PCV2是一种单链DNA病毒，自20世纪90年代被发现以来，引起生猪养殖行业的广泛关注[1-2]。PCV2与多种临床和亚临床的猪病有关，统称为猪圆环病毒病（PCVD），其中最常见的是断奶后多系统衰竭综合征（PMWS），主要影响6~16周龄的断奶仔猪，表现为持续性消瘦。PCV2通常与环境、营养、感染等因素协同引发严重的临床表现[3]。PCV2主要在淋巴细胞中复制，并通过巨噬细胞在体内扩散[4]。PCV2可以直接感染和破坏淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞而导致免疫抑制，在感染后期导致仔猪淋巴组织萎缩、坏死和非特异性增生[3-4]。PCV2能够诱导PK-15细胞产生白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子，引起炎症反应，可以干扰NF-κB和MAPK途径，影响免疫相关基因的表达，并通过分子伪装或变异逃避宿主的免疫识别和清除[5-7]。山豆根（Sophora subprostrata）属于豆科槐属植物，具有清热解毒等功效。山豆根多糖（Sophora Subprosrate polysaccharide，SSP）是从山豆根中提取、纯化得到的一类水溶性多糖[8]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎和免疫调节等活性[9-11]。PCV2疫苗能够降低PCV2的排毒量，提高仔猪的存活率和增重率，减少经济损失。PCV2具有高度变异性和多样性，不同地区和群体之间的流行情况存在差异，目前尚无理想的PCV2疫苗。本研究旨在探讨山豆根多糖对PCV2感染免疫细胞产生炎症反应和免疫抑制的调节机制，以探讨山豆根多糖对PCV2感染的干预效果，为山豆根多糖的临床应用提供参考。1材料与方法1.1细胞与病毒小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系（RAW264.7细胞）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；PCV2由南京农业大学农业农村部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室分离保存，后经本实验室经猪肾细胞（PK15细胞）增殖，病毒滴度为105 TCID50/0.1 mL。1.2试验材料山豆根多糖（SSP）由广西大学动物科学技术学院基础兽医药理及毒理实验室分离、纯化制备，纯度为91.5%。DMEM高糖培养基、胎牛血清购自美国Gibco；磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，5×All-In-One RT MasterMix with AccuRT购自Abm公司，2×RealStar SYBR Mixture购自Genstar公司，总RNA提取试剂（TRIZOL）购自Takara生物科技有限公司，小鼠IL-1β、IFN-α、IFN-β和TNF-α等ELISA试剂盒购自泉州九邦生物，小鼠STAT1、STAT2、JAK1、TYK2、Ccl3、CXCL2、TNF-α、Rel、Nfκbia、Nfκbid、Nfκbiz等引物均由上海生工合，Stat1、p-Stat1、Stat2、p-Stat2、JAK1、p-JAK1和Tyk2一抗购自Affinity公司，IκB、p-IκB、p65、p-p65、CXCL2、TNF-α、β-actin一抗购自abcam，二抗购自赛维尔生物科技公司，ECL发光液购自新赛美生物科技公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒及WB及IP细胞裂解液均购自碧云天生物技术公司。1.3试验设计取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，加至6孔细胞培养板中，2 mL/孔，置于10% FBS-DMEM完全培养液中，于37 ℃、5% CO2下培养过夜使其贴壁后进行试验处理。设空白对照组、PCV2感染组、100 mg/L SSP组、200 mg/L SSP组和400 mg/L SSP组。待细胞生长融合至70%，吸弃上清液，PBS清洗细胞3遍，除空白对照组以外，每孔加入1 mL PCV2（病毒滴度为105 TCID50/0.1 mL），置于37 ℃、5% CO2下孵育2 h，吸弃病毒上清液，每孔加入PBS清洗3遍。100 mg/L SSP组、200 mg/L SSP组和400 mg/L SSP组分别加入含有100、200、400 mg/L SSP的10% FBS-DMEM完全培养液，空白对照组和PCV2感染组，每孔加入10% FBS-DMEM完全培养液。每组细胞置37 ℃、5％CO2培养箱分别培养至16 h小时，试验分组及处理方式见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.T001表1试验分组及处理方式组别病毒处理药物处理400 mg/L SSP组每孔加入1 mL PCV2病毒液，孵育2 h加入含400 mg/L SSP的10% FBS-DMEM完全培养液2 mL，培养16 h200 mg/L SSP组每孔加入1 mL PCV2病毒液，孵育2 h加入含200 mg/L SSP的10% FBS-DMEM完全培养液2 mL，培养16 h100 mg/L SSP组每孔加入1 mL PCV2病毒液，孵育2 h加入含100 mg/L SSP的10% FBS-DMEM完全培养液2 mL，培养16 hPCV2感染组每孔加入1 mL PCV2病毒液，孵育2 h加入10% FBS-DMEM完全培养液2 mL，培养16 h空白对照组加入10% FBS-DMEM完全培养液2 mL培养16 h1.4细胞总RNA提取与反转录RAW264.7细胞培养至16 h，吸弃6孔板中培养液，PBS清洗3遍后，每孔加入1 mL TRIzoL Reagent，冰上静置5 min，按照Takara细胞总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，使用超微量紫外分光光度计检测RNA的完整性，将A260 nm/A280 nm比值范围在1.8~2.0之间的RNA，按照abm 5×All-In-One RT MasterMix with AccuRT反转录试剂盒说明书将RNA反转录成为cDNA。1.5q-PCR检测mRNA表达水平按照1.3分组，收集1.4的cDNA样品，按照abm荧光定量试剂盒说明书检测RAW264.7细胞中各因子的mRNA表达水平，各基因引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.T002表2各基因引物序列基因引物序列（5'→3'）引物长度/bpSTAT1TGACGACCCTAAGCGAACTG103AGACATGGGAAGCAGGTTGTSTAT2TTCTTGTTCCACCTTCGGCA170ATGCAGGGCTGGGTTTCTACJAK1GCAGATGCCCACCATTACCT93TTCTGTGCAGATTGGACCGTTYK2CCCACTGTTTTCCACAAGCG101CCGTCATTGGTTGGGTCGTARelAACAACCGGACATACCCGTC175ACAAAGGTCTGCGTTCTGGTNfκbiaGCTGATGTCAACGCTCAGGA153GGTAAGCTGGTAGGGGGAGTNfκbidACCAGCCACTGATTGTGGAA136CCGGACTTAAACACAGCCGANfκbizGGCAGCGGAAGAAGCAAATC168TTCCTCATCAACAGGCGGACCcl3CAGCGAGTACCAGTCCCTTT137GCGCTGAGAAGACTTGGTTGCXCL2CACTCTCAAGGGCGGTCAA190GGTACGATCCAGGCTTCCCTNF-αAGCACAGAAAGCATGATCCG161ACCCCGAAGTTCAGTAGACAGGAPDHCATCACTGCCACCCAGAAGAC178ATTGGGGGTAGGAACACGGA1.6ELISA检测因子的水平200 mg/L SSP处理16 h后，收集细胞上清液，按照小鼠IL-1β、IFN-α、IFN-β、TNF-α等ELISA检测试剂盒说明书方法，酶标仪在OD450 nm条件下，检测RAW264.7细胞上清液中IL-1β、IFN-α、IFN-β、TNF-α的水平，建立标准曲线，并根据OD值计算IL-1β、IFN-α、IFN-β、TNF-α的水平。1.7Western blotting检测蛋白表达水平200 mg/L SSP处理RAW264.7细胞16 h，吸弃每孔细胞培养上清液，RAW264.7细胞经预冷的PBS洗涤3遍，每孔加入含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的细胞裂解液（150 μL/孔），置于冰上裂解5 min，利用细胞刮刀刮取细胞并吹打混匀细胞裂解液，按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定各样品蛋白浓度，收集各蛋白样品，样品经SDS-PAGE凝胶电泳后，将各蛋白分子转移至PVDF膜上，封闭1.5 h，进行一抗孵育过夜（4 ℃），TBST洗涤PVDF膜3遍后，进行二抗孵育2 h。TBST再次洗涤PVDF膜3遍后，将PCDF膜与ECL显色液反应3 min，使用蛋白成像系统观察蛋白条带，计算灰度值。1.8数据统计与分析试验数据采用SPSS 2.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行组间比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1SSP对PCV2感染RAW264.7细胞的mRNA表达的影响（见图1、图2）由图1可知，PCV2感染RAW264.7细胞16 h时后，RAW264.7细胞的STAT1、STAT2、JAK1、TYK2的mRNA表达水平显著上调（P0.05），Ccl3、CXCL2、TNF-α的mRNA表达水平显著下调（P0.05）。与PCV2感染组相比，100、200、400 mg/L SSP组STA1、STAT2、JAK1、TYK2的mRNA表达水平显著下调（P0.05），Ccl3、CXCL2、TNF-α的mRNA表达水平显著上调（P0.05）。其中，200 mg/L SSP的作用效果最好。图1PCV2对感染PCV2的RAW264.7细胞16 h的mRNA表达的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F1a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F1a2由图2可知，16 h时，PCV2感染RAW264.7细胞后，显著上调RAW264.7细胞的Nfκbia的mRNA表达水平（P0.05），下调了Rel、Nfκbid、Nfκbiz的mRNA表达水平。与PCV2感染组相比，100、200、400 mg/L SSP显著下调了Nfκbia的mRNA表达水平（P0.05），上调了Rel、Nfκbid、Nfκbiz的mRNA表达水平（P0.05）。其中，200 mg/L SSP的作用效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F002图2PCV2对感染PCV2的RAW264.7细胞16 h的mRNA表达的影响2.2SSP对PCV2感染RAW264.7细胞IFN-α、IFN-β、IL-1β和TNF-α水平的影响（见图3）综合上述结果，选择200 mg/L SSP用作后续试验。由图3可知，16 h时，PCV2感染RAW264.7细胞后，RAW264.7细胞的IFN-α和INF-β分泌水平显著上升（P0.05），炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌水平显著下降（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F003图3SSP对PCV2感染RAW264.7细胞的IFN-α、IFN-β和炎症因子水平的影响由图3可知，与PCV2感染组相比，200 mg/L SSP处理PCV2感染RAW264.7细胞组的IFN-α和INF-β分泌水平显著下降（P0.05），而IL-1β和TNF-α的分泌水平显著上升（P0.05）。2.3SSP对PCV2感染RAW264.7细胞的相关蛋白表达水平的影响（见图4~图6）由图4可知，PCV2感染RAW264.7细胞16 h后，RAW264.7细胞Stat1、p-Stat1、Stat2、p-Stat2的蛋白表达水平显著上调。其中，p-Stat1/Stat1和p-Stat2/ Stat2的比值也显著上升（P0.05）。经200 mg/L SSP处理，Stat1、p-Stat1、Stat2的蛋白表达水平和p-Stat1/Stat1的比值显著下调（P0.05），p-Stat2蛋白表达水平和p-JAK1/JAK1、p-Stat2/Stat2的比值略微下调但差异不显著（P0.05）。图4SSP对PCV2感染RAW264.7细胞p-Stat2、Stat2、p-Stat1、Stat1蛋白相对表达量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F4a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F4a2由图5可知，PCV2感染RAW264.7细胞16 h后，显著上调RAW264.7细胞TYK2、JAK1、p-JAK1的蛋白表达水平和p-JAK1/JAK1的比值（P0.05）。经200 mg/L SSP处理后，TYK2、JAK1和p-JAK1的蛋白表达水平显著下调（P0.05），p-JAK1/JAK1的比值略微下调，但与PCV2感染组相比差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F005图5SSP对PCV2感染RAW264.7细胞TYK2、p-JAK1、JAK1蛋白相对表达量的影响由图6可知，PCV2感染RAW264.7细胞16 h后，RAW264.7细胞CXCL2、TNF-α、IκB、p-IκB、p65、p-p65的蛋白表达水平显著下调（P0.05），p-p65/p-65的比值下调（P0.05）。p-IκB/IκB的比值下调但差异不显著（P0.05）。经200 mg/L SSP处理后，与PCV2感染组相比CXCL2、TNF-α、IκB、p-IκB、p65、p-p65的蛋白表达水平显著上调（P0.05）。图6SSP对PCV2感染RAW264.7细胞的CXCL2、TNF-α、p-p65、p65、p-IκB、IκB蛋白相对表达量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F6a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F6a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.23.013.F6a33讨论3.1PCV2感染RAW264.7细胞后激活JAK/STAT信号通路分析PCV2可通过调节模式识别受体TLRs、IFN和促炎细胞因子的表达，在感染的早期阶段诱导适应性免疫反应，从而导致过度免疫损伤而出现免疫抑制[12]。JAK/STAT是由细胞因子调节的主要信号通路之一，对于启动先天免疫、协调适应性免疫机制以及最终抑制炎症和免疫反应至关重要。JAK/STAT信号通路参与细胞因子受体下游信号传导途径，涉及免疫反应、细胞增殖、分化和凋亡等过程[13]。据报道，PCV2可以感染巨噬细胞，并激活JAK/STAT信号通路，而信号通路的激活反过来抑制了PCV2在免疫细胞中的复制和扩散；此外，PCV2可以诱导STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化，从而影响下游基因的表达[14]。PCV2感染巨噬细胞后，可以抑制IFN-α诱导的ISG15和Mx1基因的表达，从而降低宿主对PCV2的抗病毒能力[15]。已有研究发现，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在MARC-145细胞中可诱导STAT1的磷酸化，在猪肺泡巨噬细胞中，STAT1被感染PRRSV激活[16]。此外，PCV2感染后调节了仔猪TRIM21的表达，进一步增强了IFN-β的表达，PCV2和伪狂犬病毒共同感染通过NF-κB信号通路和JAK/STAT信号通路增强了免疫抑制[17]。在本研究中，PCV2感染RAW264.7细胞16 h后，STAT1、STAT2、JAK1、TYK2的mRNA表达水平以及Stat1、p-Stat1、Stat2、p-Stat2、JAK1、p-JAK1、TYK2的蛋白表达上调，表明PCV2感染可激活JAK/STAT信号通路。3.2PCV2感染RAW264.7细胞对IFN-α、IFN-β分泌的影响IFN-α、IFN-β和IFN-γ可通过激活有关的生物学途径增强PCV2的复制[18]。研究表明，在PCV2的Rep基因启动子中存在一个干扰素刺激的反应元件（ISRE），它是表达猪IFN-α的必要条件，从而影响IFN介导的PCV2的增强和病毒致病性[19]。此外，PCV2的基因组还含有一种寡核苷酸（ODN），它可以抑制IFN-α、IL-12p40、IL-10和IL-6的表达。因此，PCV感染不仅可以激活IFN的产生，还可以抑制IFN的表达[20]。在本研究中，PCV2感染RAW264.7细胞16 h后，Ⅰ型干扰素（IFN-α和IFN-β）分泌升高，而后JAK/STAT信号通路的相关细胞因子及蛋白表达水平上调，这说明PCV2感染可诱导RAW264.7细胞分泌Ι型干扰素，进一步诱导细胞产生免疫应答，同时干扰素与干扰素受体结合后，使JAK蛋白磷酸化，而进一步激活了JAK/STAT信号通路。3.3PCV2感染RAW264.7细胞对NF-κB信号通路抑制抗病毒反应的影响机体被病毒感染后，NF-κB信号通路被激活并参与细胞凋亡、炎症反应、免疫反应等[21]，NF-κB信号通路的激活可以诱导白细胞介素IL-1、IL-6、IL-8等产生[22]。NF-κB可以通过多种方式调节JAK/STAT信号通路的活性，包括直接或间接地调节JAK/STAT基因的表达。有研究发现，NF-κB信号对病毒刺激的Ⅰ型干扰素（IFN）的产生有负调节作用，如水泡性口炎病毒和仙台病毒可以诱导NIK和Nfκb2Lym1缺乏的小鼠的巨噬细胞的Ⅰ型IFN水平升高，而表达缺乏TRAF3结合序列的NIK稳定形式（NIKΔT3）的巨噬细胞可诱导Ⅰ型IFN的分泌减少，说明NF-κB竞争与IFN-β基因增强子结合，从而抑制IFN-β的转录[23]。在NF-κB信号通路中Nfκbia、Nfκbid和Nfκbiz等基因起着重要的调控作用。其中，Nfκbia编码的蛋白质IκBα是NF-κB信号通路中的一个重要负调节因子，可以抑制NF-κB的活化；Nfκbid编码的蛋白质IKBNS是NF-κB信号通路中的一个负调节因子，可以抑制NF-κB的活化；Nfkbiz编码的蛋白质IκBZeta是NF-κB信号通路中的一个转录因子，可以促进NF-κB的活化[24]。研究发现，PCV2病毒感染诱导IFN分泌并进一步激活了JAK/STAT信号通路，而SOCS3作为JAK/STAT信号通路关键的负调节因子可进一步与TNF相关受体（TRAF2相互作用）或NF-κB信号通路相互作用，导致了以TNF-α信号下调为特征的亚临床症状[25]，从侧面表明了PCV2通过抑制抗病毒反应调节炎症反应。3.4山豆根多糖的抗病毒活性分析研究表明，海带多糖对呼吸道合胞病毒（RSV）具有抑制活性，其可通过上调IRF3信号介导的IFN-α的产生而引起对RSV的抗病毒活性[26]；人参多糖通过促进MARC-145细胞中IL-6和IFN-γ的表达抵抗PRRSV感染[27]；酸性褐藻多糖可通过抑制细胞凋亡和诱导IFN-β发挥抗病毒活性[28]。在本研究中，200 mg/L SSP处理PCV2感染RAW264.7细胞16 h后，可干预PCV2诱导的IFN-α和IFN-β分泌水平的升高，使STAT1、STAT2、JAK1和TYK2的mRNA表达水平下降，干预PCV2感染导致的Rel、Nfκbid、Nfκbizd、TNF-α、CXCL2、Ccl3的mRNA表达水平下调；此外，在蛋白表达水平上也出现相似的调节作用。4结论PCV2感染RAW264.7细胞可激活JAK-STAT信号通路，进一步抑制NF-κB信号通路的激活，从而诱导免疫抑制的发生；200 mg/L SSP能够通过调控JAK-STAT/NF-κB信号通路，缓解PCV2感染RAW264.7细胞引起的免疫抑制。