猪链球菌（Streptococcus suis，SS）为革兰氏阳性、兼性厌氧性溶血性球菌[1]，是一种常见的人畜共患病病原菌[2]。猪感染猪链球菌后的死亡率明显提高[3]，给养猪业造成了巨大的经济损失[4]。相关研究发现，SS共有35种血清型，其中猪链球菌2型（SS2）是最常见和毒力最强的血清型[5]。临床中常使用抗生素应对SS2的感染[6]，但抗生素会造成细菌产生耐药性[7]。此外，随着我国对食品安全问题重视程度的不断提高，药物在动物疫病防控中的使用日趋严格，因此疫苗在动物疫病的预防中具有重要作用[8]。本研究以SS2 CVCC60615株为试验对象，将胰酪大豆胨液体培养基（TSB）作为基础培养材料，通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、响应面分析、培养基效果验证试验、SS2不同时间点的抗原活性测定试验和小鼠感染试验，研制高抗原活性SS2疫苗培养基并进行效果评价，为工业化疫苗的生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌种猪链球菌2型CVCC60615株保存于广东环凯生物科技有限公司。1.1.2主要试剂与培养基胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基由广东环凯生物科技有限公司提供。胰酪蛋白胨、酵母粉、牛肉浸粉、促生长肽、商品化氢氧化铝佐剂灭活疫苗、SS2小鼠血清和氢氧化铝佐剂由广东环凯生物科技有限公司提供。葡萄糖、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钾和甲醛购自国药集团化学试剂有限公司。TMB显色液和TMB显色终止液购自上海碧云天生物技术有限公司。BCA法蛋白质浓度测定试剂盒、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体和脱脂奶粉购自上海生工生物工程有限公司。1.1.3试验动物100只6周龄体重18~22 g SPF级BALB/c雌性小鼠由广东斯嘉景达生物科技有限公司提供。1.1.4仪器设备THZ-92B气浴恒温振荡器（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司），ZHTY-70E型振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司），HKP-9132A型电热恒温培养箱、HKG-9130A型电热恒温鼓风干燥箱（广东环凯微生物科技有限公司），立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司），HVE-50型立式压力蒸汽灭菌器（株式会社平山制作所），Multiskan FC酶标仪（赛默飞世尔上海仪器有限公司），JJ500型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂），酸度计（赛多利斯科学仪器北京有限公司），Bio-R-10 L型生物反应器（上海启为生物科技有限公司），Ⅱ级B2生物安全柜BSC-1360－LⅡB2（北京东联哈尔仪器制造有限公司）。1.2试验方法1.2.1菌种的活化与种子液的制备将冷冻保存的SS2 CVCC60615菌株从-80 ℃冰箱中取出，在TSA培养基上划线后放入37 ℃恒温培养箱内培养18 h，挑取单菌落接种至TSB培养基中，于37 ℃、150 r/min条件下培养12 h，之后以2%的接种量转接至装有TSB培养基的三角瓶中，于37 ℃、150 r/min条件下培养5 h后制成种子液。1.2.2菌密度的测定与菌落计数将种子液以2%的接种量接种于TSB培养基中，于37 ℃、150 r/min条件下培养10 h，每隔1 h取样一次，利用酶标仪测定菌液的OD620 nm值，并采用稀释平板计数法测定活菌数。1.2.3培养基不同pH值对比试验在25 ℃条件下，将TSB培养基灭菌前pH值分别调至7.3、7.5、7.7、7.9、8.1和8.3，121 ℃高压灭菌15 min，测量发现灭菌后pH值与灭菌前基本一致，之后将活化后的菌液以2%的接种量转接至不同pH值的TSB中，于37 ℃、150 r/min条件下培养10 h，每隔1 h取样一次，利用酶标仪测定菌液的OD620 nm值，对比分析细菌生长过程中OD620 nm值的最大值，确定最适pH值。1.2.4培养基成分单因素试验以TSB培养基为基础分别探究不同添加量的胰酪蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、K2HPO4、牛肉浸粉、促生长肽和NaCl对SS2菌体密度的影响。改变某一成分的含量并保持其他成分的含量不变。胰酪蛋白胨的添加量分别为3、5、7、9、11、13 g/L；酵母粉的添加量分别为1、2、3、4、5 g/L；葡萄糖的添加量分别为1、2、3、4、5 g/L；K2HPO4的添加量分别为1、2、3、4、5 g/L；牛肉浸粉的添加量分别为0、1、2、3、4、5 g/L；促生长肽的添加量分别为1、2、3、4、5 g/L；NaCl的添加量分别为0、1、2、3、4、5、6、7 g/L；以2%的接种量，于37 ℃、150 r/min条件下培养12 h，测量菌液OD620 nm的最大值，每组试验重复3次。1.2.5Plackett-Burman试验（见表1）在上述单因素试验结果的基础上，确定了各成分的最佳添加量，将生长过程中菌液OD620 nm的最大值作为评价指标，设计包含胰酪蛋白胨（A）、酵母粉（B）、葡萄糖（C）、K2HPO4（D）、牛肉浸粉（E）、促生长肽（F）和NaCl（G）的7因素2水平Plackett-Burman试验，挑选出对SS2菌体密度影响显著的因素[9]，每组试验重复3次。1.2.6最陡爬坡试验在上述Plackett-Burman试验结果的基础上选择影响SS2 OD620 nm值的3个显著因素，进行最陡爬坡试验，每组试验重复3次。1.2.7Box-Behnken响应面试验依据Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验的结果，利用Design-Expert 8.0.6.1软件中Box-Behnken模块进行响应面试验设计[10]。选择胰酪蛋白胨（X1）、葡萄糖（X2）和促生长肽（X3）为自变量，将菌液OD620 nm的最大值（Y）为响应值设计响应面试验的因素和水平，每组试验重复3次。Box-Behnken响应面试验因素与水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T001表1Plackett-Burman试验设计水平ABCDEFG-111.004.004.003.002.003.005.00113.755.005.003.752.503.756.25g/L10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T002表2Box-Behnken响应面试验因素与水平设计水平X1X2X3-112.04.63.4012.54.93.6113.05.23.8g/L1.2.8培养基发酵验证试验使用10 L发酵罐分别对SS2疫苗培养基和对照TSB培养基进行发酵试验，发酵体积为5 L，2%的接种量，37 ℃、150 r/min条件下培养10 h，每隔1 h取样一次，利用酶标仪测定菌液的OD620 nm值，并采用稀释平板计数法测定活菌数，试验重复3次。1.3SS2不同时间点的抗原活性测定试验利用SS2疫苗培养基发酵培养菌株，取发酵不同时间点的菌液离心重悬后超声破碎，收集上清蛋白稀释至同一浓度（10 mg/L）后，将SS2灭活疫苗免疫小鼠得到的血清作为一抗，利用ELISA法测定发酵培养过程中SS2不同时间点对应的免疫球蛋白G（IgG）抗体效价，并根据IgG抗体效价评估SS2不同时间点的抗原活性。1.4小鼠感染试验使用SS2疫苗培养基发酵培养菌株，分别在菌液活菌数最大时和SS2抗原活性最高时收集菌体，加入0.2%的甲醛溶液灭活17 h，将氢氧化铝佐剂与灭活后菌液按照1∶9混匀制成灭活疫苗，其佐剂、疫苗中含菌量与商品化氢氧化铝佐剂灭活疫苗相同。将100只6周龄体重18~22 g BALB/c雌性小鼠随机分为5组，每组20只，即活菌数最大时疫苗组、抗原活性最高时疫苗组、商品化疫苗组、攻毒对照组和空白对照组，每只小鼠免疫100 μL，空白对照组和攻毒对照组注射生理盐水，共免疫2次，间隔14 d。每次免疫14 d后从各组任选3只小鼠取血采用ELISA法测免疫效价，第2次免疫14 d后从各组剩余小鼠中随机挑选10只，每只小鼠注射100 μL，攻毒剂量为4 LD50（LD50=2.13×108 CFU），空白对照组注射生理盐水，观察并记录7 d内小鼠出现的临床症状和死亡情况。1.5数据统计与分析利用Graphpad prism 9.1.1软件对试验数据进行单因素方差分析，Design-Expert 8.0.6.1软件进行Plackett-Burman试验和Box-Behnken响应面试验分析。根据数据分析结果建立回归模型，并验证模型。2结果与分析2.1培养基pH值对菌体密度的影响（见图1）由图1可知，pH值在7.3~7.7范围内，SS2的菌体密度随pH值的变大而增大；pH值为7.7时，SS2的菌体密度最大，OD620 nm值为0.468；pH值大于7.7后，SS2的菌体密度随之显著降低。因此，SS2的最适pH值为7.7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.F001图1培养基pH值对菌体密度的影响2.2培养基成分单因素试验结果（见图2）由图2可知，培养基成分中胰酪蛋白胨（A）、酵母粉（B）、葡萄糖（C）、K2HPO4（D）、牛肉浸粉（E）、促生长肽（F）和NaCl（G）的最适添加量分别为11、4、4、3、2、3、5 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.F002图2培养基成分单因素试验结果2.3Plackett-Burman试验结果（见表3、表4）根据表1中的各因素与水平，进行Plackett-Burman试验，测量菌液OD620 nm值的最大值结果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T003表3Plackett-Burman试验结果试验号ABCDEFGOD620 nm值1-1111-1-1-10.65221-111-1110.75931-1-1-11-110.6594111-1-1-110.7095-111-11110.6996-1-1-1-1-1-1-10.5277-11-111-110.5778-1-11-111-10.707911-1-1-11-10.7301011-1111-10.71211-1-1-11-1110.669121-1111-1-10.734由表4的回归分析结果可知，各因素与OD620 nm值（Y）的一次回归方程为：Y=0.68+0.039A+0.002B+0.032C+0.006D+0.003 5E+0.035F+0.000 833 3G；模型P0.05、决定系数R2=0.925 0、模型信噪比（Adeq Precision）=9.0634，说明该模型显著可靠，能够准确地描述试验影响因素与菌体密度之间的关系[11]。其中胰酪蛋白胨（A）、葡萄糖（C）和促生长肽（F）均是显著影响因素（P0.05）。因此，根据Plackett-Burman试验结果选择胰酪蛋白胨（A）、葡萄糖（C）和促生长肽（F）这3个因素进行最陡爬坡试验，另外4个因素在后续试验中均保持原有水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T004表4Plackett-Burman试验的回归分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型0.046 070.659 7×10-27.050 00.039 0A0.019 010.019 019.840 00.011 2B0.480 0×10-410.480 0×10-40.051 00.831 9C0.012 010.012 013.270 00.021 9D0.432 0×10-310.432 0×10-30.460 00.534 1E0.147 0×10-310.147 0×10-30.160 00.712 1F0.015 010.015 015.560 00.016 9G0.833 3×10-510.833 3×10-50.890 7×10-20.929 3残差0.374 2×10-240.935 6×10-3总离差0.050 011注：P0.05表示影响显著。2.4最陡爬坡试验结果（见表5）由各因素与OD620 nm值（Y）的一次回归方程可知，胰酪蛋白胨、葡萄糖和促生长肽对响应值的系数均为正，表明其添加量与SS2的生长密度呈正相关，应相应增加其用量。因此，设计最陡爬坡试验进一步分析胰酪蛋白胨、葡萄糖和促生长肽的添加量，确定最佳中心点。由表5可知，在第4组试验附近出现了3个显著影响因素的最佳中心点，所以将第4组试验作为响应面试验的中心点[12]，即胰酪蛋白胨添加量12.5 g/L、葡萄糖添加量4.9 g/L和促生长肽添加量3.6 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T005表5最陡爬坡试验结果试验号胰酪蛋白胨/(g/L)葡萄糖/(g/L)促生长肽/(g/L)OD620 nm值111.04.03.00.721211.54.33.20.736312.04.63.40.753412.54.93.60.765513.05.23.80.749613.55.54.00.743714.05.84.20.7382.5Box-Behnken响应面试验结果（见表6、表7、图3）根据最陡爬坡试验结果，使用Design-Expert 8.0.6.1软件，选择胰酪蛋白胨（X1）、葡萄糖（X2）和促生长肽（X3）为自变量，将菌液OD620 nm的最大值（Y）作为响应值进行Box-Behnken响应面试验。通过Design-Expert 8.0.6.1软件对表6试验结果进行分析，得到OD620 nm值（Y）与胰酪蛋白胨（X1）、葡萄糖（X2）、促生长肽（X3）的二次多项回归方程：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T006表6Box-Behnken响应面试验结果试验号X1X2X3Y10000.77220-110.64130-1-10.54940000.769501-10.66661010.61770000.734810-10.60490110.67410-10-10.543110000.74812-1010.614130000.752141100.67915-1100.62616-1-100.569171-100.557Y=0.755+0.013 1X1+0.041 1X2+0.023X3+0.016 2X1X2-0.014 5X1X3-0.021X2X3-0.092 6X12-0.054 6X22-0.067 9X32由表7可知，此回归模型P0.01，表明此模型效应极显著[13]；失拟项P=0.841 10.05不显著，表示此模型能较好地拟合实际情况，对试验的优化分析有价值[14]；此模型决定系数R2=0.988 10.900 0，校正决定系数R2Adj=0.972 70.900 0，R2Pred=0.951 9，且R2Adj与R2Pred的差值小于0.2，模型信噪比（Adeq Precision）=21.136 94，变异系数（CV）=1.99%10%，表明本试验的误差较小，回归模型的相关性较好[15]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T007表7响应面试验的回归分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型0.098 090.010 964.440 00.000 1X10.137 8×10-210.137 8×10-28.130 00.024 7X20.013 510.013 579.770 00.000 1X30.423 2×10-210.423 2×10-224.950 00.001 6X1X20.105 6×10-210.105 6×10-26.230 00.041 3X1X30.841 0×10-310.841 0×10-34.960 00.061 3X2X30.176 4×10-210.176 4×10-210.400 00.014 6X120.036 010.036 0212.980 00.000 1X220.012 610.012 674.080 00.000 1X320.019 410.019 4114.370 00.000 1残差0.118 7×10-270.169 6×10-3失拟项0.203 2×10-330.677 3×10-40.275 00.841 1纯误差0.984 0×10-340.246 0×10-3总离差0.100 016注：P0.01表示影响极显著；P0.05表示影响显著。对上述二次多回归方程分析得到响应曲面图和等高线图[16]，见图3。响应曲面越陡，等高线越密集，表示影响越显著；等高线越接近椭圆，表示两个因素的交互作用越强[17]。图3各因素交互作用对OD620 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.F3a1（a）胰酪蛋白胨（X1）与葡萄糖（X2）对OD620 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.F3a2（b）胰酪蛋白胨（X1）与促生长肽（X3）对OD620 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.F3a3（c）葡萄糖（X2）与促生长肽（X3）对OD620 nm值的影响由图3（a）可知，当葡萄糖（X2）添加量恒定，胰酪蛋白胨（X1）添加量为12.0~12.5 g/L时，OD620 nm值随胰酪蛋白胨（X1）添加量的增加而增大，当胰酪蛋白胨（X1）添加量高于该区间时，OD620 nm值随胰酪蛋白胨（X1）添加量的增加而减小。由图3（b）可知，当胰酪蛋白胨（X1）添加量为12.4~12.6 g/L，促生长肽（X3）添加量为3.6~3.7 g/L时，OD620 nm值最大。由图3（c）可知，当促生长肽（X3）添加量为3.6 g/L时，OD620 nm值与葡萄糖（X2）添加量大致呈正相关。利用Design-Expert 8.0.6.1软件分析得到X1、X2和X3最优添加量为胰酪蛋白胨（X1）12.5 g/L、葡萄糖（X2）5 g/L及促生长肽（X3）3.6 g/L，预测OD620 nm值（Y）为0.764。因此，研制得到的SS2疫苗培养基配方为胰酪蛋白胨12.5 g/L、葡萄糖5 g/L、促生长肽3.6 g/L、酵母粉4 g/L、K2HPO4 3 g/L、牛肉浸粉2 g/L和NaCl 5 g/L。2.6培养基发酵验证试验结果（见图4）由图4可知，SS2在商品化TSB培养基中6 h达到稳定期，此时OD620 nm值约为0.416，活菌数约为4.53×108 CFU/mL；而使用SS2疫苗培养基进行发酵培养，5 h到达稳定期，此时OD620 nm值为0.744与预测OD620 nm值0.764基本一致，活菌数约为1.09×109 CFU/mL，其最大活菌数是TSB培养基的2.41倍。图4SS2疫苗培养基与TSB培养基的生长曲线和活菌数对比10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.F4a1（a）生长曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.F4a2（b）活菌数结果表明，SS2疫苗培养基发酵密度高，发酵效果稳定，可用于SS2的发酵制苗生产。2.7SS2不同时间点的抗原活性测定结果（见表8）由表8可知，6 h时，SS2的活菌数最大，此时小鼠血清中IgG抗体效价为1∶9 600；7、8、9 h时，SS2的活菌数较6 h有略微下降，但小鼠血清中IgG抗体效价最高，均为1∶12 800。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T008表8SS2不同时间点的抗原活性测定结果时间/hOD620 nm值活菌数/(CFU/mL)小鼠血清IgG抗体效价20.1212.7×1071∶1 20030.1848.1×1071∶3 20040.3091.3×1081∶6 40050.6536.9×1081∶6 40060.7311.1×1091∶9 60070.7269.9×1081∶12 80080.7139.8×1081∶12 80090.6969.6×1081∶12 800因此，在SS2发酵培养过程中，当菌液的活菌数达到最大值后1~3 h内细菌的抗原活性最高。2.8小鼠感染试验结果（见表9、表10）由表9可知，二免14 d后小鼠血清中IgG抗体水平与一免14 d相比均有大幅度升高，其中二免14 d后抗原活性最高时疫苗组小鼠血清中IgG抗体效价最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T009表9灭活疫苗免疫对小鼠血清IgG抗体的影响组别一免14 d后IgG抗体效价二免14 d后IgG抗体效价活菌数最大时疫苗组1∶1 2001∶9 600抗原活性最高时疫苗组1∶1 6001∶12 800商品化疫苗组1∶1 6001∶9 600由表10可知，商品化疫苗组和活菌数最大时疫苗组小鼠均死亡2只，免疫保护率均为80%；抗原活性最高时疫苗组小鼠死亡1只，免疫保护率为90%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.016.T010表10灭活疫苗对小鼠免疫保护率的影响组别数量/只死亡数/只保护率/%PBS对照组100100攻毒对照组10100活菌数最大时疫苗组10280抗原活性最高时疫苗组10190商品化疫苗组102803讨论目前，虽然关于SS2的研究报道较多，但关于SS2培养方面的相关报道很少，尤其是缺少SS2疫苗培养基。在实际应用中商品化TSB培养基被更多地用于发酵培养SS2，但其存在培养生长周期较长、成本较高和活菌数低等缺点，难以在实际大规模生产中使用。因此，研制出适合SS2工业化大规模发酵生产、原料易获得、价格低廉、能够大幅度提高活菌数的疫苗培养基迫在眉睫。此外，目前用于防控SS2的疫苗主要为灭活疫苗[18]，且通常认为制备灭活疫苗的发酵菌液中活菌数越大，其抗原活性越高，疫苗的保护效果就越好。因此，制备灭活疫苗时通常选择活菌数最大的时间点收集菌体。这样虽然能够降低经济成本，但是活菌数最大时细菌的抗原活性不一定最高。研究发现，在细菌生长的不同阶段中，细菌表达的抗原蛋白种类及表达量均有所不同[19]，导致使用不同生长阶段的细菌制成疫苗的保护效果也存在差异。因此，本试验利用间接ELISA法测定发酵培养过程中SS2不同时间点对应的IgG抗体效价，并根据IgG抗体效价的大小评估SS2不同时间点的抗原活性。4结论本研究通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面分析得出，SS2疫苗培养基的配方为胰酪蛋白胨12.5 g/L、葡萄糖5 g/L、促生长肽3.6 g/L、酵母粉4 g/L、K2HPO4 3 g/L、牛肉浸粉2 g/L和NaCl 5 g/L。培养基发酵验证试验结果表明，在发酵培养过程中，SS2疫苗培养基菌液的最大活菌数为1.09×109 CFU/mL，是TSB培养基最大活菌数的2.41倍。测定SS2不同时间点的抗原活性，结果发现，在SS2发酵培养过程中当活菌数达到最大值后的1~3 h内细菌的抗原活性最高。小鼠感染试验结果表明，SS2抗原活性最高时制备的灭活疫苗与商品灭活疫苗相比具有更高的IgG抗体效价和疫苗保护率。综上所述，本试验研制了具有高抗原活性的SS2疫苗培养基，并制备出了IgG抗体效价高、免疫保护力强的灭活疫苗，为SS2灭活疫苗的工业化生产提供参考。