鱼类的体表与水环境直接接触,黏液作为鱼体的第一道免疫防线,由上皮细胞和表皮杯状细胞分泌并覆盖整个体表,还具有调节渗透压、润滑和传递鱼类种内化学信息等多种重要的生理作用[1]。黏膜表面的上皮细胞层分泌黏液细胞,并产生黏液分泌物覆盖在上皮细胞顶端形成保护层[2]。国外研究人员率先对鱼类表皮黏液进行探索,发现鱼类存在体表黏膜免疫系统[3],能够独立完成抗原摄取、呈递及抗体分泌[4]。近年来,国内对鱼类体表黏膜的组织结构进行了研究,对于解析鱼类的黏膜免疫机制及鱼病防治起到了推动作用[5]。鱼类体表黏液的研究主要集中于黏液中存在的免疫因子的鉴定与分离,收集黏液的方法遵循国际对动物试验的3Rs原则,即取代(Replacement)、精致(Refinement)和简约(Reduction),要求生命科学研究应采取其他手段代替动物试验,改进试验方法,减少动物数量和痛苦,以符合道德方面考量[6]。目前,对鱼类黏液成分的研究已取得了一定进展,主要集中于一些具有吞噬作用的细胞以及介导一系列免疫或应激反应蛋白分子的研究[7-8]。文章结合国内外研究成果对鱼类体表黏液的组成成分、功能研究及应用前景等方面进行了综述,以期为鱼类体表黏液的深层次的研究及应用提供参考。1鱼类表皮黏液的组成鱼类表皮黏液主要是由表皮杯状细胞和上皮细胞分泌。组成鱼类体表黏液的干重物质中含量最多的是蛋白质类,其占比达55%[9]。除蛋白成分以外,体表黏液还含有少量黏多糖、脂质以及其他小分子物质。此外,个别种类鱼体的体表黏液中还含有有毒成分从而起到自我防御的作用,但这些成分尚未得到明确分离及鉴定[10]。以下对体表黏液的主要成分及其功能进行详细介绍。1.1鱼类表皮黏液中的蛋白及肽类1.1.1免疫球蛋白免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是鱼类以及其他脊椎动物获得性免疫中重要的功能分子,其在鱼类的黏膜相关淋巴组织(mucosal-associated lymphoid tissue,MALT)及黏液中大量分布,并在系统免疫和黏膜免疫组织中共同发挥保护作用[11]。鱼类是最早进化出免疫球蛋白的脊椎动物,同时具有T淋巴细胞和B淋巴细胞,具备系统免疫和黏膜免疫的功能[12]。在动物种系进化过程中,硬骨鱼类开始出现免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白D(IgD)[13],到两栖类开始出现免疫球蛋白G(IgG),哺乳动物中出现了免疫球蛋白A(IgA)。2005年后,人们相继在斑马鱼[14](Danio rerio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、河鲀(Fugu rubripes)和鲤鱼(Cyprinus carpio)[15]中发现了一种具有多样性的新型Ig,在斑马鱼中为免疫球蛋白Z(IgZ),在虹鳟中为免疫球蛋白T(IgT),而鲤鱼中则是IgM-IgZ的嵌合体。张永安[16]通过探究虹鳟IgT的免疫功能,发现虹鳟受一种黏孢子虫(Ceratomyxa shasta)感染后,肠黏液中IgT含量和抗体滴度分别提高了51倍和160倍,IgM含量变化不大,但在血清中的抗体滴度提高了1 264倍,表明IgT和IgM功能存在差异,但均在机体免疫中起到重要作用。IgD是一种非常原始的抗体类型,出现在所有有颌类的脊椎动物中,但不存在于鸟类和一部分哺乳动物中[17]。IgM具有抗体活性,当宿主被病原菌感染时,IgM能够通过系统免疫和黏膜免疫应答起到对抗作用[18-19]。IgT功能与哺乳动物和鸟类的IgA相似,在鱼类的黏膜免疫中发挥重要作用。ZHANG等[20]在对虹鳟鱼IgT功能的研究中发现,虹鳟鱼IgT的免疫应答仅存在于肠道中,而IgM只能在血清中参与表达,因此IgT很可能是专一参与虹鳟鱼肠道黏膜免疫的类型。JIAN等[21]发现,斑马鱼体内IgT亚类中的两种免疫功能明显不同,细菌感染后两种IgT依次表现出诱导作用,但只有一种IgT参与皮肤黏膜免疫。在脊椎动物中,黏膜的作用不仅是隔离机体与环境,还能够帮助机体抵抗外界微生物,防止其他因素影响机体[22]。1.1.2溶菌酶溶菌酶(lysozyme,LZM)是一种抗菌剂,在鱼类先天性免疫系统中发挥重要作用。LZM是一种分子量为14~18 kDa的蛋白质,多数由中性粒细胞和单核细胞分泌,少部分由巨噬细胞和富含白细胞的组织分泌,如肾脏、脾脏、皮肤黏液、鳃和消化道[19]。鱼类LZM存在于许多鱼类的体表黏液、肠道黏液、血清和巨噬细胞中,是非特异性免疫系统的重要组分,细胞壁中的不溶性黏多糖通过水解,将细胞壁肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的3-1, 4糖苷键分解成可溶性糖肽,细胞壁破裂后细菌裂解,肽聚糖碎片释放,肽聚糖碎片诱导合成与分泌各种抗菌蛋白,从而诱导产生溶菌酶[23]。影响LZM抗菌活性的因素有很多,其中包括季节、环境温度、压力、鱼种、性别、鱼龄和免疫刺激物质等因素。在生产中,经常会添加一定剂量的中药提取物增强体表黏液LZM的合成,从而提高鱼体免疫能力。陈恒等[24]研究发现,在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的饲料中添加300~600 mg/kg黄芪多糖(APS)时,LZM的免疫效果逐渐增强;添加900~1 800 mg/kg APS时,添加量越大达到最佳免疫效果越早,超出该范围会出现抑制作用。1.1.3凝集素凝集素(lectin)作为不具有酶催化活性的糖蛋白,是鱼类体表黏液中的免疫活性物质,可在一定程度上保护鱼体免遭外界环境中的病菌、寄生物和病毒侵袭[25-26]。至今为止,科学家共发现4种鱼类体表黏液凝集素:半乳凝集素、C型凝集素、Lily型凝集素和L-鼠李糖结合凝集素,分别分离自康吉鳗(Conger eel)、日本鳗鲡(Anguilla japonica)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)和颈带鲾(Leiognathus nuchalis)[27]。凝集素能够与荧光素、酶、生物素、铁蛋白及胶体金等结合,用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究工作中[28]。鱼类体表黏液凝集素对于不同类型的细菌具有不同程度的凝集活性,可作为粗略鉴定病原微生物的指示因子[29]。1.1.4抗菌肽鱼类体表黏液中含有许多的多肽类物质,能够抑制微生物的生长繁殖[30]。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是鱼类自然免疫系统中的一类小分子物质,具有广谱高效抗菌性[31]。目前,人们已从鱼类中鉴定到70多种抗菌肽,如apoA-I、AsCath-1、AsCath-2、cathelicidin、hepcidin等[32]。鱼类体表黏液抗菌肽分子量一般为2~10 kDa,大多由20~60个氨基酸残基组成,结构与组成复杂多样[33]。鱼类体表黏液中的抗菌肽是对细菌起到直接抑制作用的一类物质,具有抗细菌、真菌、病毒和肿瘤的作用,且不易产生抗药性。晋高伟[34]通过分离鉴定鲶鱼(Silurus asotus)体表黏液抗菌肽,发现鲶鱼体表黏液提取物具有较好的广谱抗菌性和稳定性,且其中的抗菌肽对温度、pH值和紫外照射不敏感。SEO等[35]从金枪鱼(Thunnus albacares)皮肤中分离出一种抗菌肽(YFGAP),对革兰氏阴性菌包括大肠杆菌D31(Escherichia coli D31)、大肠杆菌ML35p(Escherichia coli ML35p)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)和阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的有效抑菌浓度为0.9~12.0 mg/L,对革兰氏阳性菌如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和黄曲霉菌(Aspergillus flavus)的有效抑菌浓度为0.7~13.0 mg/L,表明YFGAP对细菌表现出广谱的抗菌性。综上所述,鱼类体表黏液抗菌肽对微生物具有显著的抑制作用,且溶解性好,性质稳定[36]。1.2鱼类表皮黏液细胞鱼类表皮基底层细胞衍生成为黏液细胞,进而分泌黏液。基底层细胞逐渐向皮肤表层推移,经过形成阶段、成熟阶段、功能阶段和退化阶段等4个发育期,每个阶段的细胞形态和分泌物随细胞发育时期有所改变[37]。SIBBING等[38]对鲤鱼黏液细胞进行分析,利用高铁双胺染色法(HID染色法)和过碘酸-Shift试剂与阿尔新兰联合染色法(AB-PAS染色法)观察细胞,发现鲤鱼黏液细胞主要呈现囊状、梨状和杯状等3种形态。在此基础上,安利国等[39]按照黏液细胞的分泌产物进行分类,按黏液细胞经过AB-PAS染色后呈现的颜色将鱼类的黏液细胞分为4个类型:Ⅰ型细胞染色后呈红色,含有PAS阳性的中性黏多糖;Ⅱ型细胞染色后呈蓝色,含有AB阳性的酸性黏多糖;Ⅲ型细胞染色后呈紫红色,主要含PAS阳性的中性黏多糖,同时含有少量AB阳性的酸性黏多糖;Ⅳ型细胞染色后为蓝紫色,主要含AB阳性的酸性黏多糖,同时还含有少量PAS阳性的中性黏多糖。黏液细胞广泛存在于鱼类的体表,4种黏液细胞分布在不同种类鱼体的体表,生长环境和生长阶段均是造成差异的因素。黏液细胞不同的分布情况使鱼类能够更好地适应生长环境,发挥正常的生理功能。陈楚等[40]采用常规石蜡切片以及AB-PAS染色法发现葛氏鲈塘鳢(Perccottus glenii)头部的黏液细胞数量最多,比背部多15.4%,比腹部多38.0%,比尾部多56.7%;而黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)背部的黏液细胞数量最多,比头部多42.5%,比腹部多46.6%,比尾部多51.4%,由此得出无鳞鱼和有鳞鱼的鱼体表面黏液细胞分布情况不同的结论。2鱼类表皮黏液的功能鱼类表皮黏液是鱼体与外界水环境之间的物理及免疫屏障,在一定程度上起到保护鱼体的作用。鱼类表皮黏液的功能诸多,因此进一步深层次探究鱼类表皮黏液尤为重要。2.1调节机体渗透压鱼类是脊椎动物中种类最丰富的类群,由于其生活环境各异,鱼体为适应环境而具有不同的渗透压。鱼类表皮黏液在一定程度上起到调节鱼体内外渗透压的作用。淡水鱼体内渗透压较高,经常处于高渗状态;海水鱼体内渗透压较低,经常处于低渗状态,黏液层可改善此类情况,有助于保持体内适当的盐浓度。鱼类黏液还可隔开鱼体表面和空气,调节渗透压,防止体表水分流失,提供基本的生存保障[41]。Schreiber[42]研究发现,在比目鱼(Paralichthys olivaceus)的体表黏液中含有线粒体的细胞起到调节渗透压的作用,能够促进机体离子交换。2.2预防病原体鱼类表皮黏液可在一定程度上防止传染性病原体入侵。鱼类表皮黏液是一个不断分泌和脱落的动态层,具有多种功能,其中最重要的是对传染性病原体的防护[22],在防止寄生物、细菌和真菌方面起到重要作用。此外,鱼类表皮黏液还可以充当鱼类和周围感染性微生物之间的屏障,防止病原体附着,还可在抗菌剂的帮助下直接杀死病原体,保护鱼类免受侵害[43]。LI等[44]研究发现,鲶鱼体表黏液中含有的抗菌肽CF-14浓度为62.5 mg/L时,CF-14对腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)的抗菌作用与50 mg/L氨苄西林相似,具有一定的抗菌作用。2.3其他功能鱼类表皮黏液在鱼类的日常行为中也具有很多重要作用。鱼类表皮黏液会在鱼类运动的过程中帮助鱼体减少摩擦,使鱼能够以最少的能量达到最快的移动速度[45]。由于体表黏液中含有黏多糖,尤其是透明质酸,黏多糖结合大量的水后有助于鱼类在离开水体时保持身体湿润[46]。鲤形目和鲇形目的鱼类体表黏液中含有一种蝶呤类物质,可以起到警戒作用;鱼类体表的黏液还具有凝结和沉淀水中悬浮物的作用,可在一定程度上清洁水体[47]。七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)采用不同寻常的亲代抚育方法,由于黏液中含有蛋白、激素和抗体等成分,能够促进子代的存活和生长,鱼苗孵化后会以亲代的皮肤黏液为食[48]。3鱼类体表黏液的应用及展望鱼类表皮黏液易取得,且采集方法温和不伤鱼体[6],可为动物疾病防治、药物研发、临床应用、环境治理及活鱼运输等动物生产中面临的困难提供可行的解决方法,对动物生产实践起到不可小觑的作用。3.1鱼类表皮黏液在药物研发方面的价值陈丽萍等[49]发现,大鲵(Andrias davidianus)体表黏液中的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶会抑制血小板凝集,抑制率分别为26.65%、33.87%和48.98%,与阿司匹林对血小板凝集的抑制率(32.57%)不相上下,在临床中可应用于多种疾病的防治,包括血栓栓塞性疾病、伴有血小板聚集性增高的高血压以及动脉粥样硬化等。张萌等[50]研究大鲵皮肤黏液糖蛋白对人肺癌细胞A549的影响,发现当40 mg/L大鲵黏液糖蛋白作用24 h时,抑制率可达85.66%;作用48 h时,抑制率可达92.32%。与阳性对照药紫杉醇相比,大鲵皮肤黏液糖蛋白对人肺癌细胞A549起到了明显的抑制作用,此研究结果对研发抗肺癌药物具有参考价值。KWAK等[51]发现,在30、50、100 mg/L鳗鱼皮肤黏液中,人白血病K562细胞死亡率分别达到5.9%、14.9%和39.0%,表明鳗鱼皮肤黏液在一定程度上可诱导人白血病K562细胞凋亡。刘权伟等[52]以腐败希瓦氏菌和大肠杆菌为试验对象,研究鲶鱼体表黏液抗菌肽的抑菌活性,发现鲶鱼体表黏液抗菌肽通过桶板模型机制(Barrel-Stave model)发挥抑菌作用,对腐败希瓦氏菌和大肠杆菌的生长均具有明显的抑制作用,且最小抑菌质量分数分别为0.063%和0.032%。周同[53]对鲇(Silurus asotus)表皮黏液进行蛋白质组学分析,找到588个黏液特异性蛋白并对其进行功能注释分析,推测鱼类表皮黏液分泌可能与能量供应和钙离子信号密切相关,为黏液腺生物反应器奠定基础,从而在一定程度上解决蛋白质药物紧缺的问题。3.2鱼类表皮黏液在环境治理方面的应用鱼类表皮黏液可为水体环境治理提供材料。随着工业发展,湖泊、海洋等水体出现严重污染的现象。通过检测鱼类体表黏液化学成分的变化,可为环境治理提供基础数据。张红梅[54]研究黄河中的重金属铅对鲤鱼黏液细胞成分变化的影响,发现铅浓度达到一定程度会刺激鱼体分泌黏液细胞,从而分泌更多的酸性黏多糖。也有研究发现,免疫相关的溶菌酶具有一定的指示作用,圆鰕虎鱼(Ctenogobiusgiurinus)体表黏液可作为戈尔甘湾污染的生物标志物[55]。MONTENEGRO等[56]对鱼皮黏液中的细菌群落数据进行统计分析,比较其组成和位点之间的细菌丰度和位点状态,发现鱼类表皮黏液中的细菌群落能够反映周围水质从而监测污染。EKMAN等[57]取黑头呆鱼(Pimephales promelas)的体表黏液进行代谢组处理并分析,评估雄性和雌性黑头呆鱼对环境污染物双酚A的暴露情况。还有研究发现,欧雅鱼(European chub)黏液中的皮质醇含量和污染程度成正比例,可作为栖息地水环境质量的生物标志物[58-59]。3.3鱼类表皮黏液在水产养殖中的应用鱼类表皮黏液中的抗菌肽具有广谱高效抗菌性,为代替传统抗生素药物提供参考。BHATNAGAR等[60]研究发现,抗生素氯霉素对大肠杆菌的杀菌效果为25.90 mm,印度囊鳃鲶体表黏液对大肠杆菌的杀菌效果为32.0 mm,而胡鲶体表黏液对大肠杆菌的杀菌效果为28.16 mm,证明印度囊鳃鲶体表黏液对细菌的杀菌效果更高,可以作为动物可用抗生素的天然替代物来源。BULLOCH等[61]利用F2异前列腺素(F2-isoprostances)测定黏液中的糖蛋白、凝集素、溶菌酶、抗菌肽等成分水平评价鱼类免疫力水平。ZHAO等[62]通过筛选半滑舌鳎黏液中的miRNAs,经实时定量PCR验证后发现健康鱼体和感染哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)鱼体之间存在极大差异,为鱼病检查提供参考。BRAGADEESWARAN等[63]通过对印度舌鳎(Cynoglossus arel)和海鲢(Arius caelatus)体表黏液提取物的抗菌、溶血活性和免疫调节活性进行分析,发现鱼体表黏液提取物对人类病原体和溶血活性具有积极作用,但仍需要进一步提纯和分离活性抗菌化合物以确定其可能的应用价值。查蒙[41]从泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)体表黏液能维持体表湿润及鳃的气体交换特点获得猜想,将泥鳅黏液涂抹在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体表,发现涂抹泥鳅黏液后凡纳滨对虾存活率达到84.4%,未涂抹的对照组存活率为66.7%,由此证明无水运输中在虾的体表涂抹鱼类黏液可有效提高存活率。3.4鱼类表皮黏液在其他方面的应用鱼类表皮黏液可作为重要的医用生物材料。在泌尿系统中插放膀胱镜、导尿管时通常令病人感觉十分痛苦。陶德华等[64]模拟皮肤与塑料器械的摩擦试验中,载荷20 N时,鳝鱼体表黏液和常用的医用白油平均摩擦系数分别为0、0.126 μ;载荷98 N时,其平均摩擦系数分别为0.067、0.203 μ,发现十分滑腻的鳝鱼体表黏液可有效缓解病人的疼痛感。海葵鱼(Amphiprion ephippium)[65]受一层厚厚的体表黏液的保护,能够躲在海葵的触须中,这种黏液可充当物理屏障,保护鱼免受刺丝囊的侵害;但黏液不会削弱海葵的刺痛能力,保护性黏液涂层只能防止鱼被蜇伤。此外,海葵鱼的黏液会刺激水母触须上的毒刺细胞,使海葵鱼可以畅通无阻地穿行于水母之间[66]。管唇鱼(Cheilio inermis)[67]的嘴唇与其他鱼不同,呈蘑菇状层状,这种由杯状细胞排列的卷曲上皮将黏液分泌到嘴唇的外表面,与其他珊瑚礁鱼类的嘴唇相比,它与鱼肠的上皮更相似。组织学分析表明,管唇鱼的嘴唇可能提供类似的保护性黏液层,产生的黏液既可以保护嘴唇组织免受珊瑚刺丝囊的侵害,还能够作为密封剂以增强接触吸食。刘钧[68]研究发现,未清洗的鲍鱼(Abalone)腹足表面黏附力约38.7 mN,超声清洗20 min后腹足黏液层消失,表面黏附力为21.3 mN。之后利用等离子处理法和倒模法制备PDMS微纳表面的加工工艺设计了一款新型隔膜型仿生吸盘,为水下机器人的工作提供了有力保障。4展望与其他动物相比,鱼类最早具备较完整的免疫系统,探究鱼类的黏膜免疫系统对探索生物界免疫系统具有重要意义。鱼类疫病频发始终是鱼类生长繁殖过程中面临的重大难题,鱼类黏膜免疫也是影响口服或浸泡疫苗发挥作用的障碍,鱼类表皮黏液是鱼体隔绝外界环境保护鱼体的第一道屏障。在鱼类生产实践及动物的疾病防治中的作用引起了广泛关注。目前对鱼类体表黏液的组成成分以及生理功能上的研究已经取得了一定进展,但鱼类黏膜免疫应答的分子机制仍需进一步研究。因此,今后的研究应致力于解析鱼类体表黏液的免疫机制,开发改善黏膜免疫的新型渔药,为鱼类疾病防治提供新方向。
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