.5802 h0.1930.4260.2361.0000.9201.5804 h0.1930.4260.2361.0000.9201.5756 h0.2000.4390.2441.0000.9351.6188 h0.1940.4270.2371.0000.9221.57812 h0.2000.4390.2441.0000.9371.61524 h0.2020.4430.2451.0000.9401.62248 h0.1990.4310.2411.0000.9301.5762.3特征图谱的建立2.3.1特征峰的选择与标定按照已确定的样品制备方法和色谱分析方法（1.4.1）对21批次甜叶菊提取物试样进行测定，得到各批次样品的色谱图；利用仪器自带数据分析软件Empower 3对上述21批次样品色谱图进行手动叠加，选择色谱图上不同保留时间段且响应较好的6个共有色谱峰标定为特征峰。不同批次甜叶菊提取物色谱叠加图见图7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F007图7不同批次甜叶菊提取物色谱叠加图注：峰1为新绿原酸，峰2为绿原酸，峰3为隐绿原酸，峰4为异绿原酸B，峰5为异绿原酸A，峰6为异绿原酸C。2.3.2特征峰的验证结果通过仪器自带数据分析软件Empower 3将已标定的特征峰进行自动识别与积分，积分参数设定以各特征峰在不同批次样品均能被自动积分（阈值30、最小峰面积5 000、最小峰宽30）为标准。结果显示，标定的6个特征峰在所有批次样本中均能够被识别与积分，则可确认标定的6个共有色谱峰为特征峰。2.3.3特征峰的指认及参照峰、S峰的选择（见图8、图9）21批甜叶菊提取物试样HPLC特征图谱中确定共有峰6个，按出峰时间依次标记为1~6号峰。通过查阅药典、文献等[19-22]相关资料及对照品比对，采用2.1色谱条件得到对照品的色谱峰图谱，确定了色谱峰1、色谱峰2、色谱峰3、色谱峰4、色谱峰5和色谱峰6分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C。4号峰异绿原酸B的分离效果好，在各批次样本中响应较稳定，故选择4号峰为S峰。以上指认特征峰均为甜叶菊提物中有效成分，建立的特征图谱具有代表性，能够对甜叶菊提物进行质量控制。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F008图8HPLC混合对照品图谱注：峰1为新绿原酸，峰2为绿原酸，峰3为隐绿原酸，峰4为异绿原酸B，峰5为异绿原酸A，峰6为异绿原酸C。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F009图9样品图谱与对照特征图谱比对注：S1为试样色谱图，S2为对照品的色谱图。2.3.4特征峰相对保留时间的规定（见表9）甜叶菊提取物对照特征图谱应有6个特征峰，以特征峰4（异绿原酸B）为S峰，计算上述21批次样品中其他5个特征峰与S峰的相对保留时间，得到各特征峰相对保留时间的平均值。由表9可知，各特征峰相对保留时间的规定值分别为0.388、0.520、0.534、1.000、1.042、1.091。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T009表921批次甜叶菊提取物特征图谱中6个特征峰的相对保留时间项目峰1峰2峰3峰4峰5峰6TYJ-L2106-10.3880.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-20.3880.5210.5351.0001.0421.091TYJ-L2106-30.3870.5190.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-40.3880.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-50.3870.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-60.3880.5200.5351.0001.0421.091续表9　21批次甜叶菊提取物特征图谱中6个特征峰的相对保留时间10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T010项目峰1峰2峰3峰4峰5峰6TYJ-L2106-70.3880.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-80.3880.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-90.3880.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-100.3880.5200.5351.0001.0411.091TYJ-L2106-110.3880.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-120.3880.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-130.3890.5210.5351.0001.0411.091TYJ-L2106-140.3880.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-150.3870.5200.5341.0001.0421.091TYJ-L2106-160.3870.5200.5341.0001.0421.0912-0969-2302140.3880.5200.5351.0001.0411.0912-0969-2302150.3880.5200.5351.0001.0421.0912-0969-2302160.3880.5210.5351.0001.0421.0912-0969-2302170.3890.5210.5351.0001.0421.0912-0969-2302180.3880.5200.5351.0001.0421.091平均值0.3880.5200.5341.0001.0421.091RSD/%0.1110.0650.0670.0000.0090.0182.3.5对照特征图谱的生成（见图10、图11）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F010图1021批甜叶菊提取物试样的多点校正图谱将上述21批样品的测定结果导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统[22-23]（2012年版），选定特征峰1~6进行多点校正，使用“生成对照”功能得到对照特征图谱，按其出峰顺序标记为1~6号峰。以上指认的6个特征峰均为甜叶菊提取物中的主要活性成分，为甜叶菊提物产品质量的整体评价提供依据。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F011图11甜叶菊提物对照特征图谱注：峰1为新绿原酸，峰2为绿原酸，峰3为隐绿原酸，峰4为异绿原酸B，峰5为异绿原酸A，峰6为异绿原酸C。2.3.6试样测定结果评判（见图12、表10）随机选取1个甜叶菊提取物试样图谱与对照特征图谱进行目测对比，观察其与对照特征图谱的6个特征峰是否相吻合。由图12可知，甜叶菊提取物试样图谱与对照特征图谱的6个特征峰均能一一对应，初步判断样品为甜叶菊提物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.F012图12对照特征图谱与试样图谱比对注：S1为试样色谱图，S2为参照物对照品的色谱图。以S峰为参照，计算试样中其他特征峰的相对保留时间，与规定值比较。由表10可知，各特征峰的相对保留时间均在规定值的±10%以内，符合要求，确认样品为甜叶菊提取物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.021.T011表10样品各特征峰相对保留时间与规定值比较色谱峰样品规定值相对偏差/%峰10.3830.3880.910峰20.5210.5200.136峰30.5370.5340.396峰41.0001.0000.000峰51.0431.0420.068峰61.0911.0910.0003讨论3.1色谱条件分析特征图谱具有特征性和稳定性等特点，使用的仪器类型、试剂类型和色谱条件等因素均会影响特征图谱的适用性。因此，在制定特征图谱时应对特征图谱测定方法的色谱条件进行充分考察[24-25]。绿原酸类物质极性中等，选择常用且便宜的非极性色谱柱（Agilent C18）而不用选择昂贵的疏水性色谱柱；采用DAD检测器对样品进行全波长扫描时，发现327 nm波长下色谱峰较丰富，响应较好，且基线平稳；在流速考察中，流速的大小会影响色谱峰的分离效果、柱效以及出峰时间，1.0 mL/min流速的出峰时间中等，在节约流动相的同时避免了色谱峰分离不及时等问题；柱温主要影响色谱峰的分离程度、峰型等，30 ℃的柱温能够有效分离色谱峰，比25 ℃柱温节省时间，提高了测试效率。为有效分离甜叶菊提物样品中各种有效成分，本研究对高效液相色谱仪检测波长、不同品牌色谱柱、流动相、流速、色谱柱柱温及进样量等因素进行了考察优化，得到了稳定可靠的色谱条件。3.2方法学考察分析植物提取物样品中成分复杂，而特征图谱作为评价其质量稳定可靠的定性鉴别手段，分析方法的可靠性直接影响测定结果。根据定性鉴别测定方法的要求，本研究重点考察了分析方法的稳定性、精密度和重复性，以各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差为评价指标，对各特征峰的相对保留时间和相对峰面积进行了一致性考察[26-27]。本试验结果表明，稳定性、精密度和重复性等试验中各特征峰相对保留时间的RSD均不大于3%，相对峰面积的RSD均不大于5%，建立的方法具有可靠性和可推行性。3.3质量控制分析植物成分复杂且易受环境等因素影响。为确保不同批次植物提取物的稳定性和饲料添加时产品的安全性和稳定性，需确立植物提取物中活性物质的检测方法，这也是确保植物提取物饲料添加剂行业健康发展的重要前提[28]。本试验中，21批次甜叶菊提物样品的特征峰相对保留时间的RSD均在3%以下，表明不同批次甜叶菊提物的特征图谱中主要峰出峰时间相对稳定，质量差异较小，这与李军等[29]的试验结果相似，表明该植物提取方法和工艺较为完善。由于本研究制定的甜叶菊提物特征图谱，原料来源只要符合法定规定即可，不做特别的要求，因此未对特征峰的相对峰面积比值进行规定[30]。4结论本试验收集21批次的甜叶菊提物样品，通过对色谱条件进行优化，建立了良好的分析方法，由此得到甜叶菊提取物的HPLC特征图谱，通过对照品比较指认了6种特征成分，分别为绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C，以上指认特征峰均为甜叶菊提物的有效成分，可在甜叶菊提物产品中得到溯源。以4号峰异绿原酸B为参照峰，各批次样品特征峰的相对保留时间的RSD均在3%以下，建立的甜叶菊提物HPLC特征图谱可实现对甜叶菊提物的质量评价。此外，本研究对所建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性等方法学考察，证明该方法有效可行，可用于甜叶菊提物质量的控制，为甜叶菊废渣资源综合开发和再利用提供了参考。