锌是动物机体必需的微量元素之一，参与机体内300多种酶和蛋白的组成[1]。饲粮中适量添加锌能够促进动物机体的生长发育，预防仔猪腹泻[1-3]。锰是促进动物机体性腺发育的重要微量元素之一，适量添加锰有助于机体生长繁殖，增强机体抗氧化能力和免疫力[4-5]。但无机微量元素不稳定，在动物消化道中会迅速解离，并与其他化合物相互作用，导致机体的消化利用率低，从而使动物排泄物中富含重金属，易造成环境污染[6]。氨基酸螯合微量元素可提高微量元素的利用率，具有生物学效价高、利于消化吸收和稳定性强的特性[7]。其中羟基蛋氨酸螯合物结构明确，不易离解、吸潮结块，对油脂、酶制剂和维生素等氧化破坏少，在饲料加工和储存运输过程中化学稳定性强。但目前关于氨基酸螯合物在地方特有鸡种生产中的应用鲜见报道。雪峰乌骨鸡是湖南特有的肉蛋兼用型乌骨鸡品种，肉蛋营养价值和经济价值较高，但雪峰乌骨鸡生产性能不高的问题阻碍了该品种的发展与推广。因此，本试验在雪峰乌骨鸡饲粮中添加不同剂型的羟基蛋氨酸螯合物，探究其对雪峰乌骨鸡生产性能、抗氧化能力、免疫性能及繁殖激素含量的影响，为羟基蛋氨酸螯合物在家禽生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验动物与材料雪峰乌骨鸡由湖南云飞凤农业发展有限公司提供。羟基蛋氨酸锌（MHA-Zn）（锌≥12%，羟基蛋氨酸≥28%）、羟基蛋氨酸锰（MHA-Mn）（锰≥12%，羟基蛋氨酸≥28%）、预混料均由湖南省长沙市兴嘉生物工程股份有限公司提供。1.2试验设计试验选用32周龄体重相近且健康的黄羽雪峰乌骨鸡324只，按随机分配原则分为3组，每组6个重复，每个重复18只鸡。预试期2周，正式试验期8周。对照组雪峰乌骨鸡饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中添加30 mg/kg MHA-Zn（MZ组）、25 mg/kg MHA-Mn（MM组）、30 mg/kg MHA-Zn+25 mg/kg MHA-Mn（MZM组）。试验选用玉米-豆粕型基础饲粮，雪峰乌骨鸡营养水平参考《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004）[8]配制，根据中国饲粮成分表（第15版）计算饲粮配方，基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.008.T001表1基础饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米65.00代谢能/(MJ/kg)11.30大豆粕25.00粗蛋白/%16.78石粉6.50赖氨酸/%0.78磷酸氢钙1.00蛋氨酸/%0.39预混料2.50蛋氨酸+胱氨酸/%0.55钙/%3.50有效磷/%0.30注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 9 000 IU、VD3 2 500 IU、VE 20 IU、VK3 1 mg、VB2 5.5 mg、烟酰胺30 mg、泛酸9 mg、叶酸0.75 mg、Zn 60 mg、Fe 75 mg、Mn 75 mg、Cu 8 mg、I 1 mg、Se 0.30 mg、Ca 6.75 g、总磷1.125 g、NaCl 3.5 g、蛋氨酸60 g。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理试验采用3层阶梯式鸡笼，每笼饲养3只雪峰乌骨鸡。每日喂料2次（6：30、14：30），每日收蛋1次（16：00），每3 d收集一次剩余饲料并称重记录。雪峰乌骨自由采食和饮水，每天光照16 h。1.4测定指标及方法1.4.1生产性能正式试验开始时，参照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》[9]记录并计算各处理组的产蛋率、种蛋合格率、料蛋比、平均蛋重、受精率、孵化率、健雏率和死胚率。记录每只雪峰乌骨鸡连续称3个以上的蛋重，求平均值，群体记录连续称3 d产蛋总重，求平均值，即为平均蛋重。产蛋率=统计期内的总产蛋数/(入舍总母禽数×统计日数)×100%(1)种蛋合格率=合格种蛋数/产蛋总数×100%(2)料蛋比=产蛋期消耗饲料总量/总产蛋量(3)受精率=受精蛋数/入孵蛋数×100%(4)孵化率=出雏数/受精蛋数×100%(5)健雏率=健雏数/出雏数×100%(6)死胚率=死胚数/受精蛋数×100%(7)1.4.2血清指标1.4.2.1样品采集试验最后1 d，每个重复选取2只雪峰乌骨鸡，翅静脉采血5 mL，静置后离心，用1.5 mL离心管分装上清液，按组别编号并标注日期，置于-20 ℃冰箱保存[10]。1.4.2.2繁殖激素指标使用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司），采用Rayto RT-6100酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）测定促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）、雌二醇（E2）、黄体酮（Prog）、甲状旁腺激素（PTH）含量。以上指标标准曲线为：yFSH=10.652x-0.545 3（R2=0.994 3）、yLH=11.219x-0.273 4（R2=0.996 6）、yE2=278.77x-5.016 0（R2=0.996 6）、yProg=16.711x-0.377 8（R2=0.993 7）、yPTH=66.197x-3.614 7（R2=0.997 0）。1.4.2.3抗氧化指标使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定总超氧化物歧化酶（T-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、铜锌超氧化物歧化酶（Cu-Zn-SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等指标，具体操作方法参考试剂盒说明书。1.4.2.4免疫指标使用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司），采用Rayto RT-6100酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）测定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白细胞介素-2（IL-2）的含量，计算方法参照试剂盒说明书，其指标标准曲线为：yIgA=182.75x-1.721 5（R2=0.992 2）、yIgG=1 353.3x-31.183 0（R2=0.995 5）、yIgM=471.82x-16.264 0（R2=0.998 5）、yIL-2=173.51x-6.970 0（R2=0.996 4）。1.5数据统计与分析采用SPSS 21软件进行单因素方差分析，差异显著时，采用Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡生产性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，试验组雪峰乌骨鸡的产蛋率和健雏率均显著升高（P0.05）。MZM组孵化率显著高于对照组和MM组（P0.05）。MZ组和MZM组死胚率显著低于对照组和MM组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.008.T002表2羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡生产性能的影响项目产蛋率/%平均蛋重/（g/枚）料蛋比平均日采食量/[g/(只·d)]种蛋合格率/%受精率/%孵化率/%健雏率/%死胚率/%对照组50.69b45.783.6787.9197.9392.7194.17b95.63b5.83aMZ组53.58a45.863.5888.1298.0493.7095.37ab97.17a4.63bMM组53.60a45.743.5488.3298.2692.4394.65b97.33a5.35aMZM组54.27a46.083.5189.3398.5192.2896.25a97.47a3.75b标准误0.440.090.030.181.920.470.280.190.28P值0.0200.5420.2660.3120.4650.7330.0360.0100.031注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡血清繁殖激素的影响（见表3）由表3可知，MZM组雪峰乌骨鸡血清Prog、FSH、E2和PTH的含量显著高于对照组、MZ组和MM组（P0.05）。MZM组乌骨鸡血清LH含量显著高于对照组和MM组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.008.T003表3羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡血清繁殖激素的影响项目FSH/(IU/L)LH/(IU/L)E2/(ng/L)Prog/(g/L)PTH/(ng/L)对照组8.55b11.55b320.48b16.97b49.54cMZ组7.68c12.06ab297.79c17.05b54.09bMM组8.23b10.83c312.54bc17.37b52.12bcMZM组8.94a12.41a363.15a20.58a58.14a标准误0.120.166.061.700.94P值0.0100.0100.0100.0100.0102.3羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡血清抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，MZM组雪峰乌骨鸡血清CAT、T-SOD的活性均显著高于对照组和MZ组（P0.05）。MZM组雪峰乌骨鸡血清Mn-SOD、GSH-Px的活性均显著高于对照组和MM组（P0.05）。MM组和MZM组雪峰乌骨鸡血清MDA含量显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.008.T004表4羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡血清抗氧化指标的影响项目T-SOD/(μg/L)Cu-Zn-SOD/(μg/L)Mn-SOD/(μg/L)CAT/(ng/L)MDA/(μmol/L)GSH-Px/(μg/L)对照组61.83c58.703.13c3.70c3.76a1 698.13cMZ组66.38c47.5818.80ab3.94c3.37ab2 722.13abMM组75.93ab61.8814.06b4.30ab2.50b2 440.53bMZM组85.63a64.6720.96a4.49a2.64b2 892.80a标准误3.022.791.730.100.18116.69P值0.0170.1700.0100.0160.0350.0102.4羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡血清免疫指标的影响（见表5）由表5可知，MZM组雪峰乌骨鸡血清中IL-2、IgA含量显著高于对照组和MM组（P0.05）。MZM组血清IgG含量显著高于对照组、MZ组和MM组（P0.05）。各试验组血清IgM含量显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.24.008.T005表5羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡血清免疫指标的影响项目IgA/(mg/L)IgG/(mg/L)IgM/(mg/L)IL-2/(ng/L)对照组161.34b1 204.16b354.46b155.67bMZ组170.62ab1 195.88b387.50a157.80abMM组165.07b1 101.37c387.85a147.94cMZM组177.62a1 465.35a411.27a168.69a标准误2.1432.396.522.19P值0.0250.0100.0100.0103讨论3.1羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡生产性能及血清繁殖激素的影响氨基酸微量元素螯合物可以降低动物肠道中金属离子的螯合作用，在较低pH值下可以提高微量元素的稳定性。本试验发现，饲粮中添加羟基蛋氨酸螯合物可以提高雪峰乌骨鸡的产蛋率、孵化率和健雏率，降低死胚率。荆佳林等[11]研究表明，与对照组（添加100 mg/kg硫酸锌）相比，饲粮中添加75、100 mg/kg MHA-Zn可以显著提高56周龄哈伯德肉种母鸡产蛋后期的平均蛋重和产蛋率。陈娜娜等[12]在饲粮中添加70、140 mg/kg蛋氨酸锌，结果发现，20周龄海兰白蛋鸡的日产蛋重和产蛋率显著提高。产蛋性能与机体分泌的繁殖激素有关，如FSH、LH可调节卵泡的生长、发育和成熟[13-14]，从而影响产蛋率。赵晓钰等[15]研究表明，试验组伊犁鹅血清促性腺激素释放激素（GnRH）、FSH、LH及E2浓度较高，其产蛋率也相对较高。本试验中，MZM组雪峰乌骨鸡血清FSH、E2和PTH的含量显著高于对照组、MZ组和MM组，这说明复合使用羟基蛋氨酸螯合物有助于促进雪峰乌骨鸡繁殖激素的分泌。本试验中，与对照组相比，在各试验组饲粮中添加羟基蛋氨酸螯合物可显著提高乌骨鸡的产蛋率，平均蛋重有提高的趋势。原因可能是羟基蛋氨酸螯合的微量元素促进了雪峰乌骨鸡机体繁殖激素的分泌，进而提高了产蛋率。本试验中，MZM组雪峰乌骨鸡血清FSH含量高于MZ组和MM组。原因是FSH与卵泡颗粒细胞的受体结合后，促进雄激素转化为E2，刺激成熟卵泡颗粒细胞释放Prog；E2促进生殖器官细胞的生长和分化，调节类固醇的产生，促进卵巢颗粒细胞增殖，从而维持了卵巢卵泡的发育[16]。E2和Prog有助于排卵[17]，因此羟基蛋氨酸螯合物促进了MZ组、MM组和MZM组雪峰乌骨鸡产蛋率的升高，且MZM组产蛋率高于MZ组和MM组。此外，氨基酸微量元素螯合物因其稳定的螯合形式有利于机体吸收利用微量元素[18-19]，从而促进机体的生长发育，提高繁殖性能，有助于提高试验组雪峰乌骨鸡的生产性能。原因可能是羟基蛋氨酸螯合物通过促进雪峰乌骨鸡肠道对养分的吸收，提高了微量元素的消化率，进而提高生产性能。锰元素可调节性激素的分泌，并参与固醇类激素的合成，影响动物机体生殖器官的发育及其功能的发挥，最终影响动物的繁殖性能[20-21]。锌是碳酸酐酶的组成部分，在蛋壳形成过程中提供碳酸盐离子。饲料中缺锌会导致鸡蛋受精率和孵化率降低，胚胎死亡率升高[22-24]。王一冰等[25]研究发现，锰能够提高产蛋高峰期岭南黄羽肉种鸡的受精蛋的孵化率，且降低胚胎中后期的死亡率。本试验中，MZ组和MZM组乌骨鸡的死胚率显著低于对照组，表明添加羟基蛋氨酸锰有助于提高孵化率和健雏率，降低死胚率。原因可能是锰是细胞中催化RNA合成的RNA聚合酶活化因子，通过参与蛋白质合成而促进动物生长发育，且锰能够通过调节机体对铁和铜元素的吸收利用而参与血液形成[26]。本试验中，MZ组、MM组和MZM组雪峰乌骨鸡的健雏率显著高于对照组，这与张玲[23]的研究结果基本一致。健雏率与Mn和Zn元素的含量关联紧密，Mn和Zn元素有助于提高后代仔鸡的质量和存活率[27]。3.2羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡血清抗氧化能力的影响MDA可反映动物机体的过氧化状态，Mn和Zn是蛋鸡血液中GSH-Px、SOD和CAT的重要组成部分。GSH-Px、SOD和CAT可以清除机体产生的过量的活性氧，共同维持机体抗氧化系统的稳定[28]。本试验结果表明，添加羟基蛋氨酸螯合物可使乌骨鸡血清T-SOD、Mn-SOD、CAT和GSH-Px的活性显著提高。Qi等[29]研究表明，在57周龄海兰灰蛋鸡基础饲粮中添加40、80 mg/kg MHA-Zn可以提高血清及肝脏Cu/Zn-SOD的活性和T-AOC，降低MDA含量，日粮中添加80 mg/kg MHA-Zn可以使机体具有更好的抗氧化能力。Li等[30]研究发现，与80 mg/kg硫酸锌相比，在饲粮中添加60~80 mg/kg蛋氨酸锌提高了49周龄京红1号蛋鸡肝脏中抗氧化酶的活性。Zhang等[31]报道，饲粮中添加30%~50%有机复合微量元素替代100%无机微量元素，能够显著提高57周龄京红1号蛋鸡血清中T-AOC及CAT、SOD活性，降低MDA含量。本试验发现，添加羟基蛋氨酸螯合物可提高乌骨鸡血清中T-SOD和Mn-SOD活性，与上述研究结果相符。本试验中，MZM组乌骨鸡血清中CAT、Mn-SOD、T-SOD和GSH-Px活性高于对照组，且脂质过氧化物MDA的含量低于对照组，提示饲粮中添加羟基蛋氨酸螯合物能够提高蛋鸡机体的抗氧化能力。3.3羟基蛋氨酸螯合物对雪峰乌骨鸡血清免疫功能的影响在免疫调节系统中，免疫球蛋白和免疫细胞因子发挥着重要作用。免疫球蛋白具有抗体活性，其化学结构与球蛋白相似，主要包括IgA、IgM和IgG。IgG在抗感染的免疫应答中起到关键作用，是免疫应答中最重要的组成部分。IL-2是由激活的T细胞分泌产生的具有免疫增强作用的糖蛋白，是一种能够影响机体免疫反应的调节因子[32]。本试验中，与对照组相比，不同剂型的羟基蛋氨酸螯合物显著提高了雪峰乌骨鸡血清IgA、IgG、IgM和IL-2的含量。刘凤霞等[33]研究表明，在57周龄海兰灰蛋鸡饲粮中添加40 mg/kg羟基蛋氨酸锌可以显著提高蛋鸡H5亚型禽流感病毒抗体水平，且40 mg/kg羟基蛋氨酸锌组的IgG水平最高。许甲平等[34]研究发现，在57周龄海兰褐蛋鸡饲粮中添加不同剂量的蛋氨酸锌均能够显著提高蛋鸡的免疫功能，其中有机锌水平为70 mg/kg时，蛋鸡血清IgG水平最高，与本研究结果一致。本试验中，MZM组雪峰乌骨鸡血清的免疫功能优于其他组，可能是因为不同微量元素之间的相互影响以及在适宜的羟基蛋氨酸需要量下，MZM组的羟基蛋氨酸生物学利用率较高，在机体炎症反应中有助于提高免疫球蛋白和抗炎细胞因子含量，降低组织中促炎细胞因子的mRNA表达水平，在稳定免疫防御系统中发挥重要作用[35]。4结论本研究表明，饲粮中添加羟基蛋氨酸螯合物能够通过提高雪峰乌骨鸡种鸡的抗氧化性能、免疫能力、繁殖激素含量，改善雪峰乌骨鸡种鸡的生产性能。在本试验条件下，饲粮联合添加30 mg/kg MHA-Zn+25 mg/kg MHA-Mn，雪峰乌骨鸡种鸡的生产性能较好。