花色苷是花青素与糖以糖苷键结合而成的天然水溶性色素，在蔬菜、深色浆果、谷物种皮和薯类中尤为丰富[1]。研究表明，花色苷的抗氧化性很强[2]，能够减轻机体炎症反应[3]，降低糖尿病的发病风险，抑制动脉粥样硬化斑块形成，升高血浆高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量，降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量，改善血管硬度，调节血管收缩，降低血压，保护心血管健康。花色苷可抑制癌细胞的侵入和转移，具有很强的免疫保护作用[4]。此外，花色苷还具有减肥、保护视力和缓解眼部疲劳等功能，对机体健康具有积极的促进作用[5]。研究表明，增加富含花色苷的水果（蓝莓、葡萄和西梅）食用频率可显著降低2型糖尿病的发病风险[6]。花色苷作为天然的食用色素已广泛应用于医药、食品和化工等行业，使用天然色素代替合成色素是市场发展的必然趋势。花色苷主要的提取方法包括溶剂提取法、超高压法[7]、超声-微波协同法[8-9]、酶解法[10]以及超临界流体萃取法[11]等，其中酶解法主要是破坏植物的细胞壁，使花色苷等成分更易溶出[12]。郑覃等[13]优化了酶法提取黑果枸杞花色苷的工艺，花色苷含量达到24.675 mg/g。目前尚未见酶法辅助超声提取红菜苔花色苷的研究报道。因此，本研究利用酶法辅助超声提取红菜苔花色苷，以期为红菜苔花色苷的产业化生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料与仪器当季新鲜红菜苔购自红安县。无水乙醇、柠檬酸、磷酸氢二钠、pNPG、果胶酶、纤维素酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和阿卡波糖（98%）等均为分析纯（国药集团化学试剂公司）。721型可见分光光度计、FA1004B分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司），HH-S2数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），pHS-3C酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。1.2试验方法1.2.1红菜苔的预处理红菜苔剥皮，外皮放入低温烘箱至干燥，用粉碎机粉碎过后50目的筛子，即可得到红菜苔粉末，将其放入密封的容器中。1.2.2红菜苔花色苷提取工艺的优化（1）红菜苔花色苷的提取流程。称取1.0 g红菜苔粉，按一定液料比加入60%乙醇，添加一定量酶，将溶液用5%的盐酸溶液调至酶的最适pH值，45 ℃超声提取一定时间后，冷却，过滤，移取滤液1 mL，定容至25 mL，用盐酸溶液将其调至相同的pH值，在最大吸收波长530 nm下测定溶液吸光度，计算花色苷含量[14]。（2）单因素试验。以花色苷含量为评价指标，采用单一变量法进行试验。筛选酶的种类［空白、纤维素酶、果胶酶、纤维素酶∶果胶酶（1∶1）］后，分别考察超声时间（20、40、60、80、100 min）、pH值（1.2、2.2、3.2、4.2、5.2）、液料比（15、20、25、30、35 mL/g）、酶添加量（1‰、2‰、3‰、4‰、5‰）、提取次数（1、2、3、4）对花色苷提取效果的影响。（3）正交试验。在单因素试验结果的基础上，确定提取次数为2，并通过正交试验确定最优超声时间（A）、pH值（B）、液料比（C）和酶添加量（D）。正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.T001表1正交试验因素水平设计水平A/minBC/(mL/g)D/‰1201.22012402.22523603.23031.3花色苷含量计算方法因红菜苔花色苷主要成分为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷[15]，根据单一pH法[16]，用加酸乙醇水溶液定容至10 mL，空白对照为加酸乙醇水溶液，摇匀，静置30 min后，测定OD530 nm值，根据公式计算花色苷质量分数（MF，mg/g）。MF=A×V×N59.8×b×m (1)式中：A为吸光度；V为定容体积（mL）；N为稀释倍数；59.8为花色苷的平均消光系数；b为比色皿厚度（cm）；m为样品质量（g）。1.4降血糖活性研究1.4.1花色苷对α-淀粉酶的抑制参考汤陈鹏等[17]的方法，取不同浓度的样液20.00 μL和α-淀粉酶溶液（5.00 U/mL）20.00 μL，水浴锅37 ℃的条件下静置10 min；加入1%淀粉溶液40.00 μL，恒温37 ℃静置10 min；加入80.00 μL DNS试剂终止反应。在波长540 nm处测定吸光度。抑制率=(A-B)-(C-D)A-B×100%式中：A为不加样加酶管吸光度；B为不加样不加酶管吸光度；C为加酶加样管吸光度；D为不加酶加样管吸光度。1.4.2α-淀粉酶的抑制类型参考李雨鸿等[18]方法，固定淀粉酶浓度（5.00 U/mL），分别加入不同浓度（0、1.00、3.00 g/L）的花色苷溶液，测定可溶性淀粉溶液浓度分别为0.50、0.75、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L时的初速率。根据公式（2），以初速率（v）的倒数对底物浓度[S]的倒数作图，从而判断花色苷对α-淀粉酶的抑制类型。1v=KmVmax⋅1[S]+1Vmax (2)式中：v为反应速率［g/(L·min)］；Km为米氏常数；Vmax时酶反应最大速度［g/(L·min)］；[S]为底物浓度（g/L）。1.4.3花色苷对α-葡萄糖苷酶的抑制参考徐雅琴等[19]方法，取磷酸缓冲液（0.10 mol/L，pH值6.80）0.70 mL，不同浓度的样液0.10 mL和α-葡萄糖苷酶溶液（0.24 U/mL）0.10 mL，在37 ℃条件下水浴10 min；加入0.10 mL pNPG溶液（2.50 mmol/L），37 ℃下继续反应20 min；加入0.40 mL Na2CO3溶液（0.20 mol/L）终止反应。在波长405 nm处测定吸光度。计算公式同1.4.1。1.4.4α-葡萄糖苷酶的抑制类型参考李雨鸿等[18]的方法，固定α-葡萄糖苷酶浓度（0.24 U/mL），分别加入不同浓度的花色苷提取液（0、1.00、3.00 g/L），测定pNPG浓度分别为0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mmol/L时的初速率，判断方法同1.4.2。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1酶种类对花色苷含量的影响（见图1）由图1可知，与空白组和只添加一种酶的试验组相比，添加果胶酶和纤维素酶的试验组红菜苔皮花色苷含量最高（3.58 mg/g）。因此，本试验后续采用果胶酶和纤维素酶进行花色苷的提取。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F001图1酶种类对花色苷含量的影响2.1.2超声时间对花色苷含量的影响（见图2）由图2可知，在不改变其他因素的情况下，随着超声超声时间递增，花色苷含量先上升后递减，当超声时间为40 min时，大量花色苷已从组织中溶出，体系内花色苷浓度达到动态平衡；随着超声时间延长，花色苷的含量减少，这可能是因为随着超声时间延长，花色苷不但易呈氧化状态，并且过多的溶剂使得杂质成分大量析出，导致花色苷含量受到影响，因此超声40 min为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F002图2超声时间对花色苷含量的影响2.1.3pH值对花色苷含量的影响（见图3）由图3可知，随着pH值升高，花色苷含量迅速下降，pH值为2.2~4.2时花色苷含量变化平缓，pH值大于4.2后迅速下降，说明在pH值为2.2~4.2时，果胶酶和纤维素酶的活性最高，酶解反应效果最佳，且花色苷在酸性环境下呈现稳定性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F003图3pH值对花色苷含量的影响2.1.4液料比对花色苷含量的影响（见图4）由图4可知，随着液料比提高，花色苷含量先增加后减少。适当液料比有利于花色苷的扩散，但随着液料比提高，过量的溶剂溶出的不只是花色苷，还析出了杂质成分，对花色苷的含量造成了一定的影响[20]。当液料比25 mL/g时，花色苷含量达到最大值。因此，本研究选择最佳的液料比为25 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F004图4液料比对花色苷含量的影响2.1.5加酶量对红菜苔花色苷含量的影响（见图5）由图5可知，当加酶量小于2‰时，酶浓度小于底物浓度，花色苷含量随着加酶量的提高而增大；加酶量大于2‰时，底物与酶的浓度均达到饱和状态，花色苷含量递减。当酶添加量为2‰时，红菜苔花色苷含量达到最大值，为5.17 mg/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F005图5加酶量对花色苷含量的影响2.1.6提取次数对花色苷含量的影响（见图6）由图6可知，提取2次，花色苷提取率达到最大值，为6.36 mg/g；提取3次后，红菜苔中的其他物质也随之溶出，花色苷的提取率降低。本试验结果与左勇等[21]相同。因此，本试验将正交试验的提取次数固定为2次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F006图6提取次数对花色苷含量的影响2.2正交试验优化结果在单因素试验的基础上，进行正交优化试验，结果见表2，方差分析见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.T002表2正交试验结果项目因素花色苷含量/（mg/g）ABCD111116.50212327.06313235.18421335.89522217.11623126.22731225.89832137.37933315.12k16.246.096.706.24k26.407.186.066.29k36.135.516.026.15R0.271.670.680.14主次水平BCAD最佳组合A2B2C1D210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.T003表3正交试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值截距352.6881352.6887 831.7190.01A0.11820.0591.3150.432B4.32522.16348.0210.020C0.86020.4309.5490.095误差0.09020.045注：R2=0.983，P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。由表2、表3可知，红菜苔花色苷最佳提取参数为溶液pH值2.2、超声时间40 min、液料比20 mL/g、加酶量2‰，影响其含量的因素顺序为pH值＞液料比＞超声时间＞加酶量。使用正交试验的最佳组合作为条件进行验证试验，提取的花色苷含量为7.61 mg/g，是未加酶且未优化前的空白组（3.41 mg/g）的2.23倍。因此，酶法辅助超声提取红菜苔花色苷是一种比较优良的提取方法，超声时间短、效率高、成本低。2.3花色苷对血糖的影响2.3.1花色苷对α-淀粉酶的抑制活性（见图7）由图7可知，花色苷对α-淀粉酶具有抑制效果，花色苷浓度为1.00~7.00 g/L时，抑制率随着浓度增大而提高，具有量效依赖关系；花色苷浓度增大到7.00 g/L时，花色苷对α-淀粉酶的抑制率为77.00%，但小于同浓度阿卡波糖的抑制率[22]。此外，花色苷的IC50值为3.32 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F007图7花色苷对α-淀粉酶的抑制活性2.3.2花色苷对α-淀粉酶的抑制作用类型米氏常数Km为反应速率v达到最大反应速度一半时的底物浓度。在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数。花色苷对α-淀粉酶抑制类型的双倒数曲线，见图8。直线在横坐标上的截距为-1/Km，纵截距为1/Vmax，计算Km与Vmax，结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F008图8花色苷对α-淀粉酶抑制类型的双倒数曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.T004表4花色苷对α-淀粉酶的抑制Vmax和Km结果花色苷浓度/(g/L)Vmax/[g/(L·min)]Km/(g/L)01.5880.33011.0662.51931.5754.700由表4可知，Vmax和Km的值随着花色苷浓度变化而变化，抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但又不能分解，说明花色苷对α-淀粉酶为反竞争抑制类型。2.3.3花色苷对α-葡萄糖酶的抑制活性（见图9）由图9可知，花色苷对α-葡萄糖苷酶具有抑制效果；在浓度4.00~8.00 g/L时，抑制率随着花色苷浓度的增大而提高，呈现量效依赖关系；浓度增大到7.00、8.00 g/L时，花色苷对α-葡萄糖苷酶的抑制率为66.00%和86.00%。此外，花色苷对α-葡萄糖苷酶的半抑制率IC50为6.46 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F009图9花色苷对α-葡萄糖酶的抑制活性2.3.4花色苷对α-葡萄糖酶的抑制作用类型花色苷对α-葡萄糖酶的抑制类型的双倒数曲线，见图10，Km与Vmax结果见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.F010图10花色苷对α-葡萄糖酶的抑制类型的双倒数曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.015.T005表5花色苷对α-葡萄糖酶的抑制Vmax和Km结果花色苷浓度/(g/L)Vmax/[g/(L·min)]Km/(g/L)00.075 94.96510.132 013.31130.248 41.878由表5可知，Vmax和Km的值随着花色苷浓度变化而变化，说明花色苷对α-葡萄糖苷酶为反竞争的抑制类型。3结论本试验通过酶法提取超声辅助提取红菜苔皮花色苷，通过单因素试验结果设计正交试验，由此得出酶法提取超声辅助的红菜苔皮花色苷最佳提取条件为超声时间40 min、酶解pH值2.2、液料比20 mL/g、加酶量2‰、提取次数2次。在正交试验得出的每个因素的最佳水平下进行验证试验，得出花色苷含量为7.61 mg/g。通过体外降血糖的试验，发现红菜苔花色苷对α-淀粉酶和α-葡萄糖酶均具有一定的抑制效果。花色苷对α-淀粉酶的IC50值为3.32 g/L，对α-淀粉酶的抑制是反竞争的抑制；花色苷对α-葡萄糖酶IC50值为6.46 g/L，对其也是反竞争的抑制。综上所述，酶法提取超声辅助提取红菜苔皮花色苷的工艺得到优化，并且证明了红菜苔中花色苷具有降血糖的作用。但本试验存在一定的误差，使用红菜苔皮提取时，花色苷中存在纤维素等其他成分需要进一步纯化，还需要通过动物试验验证其在体内的生物活性。