杜仲叶中富含黄酮、绿原酸、环烯醚萜等多种天然活性成分，具有抗氧化、抗菌、提高机体免疫力和促进动物生长等功能。龚卫华等[1]研究发现，在饲粮中添加杜仲叶提取物能够改善湘黄土鸡鸡蛋的营养价值。黄酮类化合物是杜仲叶的主要活性成分之一，具有特殊的生理活性[2]。袁带秀等[3]研究发现，饲粮中添加杜仲叶黄酮能够在一定程度上缓解呕吐毒素诱导的断奶仔猪生长抑制，提高机体抗氧化能力。离子液体作为一种有机熔融盐，是各种化合物的增溶溶剂[4]，已在各种生物活性成分和高附加值化合物的提取分离中应用[5-7]。Albertsson[8]提出了两个不混溶的富水相构成的双水相可以作为一种对挥发性有机溶剂的传统液-液萃取技术的替代方法。离子液体双水相具有实施简单、易于放大化和生物相容性更好等优点[9-10]，已在从发酵液、天然基质和植物样品中回收蛋白质、碳水化合物、酶等高附加值产品中应用[11-13]。超声辅助萃取是从植物中提取天然化合物的一种高效技术。陈雪花等[14]采用响应面法优化了超声辅助酶法提取杜仲叶多糖工艺，结果表明，该工艺能够高效地提取杜仲叶多糖。目前未见关于将生物离子液体及其双水相、超声辅助萃取等技术整合进行杜仲叶黄酮提取分离的研究报道。因此，本研究基于生物离子液体的超声辅助萃取及其双水相分离杜仲叶黄酮的工艺条件，为杜仲叶黄酮高效分离提取提供参考。1材料与方法1.1试验材料与仪器杜仲叶（贵州本地采摘）清洗，干燥，粉碎。氯化717阴离子交换树脂、芦丁标准品、色谱级甲醇、氯化胆碱、色氨酸等其他试剂均购自阿拉丁。R-100旋转蒸发仪（瑞士步琪），SCIENTZ-950E超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司），AWL-0501-M超纯水机（美国艾科浦），TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），DZF-6050真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），1260高效液相色谱仪（安捷伦科技公司）。1.2试验方法1.2.1胆碱离子液体的制备采用两步法合成一系列胆碱氨基酸离子液体，从中选出能与磷酸钾构成双水相且能较好地破坏杜仲叶组织的胆碱色氨酸离子液体进行下一步提取分离试验。胆碱色氨酸离子液体的合成路线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.F001图1胆碱色氨酸离子液体的合成路线1.2.2杜仲叶黄酮的分离提取称取1 g杜仲叶粉末，按照一定液料比加入一定胆碱色氨酸离子液体，在特定超声条件下（功率5~950 W，工作频率20~25 kHz，超声循环方式3 s on/3 s off，超声探针直径7 mm，用循环液控温在60 oC）提取一定时间后，离心弃掉杜仲叶残渣，将收集的上清液转移至25 mL量筒中，并记录体积，加入一定量的饱和磷酸钾溶液，混匀，静置6 h以上，待其相分离平衡后，记录各相的体积并分离出上相，加入10~15倍体积的水稀释，置于4 oC冰箱过夜，待沉淀完全析出后过滤，真空干燥后得黄酮提取物。1.2.3单因素试验以杜仲叶中总黄酮提取率为指标，研究超声时间（min）、超声功率（W）、液料比（mL/g）对总黄酮提取产率的影响。单因素试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.T001表1单因素试验设计项目超声时间/min超声功率/W液料比/(mL/g)120、30、40、50、60、7040020240100、200、300、400、500、6002034040010、15、20、25、30、351.2.4响应面试验设计根据单因素试验结果进行响应面设计，具体试验因素和水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.T002表2响应面试验因素和水平设计水平A超声时间/minB超声功率/WC液料比/(mL/g)-1202001004040020160600301.2.5优化验证试验称取3份1 g的杜仲叶，按照1.2.2的工艺路线，选取优化修定的条件进行验证试验，同时将得到的黄酮提取物进行液相分析。1.3测定指标及方法1.3.1总黄酮标准曲线和含量总黄酮测定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法，分别精确配制9.64、19.28、28.92、38.56、48.20 mg/L芦丁标准溶液，按照文献[15]的方法显色后，在波长510 nm处测量其吸光度（A），得到总黄酮标准曲线为A=0.120 5+0.012 67C（R2=0.999 5）。使用移液器从提取液离心后的上清液中吸取一定量的检测液，分别置于25 mL的容量瓶中，按照上述方法测定吸光度，计算总黄酮提取率（Y）。Y=(cV/M)×100%(1)式中：c为离心后上清液中总黄酮的浓度（g/mL）；V为离心后上清液中总黄酮的体积（mL）；M为杜仲叶粉末的质量（g）。1.3.2黄酮提取物的液相分析将芦丁、槲皮素、山柰酚标准品用色谱级甲醇配置成不同浓度梯度的混合标准溶液，经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC检测，依据浓度和峰面积制成定量检测的标准曲线。称取少量黄酮提取物置于25 mL的容量瓶中，使用甲醇溶解定容，经0.45 μm的滤膜过滤后进行HPLC检测。流动相：甲醇-0.2%甲酸（48∶52），色谱柱为SB C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），柱温控制在40 oC，流速为1.0 mL/min，检测波长为360 nm，进样容积为10 μL。1.4数据统计与分析试验使用Design Expert、Excel、Origin软件进行响应面优化BBD设计与分析、标准曲线的回归分析与计算等。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1超声时间对杜仲叶总黄酮提取率的影响（见图2）由图2可知，随着超声时间延长，杜仲叶的总黄酮提取率逐渐升高。超声时间低于40 min时，杜仲叶的总黄酮提取率增加速度较快；超声时间在40~60 min时杜仲叶的总黄酮提取率增加缓慢；超声时间增加至70 min时总黄酮提取率有下降的趋势。这一趋势与许先猛等[16]固液萃取天然产物的相关研究结果相似。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.F002图2超声时间对杜仲叶总黄酮提取率的影响超声时间是影响提取率的重要因素之一。固液萃取过程中吸附与解吸平衡需要时间，超声时间延长会富集提取物，总黄酮提取率逐渐提高；但超声时间过长也会降低萃取液与杜仲叶基质之间的浓度梯度，从而降低传质。此外，过长的超声时间也会导致一些活性物质的分解和不良物质的渗出，从而导致总黄酮提取率降低。因此，本试验选择超声时间为20、40、60 min作为响应面试验中的3个水平。2.1.2超声功率对杜仲叶总黄酮提取率的影响（见图3）由图3可知，随着超声功率的增加，杜仲叶总黄酮提取率升高。在超声功率低于400 W时，总黄酮提取率增加速度较快；而在超声功率为400~500 W总黄酮提取率增加缓慢，且超声功率达600 W时总黄酮提取率有下降的趋势，与Pan等[17]研究结果相似。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.F003图3超声功率对杜仲叶总黄酮提取率的影响超声功率是超声辅助提取中影响目标物质提取率的重要因素之一。通常高功率会改善超声的腔化作用、增强搅动和热作用等，从而促进细胞内物质溶出，最终提高物质的提取率[18]；但功率太高可能会破坏超声的换能器和目标物质的某些结构，导致物质降解而使提取率下降[19]。因此，本试验选择超声功率为200、400、600 W作为响应面试验的3个水平。2.1.3液料比对杜仲叶总黄酮提取率的影响（见图4）由图4可知，在液料比为10~35 mL/g范围内，随着液料比增加，杜仲叶总黄酮的提取率逐步提高。这可能是由于较高的液料比可保证混匀，使溶剂渗透到杜仲叶组织内部深处，保证组织充分膨胀，从而扩大了溶剂与杜仲叶组织的接触表面积。此外，当黄酮成分从杜仲叶基质扩散到溶液中时，较高的液料比可以产生更大的浓度梯度。但当液料比超过20 mL/g后，杜仲叶总黄酮提取率增长缓慢；液料比超过30 mL/g后，杜仲叶总黄酮提取率基本保持稳定，这可能是因为溶液太稀，溶剂的继续增加而提高的浓度梯度，并不能继续提高提取率[19]。当液料比为35 mL/g时，杜仲叶总黄酮提取率最高可达2.74%，与前人报道的相关研究趋势相似[19-20]。因此，选择液料比10、20、30 mL/g作为响应面试验中的3个水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.F004图4液料比对杜仲叶总黄酮提取率的影响2.2响应面试验结果2.2.1响应面试验及方差分析结果（见表3、表4）将表3中A、B、C分别作为响应面试验的3个因素，总黄酮提取率Y为响应变量。根据表3响应面BBD优化试验结果使用软件Design-Expert 12.0进行数据分析，多元二次拟合得到的回归方程为：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.T003表3响应面试验结果试验号ABC总黄酮提取率/%140400202.32260400302.45360400101.72420200200.96520600202.04640600302.25720400101.14840200301.67940400202.321020400301.361140400202.651240400202.151340200101.121460600202.521540600101.911660200202.141740400202.43Y=2.37+0.42A+0.35B+0.23C-0.18AB+0.13AC-0.05BC-0.26A2-0.19B2-0.44C2。由表4可知，该模型P=0.000 20.01，说明基于试验数据分析的回归模型极显著，失拟项P=0.997 20.05，说明该试验模型拟合性好，试验设计可行。决定系数R2=0.963 2，说明杜仲叶中总黄酮提取率与模型预测值的一致性较好。根据F值可知，对杜仲叶总黄酮提取率影响大小为：ABC，且A、B、C对杜仲叶总黄酮提取得率影响极显著（P0.01）；AB、B2对杜仲叶总黄酮提取得率影响显著（P0.05）；A2、C2对杜仲叶总黄酮提取得率影响极显著（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.T004表4方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型4.410 090.490 325.090.000 2A1.390 011.390 070.930.000 1B1.000 011.000051.230.000 2C0.423 210.423 221.660.002 3AB0.122 510.122 56.270.040 8AC0.065 010.065 03.330.110 9BC0.011 010.011 00.560.477 1A²0.294 610.294 615.070.006 0B²0.159 310.159 38.150.024 5C²0.822 610.822 642.090.000 3残差0.136 870.019 5失拟项0.001 530.000 50.014 50.997 2纯误差0.135 340.033 8总和4.550 016注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著；R2=0.963 2。2.2.2各因素交互作用对杜仲叶总黄酮提取率的影响（见图5）表4中交互作用项AB的P=0.040 80.05，说明超声时间和超声功率的交互作用显著（P0.05）。3D响应面的坡面越陡（马鞍型），表明杜仲叶总黄酮的提取率影响越明显[21-22]，等高线形状呈椭圆形时说明两因素间交互作用显著，而呈圆形说明交互作用不明显[23-24]。图5（a）中超声时间和超声功率交互作用的等高线较接近椭圆形，表明交互作用显著（P0.05）；图5（b）中超声时间和液料比、图5（c）中超声功率和液料比的等高线比较接近圆形，表明两因素对应的交互作用不显著（P0.05）。图5各因素交互作用对杜仲叶总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.F5a1（a）超声功率和超声时间对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.F5a2（b）液料比和超声时间对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.F5a3（c）超声功率和液料比对总黄酮提取率的影响2.2.3优化验证分析经过响应面优化后，可知该提取工艺最佳参数为超声时间54.76 min、超声功率504.8 W、液料比23.5 mL/g，此时预测的总黄酮提取率为2.66%。为方便实际操作，修定提取工艺参数，即超声时间55 min、超声功率505 W、液料比24 mL/g，通过3次重复性验证试验得出，总黄酮提取率为（2.53±0.11）%，与预测值误差较小，说明该条件可作为超声辅助提取杜仲叶总黄酮的最佳条件。2.3黄酮提取物的液相分析芦丁、槲皮素和山柰酚是杜仲叶黄酮中存在的3种黄酮类化合物，其在360 nm处均有很强的紫外线吸收，所以HPLC检测波长设置为360 nm。芦丁、槲皮素、山柰酚混合标准品、黄酮提取物的高效液相色谱检测结果见图6。由图6可知，基于胆碱色氨酸离子液体的超声辅助萃取及其双水相分离，且以水为抗溶剂稀释富离子液体相得到的黄酮沉淀物中，芦丁在杜仲叶中含量最高，是杜仲叶中主要的黄酮类化合物，但杜仲叶中槲皮素含量很低，基本检测不到山柰酚。芦丁和槲皮素标准品在不同浓度梯度下的拟合曲线分别为Y1=15.64X1+17.86和Y2=38.70X2+2.98，R2分别为0.999、0.998，由此可得芦丁和槲皮素在黄酮沉淀物中的含量为50.88%和1.26%。因此，在设计从杜仲叶中提取分离黄酮类化合物的基于胆碱色氨酸离子液体的超声辅助萃取及其双水相分离方法中，以水作为相应的抗溶剂诱导黄酮沉淀最终有利于芦丁的分离富集。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.014.F006图6芦丁、槲皮素、山柰酚混合标准品、黄酮提取物的高效液相色谱检测结果注：１为芦丁，２为槲皮素，３为山柰酚。3结论本试验制备的胆碱色氨酸离子液体能够有效破坏杜仲叶组织，可加速活性物质溶出；响应面优化后，最佳提取条件为超声时间54.76 min、超声功率504.8 W、液料比23.5 mL/g，总黄酮提取率为2.66%。在修定的优化条件下，即超声时间55 min、超声功率505 W、液料比24 mL/g，杜仲叶总黄酮提取率为2.53%。提取液经双水相分离、抗溶剂水沉淀后得到黄酮提取物，液相图谱结果说明，其芦丁和槲皮素在黄酮沉淀物中的含量分别为50.88%和1.26%。因此，本研究得出的提取分离方法可作为杜仲叶黄酮特别是芦丁的绿色高效提取方法。