免疫系统在动物机体抵御外界疾病中起到至关重要的作用，它是参与免疫应答的主要系统，可以维持胸腺、淋巴结和淋巴细胞等免疫器官和细胞的正常生理功能。在家禽养殖中，蛋鸡和肉鸡面对各种病毒和细菌等不利因素，容易引起肝脏和小肠等器官氧化应激损伤加剧，最终导致免疫功能下降，轻者出现精神萎靡、食欲不振，致使生长缓慢，严重时甚至出现死亡[1]。因此，家禽的免疫功能会影响机体的健康状况，还会直接影响养殖户的经济效益。因此，寻找绿色有效提高免疫的方法是家禽养殖过程中的重点。芪芝口服液是拥有自主知识产权的国家三类新兽药，由黄芪和灵芝两味中药配伍而成。其中，黄芪具有补气升阳、提升正气、固表敛汗、利水消肿的作用；灵芝具有补益安神、止咳平喘的作用[2]。两药合用共同发挥补气、固表、安神之功效，尤其对于家禽的免疫力和抗病能力具有显著的促进效果[3]。网络药理学作为一门生物学科，可预测多成分复杂体系对机体多靶点的活性作用，现广泛应用于中药复方的药理学作用机制研究[4]。分子对接是利用计算机进行分子模拟的技术，通过研究药物分子和疾病蛋白受体之间的相互作用，预测其结合模式和亲和力的方法[5]。目前，中药网络药理学和分子对接在动物领域的研究比较少见，尤其对于家禽的相关报道少之又少。本研究利用网络药理学和分子对接方法，从生物学方面系统研究芪芝口服液有效成分提高免疫的作用机制，为芪芝口服液应用于临床提高家禽免疫功能提供参考。1材料与方法1.1芪芝口服液成分及免疫靶点收集在中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中检索芪芝口服液的两种中药成分“黄芪”和“灵芝”的化学成分，设置口服生物利用度（OB）≥30%、成药相似性（DL）≥0.18，筛选出活性成分比较高的有效成分。根据筛选的活性成分较高的编号在TCMSP数据库中Related Targets处逐个查找编号，从而得到中药的相关靶点蛋白。利用Uniport数据库（https://www.uniprot.org/），限定物种为禽类（Gallus gallus），将靶标对应的靶点蛋白校正为标准基因名称，得到芪芝口服液作用于禽的化学成分-作用靶标基因信息。在TTD（https://db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https://omim.org/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）疾病数据库中以“immunity”为关键词检索免疫靶点。使用在线韦恩软件Venn（http://www.ehbio.com/test/venn/#/）取得芪芝口服液-免疫的交集靶点，探索芪芝口服液可能作用于免疫方向的潜在靶点。1.2中药-成分-靶点-通路-疾病网络构建通过Cytoscape 3.9.1软件构建“芪芝口服液中药-成分-靶点-通路-免疫”网络，运用“Tools”中的Analyze Network进行网络拓扑分析，从而预测芪芝口服液提高免疫的关键成分。1.3交集靶点的PPI互作网络构建通过STRING数据库输入芪芝口服液与免疫的交集靶点，获得交集靶点的蛋白质互作关系。将物种设置为“Gallus gallus”，阈值设置为0.4，隐藏网络中的无关联点，获得相互作用靶点的数据表格，通过Cytoscape 3.9.1软件中CytoHubba插件的Degree算法进一步分析，根据Degree值筛选核心靶点。1.4GO和KEGG富集分析使用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对芪芝口服液-免疫的交集靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集分析，物种选择禽。GO功能分析获得生物学过程、细胞组分和生物功能，对靶点基因进行功能分析；KEGG通路富集分析获得芪芝口服液作用于免疫的信号作用通路。1.5分子对接验证将得到的关键成分与核心靶点进行分子对接，得到对接亲和力以评估分子间的结合稳固性，对接亲和力为负数说明有结合，对接亲和力越小，配体与受体的结合越牢固。在Uniport数据库中下载排名前3的核心蛋白靶点的立体结构，TCSMP数据库下载关键成分化合物的结构，使用Auto Dock Tools 1.5.7软件对蛋白结构进行去水加氢等操作，之后对处理的核心靶点蛋白和关键成分结构导入该软件中进行分子对接验证试验，得到化合物与受体的对接结合能值，数值为负数表明有结合，数值越小，配体与受体结合越牢固[6]；通过PyMOL Viewer软件对处理结果进行可视化。2结果与分析2.1芪芝口服液提高免疫的药效成分及免疫靶点预测芪芝口服液活性成分在TCSMP数据库中共收集到329种化合物，其中黄芪87种、灵芝242种。再以OB≥30%且DL≥0.18为筛选条件，对查询到的化学成分进行筛选，发现81种化合物活性成分符合要求。在Uniport数据库中通过校正，并筛选家禽基因后，可利用的成分为30个（部分结果见表1）及对应的成分基因靶点为66个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.014.T001表1芪芝口服液部分活性化合物编号化合物名称化合物来源口服生物利用度（OB）成药相似性（DL）MOL000211白桦脂酸黄芪（Hedysarum Multijugum Maxim）55.380.78MOL000354异鼠李素49.600.31MOL0003787-O-甲基-异微凸剑叶莎醇74.690.30MOL000392刺芒柄花素灵芝（Ganoderma）69.670.21MOL000417毛蕊异黄酮47.750.24MOL000422山柰酚41.880.24MOL000098槲皮素46.430.28MOL011129赤芝酸甲酯F32.670.81MOL011137星鱼甾醇43.510.72MOL011171灵芝醇B42.560.81MOL011256丹芝酸E32.850.82MOL011267灵芝醛B43.120.81MOL011270赤芝酸A30.340.79MOL011287赤芝酮A37.220.64MOL011309赤芝酸甲酯Q30.190.81MOL000282星鱼甾醇43.510.72MOL000358β-谷甾醇36.910.75通过OMIM、TTD和GeneCards数据库中以“immunity”（免疫）为关键词进行搜索，经过筛选合并后共得到329个疾病靶点。使用在线韦恩软件Venn输入66个芪芝口服液成分靶点和329个免疫靶点，获得芪芝口服液-免疫交集靶点17个（见表2）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.014.T002表2交集靶点基因靶点Uniport IDNOS2Nitric oxide synthase 2Q90703RELATranscription factor p65P98152CHRNA7Neuronal acetylcholine receptor protein， alpha-7 chainP22770TGFB1Transforming growth factor beta-1P09531EGFREpidermal growth factor receptorP13387CCND1G1/S-specific cyclin-D1P55169IL-10Interleukin-10Q6A2H4IL-6Interleukin-6Q90YI0TP53Cellular tumor antigen p53P10360NFKBIANF-kappa-B inhibitor alphaQ91974MYCMyc proto-oncogene proteinP01109CXCL8Interleukin-8P08317IFNGInterferon gammaP49708PARP1Poly ［ADP-ribose］ polymerase 1P26446CHUKInhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit alphaQ5ZJB4CD40LGCD40 ligandQ9I8D8IRF1Interferon regulatory factor 1Q90876通过Cytoscape 3.9.1软件构建芪芝口服液-成分-靶点-通路-免疫网络（见图1），根据拓扑参数Degree值筛选潜在的芪芝口服液提高免疫的相关成分。结果显示，槲皮素（quercetin，Degree=49）、山柰酚（kaempferol，Degree=18）、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇（7-O-methylisomucronulatol，Dgree=13）、异鼠李素（isorhamnetin，Degree=12）、刺芒柄花素（formononetin，Degree=12）和β-谷甾醇（beta-sitosterol，Degree=11）的度值最高，说明这些成分可能是提高家禽免疫的有效成分。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.014.F001图1芪芝口服液-成分-靶点-通路-免疫网络注：紫色为中药化合物，蓝色为中药独有靶点，红色为交集靶点，绿色为通路。2.2PPI网络互作分析将17个交集靶点输入STRING数据库，获得互相作用靶点的数据信息。通过Cytoscape 3.9.1软件对数据信息进行可视化，软件中CytoHubba插件的Degree算法筛选核心靶点（见图2）。拓扑参数Degree值可代表每个节点的重要性，节点颜色的深浅和大小与Degree值成正比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.014.F002图2交集靶点PPI互作网络图由图2可知，比较重要的靶点有核因子κB抑制蛋白α（NFKBIA，Degree=22）、白细胞介素-6（IL-6，Degree=22）、干扰素-γ（IFNG，Degree=16）、白细胞介素-10（IL-10，Degree=16）、MYC原癌基因蛋白（MYC，Degree=14），推测这些基因靶点可能是芪芝口服液作用于免疫的核心靶点。2.3GO富集分析对17个交集靶标基因输入David数据库进行GO富集分析，共得到38条结果（P0.05）。生物过程（biological process，BP）相关条目有33个，选择富集程度靠前的条目进行可视化，GO富集分析见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.014.F003图3GO富集分析由图3可知，其中FDR＜0.5的条目包括免疫应答（immune response）、巨噬细胞活化（macrophage activation）、细胞对脂多糖的应答（cellular response to lipopolysaccharide）、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）和胰岛素分泌的调节（regulation of insulin secretion）等；细胞组分主要富集于细胞外间隙（extracellular space）；分子功能主要富集于干扰素-γ-受体结合（interferon-gamma receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、蛋白质同源二聚活性（protein homodimerization activity）和生长因子活性（growth factor activity）。2.4KEGG富集分析对17个交集靶标基因输入David数据库进行KEGG富集分析共得到17个条目，筛选显著性注释信号通路，共发现相关通路15条（见图4），其中与免疫相关的具有代表性的通路包括C型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、FoxO信号通路（FoxO signaling pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、细胞因子受体相互作用信号通路（Cytokine-cytokine receptor interaction）、NOD样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）和丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPK signaling pathway）等信号通路。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.014.F004图4KEGG通路分析结果表明，芪芝口服液可能通过上述通路提高家禽的免疫力。2.5分子对接选取芪芝口服液-成分-靶点-通路-免疫网络中Degree值排名靠前的关键成分槲皮素、山柰酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、异鼠李素、刺芒柄花素和β-谷甾醇，与家禽免疫功能的核心靶点NFKBIA（Uniport ID: Q91974）、IL-6（Uniport ID：Q90YI0）和IFNG（Uniport ID：P49708）编码的蛋白分子进行对接（见表3）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.014.T003表3关键药效成分与家禽免疫功能核心靶点的结合能活性成分靶点NFKBIAIL-6IFNG槲皮素-6.11-6.08-5.38山柰酚-5.95-5.55-5.617-O-甲基-异微凸剑叶莎醇-5.72-6.11-5.31异鼠李素-5.89-6.03-5.71刺芒柄花素-6.68-5.80-5.83β-谷甾醇-7.85-8.01-8.41kJ/mol通过不同组合对接发现，所有组合的对接结合能均小于0，说明化合物配体和靶点蛋白受体可自由结合，具有较好的结合活性，部分结果展示见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.014.F005图5槲皮素与关键靶点分子对接3D图3讨论芪芝口服液具有诱导机体产生抗体，消除免疫抑制，提高家禽免疫力和抗病能力的功能。在临床中，芪芝口服液主治雏鸡活力弱、疫苗免疫预防效果不佳导致的抗体滴度参差不齐和免疫应激造成的呼吸道疾病等[3]。目前，关于芪芝口服液中的2味药材黄芪和灵芝对家禽免疫方面的相关作用还未见报道，故本研究采用网络药理学和分子对接技术研究芪芝口服液2味中药的关键有效成分对家禽免疫的作用机制，同时构建“芪芝口服液-成分-靶点-通路-免疫”和蛋白互作网络，分析了中药-化合物-靶点-通路-疾病之间多成分、多靶点、多通路调控的关系，揭示了芪芝口服液对家禽免疫的作用机制和相关信号表达通路。3.1芪芝口服液作用于家禽免疫的核心成分分析本研究发现，芪芝口服液中主要是通过黄芪的槲皮素、山柰酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇等化合物发挥作用；灵芝主要是通过β-谷甾醇发挥作用。其中槲皮素具有多种药理作用，可通过靶向细胞内信号激酶和磷酸酶以及白细胞，对人类和动物机体中的炎症和免疫产生影响[7]；山柰酚不仅可以通过多种抗氧化和抗凋亡机制降低肝脏微环境中的免疫炎症反应，阻止细胞凋亡[8]，还可以抑制应激反应，防止炎症发生[9]；异鼠李素主要具有免疫调节、心脑血管保护和抗炎等多种药理作用[10-12]；刺芒柄花素可抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡和血管生成[13]；7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇作为黄芪的主要成分，协同其他成分共同对癌细胞的增殖起到抑制作用[14]。灵芝中的β-谷甾醇是一种植物甾醇，主要通过调节肠道有益菌群改善动脉硬化，还可以缓解胆固醇代谢和炎症反应，提高抗氧化能力[15]；此外，β-谷甾醇还具有调节免疫力、促进动物生长和提升畜产品品质等功能[16]。综上所述，芪芝口服液主要通过多成分共同作用于免疫功能以及抗炎作用等。3.2芪芝口服液作用于家禽免疫的关键靶点分析本研究结果显示，芪芝口服液的关键靶点有IL-6、IL-10、NFKBIA、IFNG和MYC。IL-6是一个多功能的细胞因子，多项研究发现该因子参与了炎症和免疫过程以及造血、肝脏和神经元的再生[17-18]。据报道，IL-6通过促进细胞增殖、血管生成和代谢，下调细胞凋亡和氧化应激，从而起到保肝的重要作用[19]；IL-6也是适应性免疫的重要调节剂，其作用机制主要是使T细胞分化，从而调控自身免疫，对炎症、肝脏再生和防御感染产生重要影响[20]；它还可以增强抗病毒适应性免疫反应，减轻慢性感染期间T细胞的耗竭[21]。IL-10是一个具有抗炎特性的多功能细胞因子，主要由抗原呈递细胞分泌，通过激活巨噬细胞抑制炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α、IL-6和白细胞介素-1的表达[22]。NFKBIA编码的蛋白质与转录因子蛋白（REL）的二聚体相互作用，抑制NF-kappa-B/REL复合物的生成，而该复合物通过激酶调节参与炎症和免疫活动、细胞附着、分化、生长、血管生成和细胞凋亡的调节[23-24]。IFNG作为一种多效性细胞因子，从慢性炎症的细胞转化过程，再到抗病毒、抗肿瘤作用，在免疫应答过程中均可对宿主细胞产生重要的调节作用[25]。除了作为关键的致癌蛋白外，MYC还作为转录免疫因子促进免疫众多靶基因的表达，调控B淋巴细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞的发育、分化和激活等过程，在免疫功能方面起到重要的调节作用[26]。3.3芪芝口服液对家禽免疫作用相关基因的GO富集、KEGG通路及分子对接分析本研究中，GO富集分析表明芪芝口服液的活性成分主要富集在细胞外间隙部位，通过发挥干扰素-γ-受体结合活性、细胞因子活性、蛋白质同源二聚活性和生长因子活性多种生物活性，在免疫应答反应、巨噬细胞活化和胰岛素分泌的调节等不同的生物过程中发挥作用，从而对家禽的免疫功能起到调控作用。KEGG通路富集分析结果表明，芪芝口服液作用于家禽免疫相关性较大的信号通路有C型凝集素受体信号通路、FoxO信号通路、Toll样受体信号通路等。C型凝集素受体（CLR）是一个跨膜蛋白家族，主要涉及病原体的识别、吞噬作用、炎症信号传导和抗原处理等，其主要机制是通过识别微生物细胞壁，激活吞噬细胞中的炎症和抗菌反应影响先天免疫[27]。FoxO家族在免疫系统中具有强大的功能，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）的发育、分化与存活[28-30]。据报道，FOXO1和FOXO3作为FoxO家族的成员，对NK细胞的发育呈现正反馈，当两者缺失时将会扰乱NK细胞程序的建立，从而导致NK细胞发育和成熟停滞，对免疫功能产生重大影响[31]。Toll样受体（TLRs）和NOD样受体（NLR）可识别不同病原体的相关分子结构，在炎症、免疫细胞调控、存活和增殖等方面发挥关键作用，并在先天性免疫应答中扮演着不可或缺的角色[32-33]。TLR信号传导通过促进树突状细胞（DC）的成熟和激活适应性免疫细胞以清除入侵病原体，间接调节T细胞的活化、生长、分化、发育和功能，对于诱导抗原特异性适应性免疫应答至关重要[34]。NLR通过识别病原体相关分子模式和损伤相关分子模式，调节细胞凋亡和早期发育，因此它与感染和免疫相关的各种疾病之间存在显著关联，在先天免疫反应中起到至关重要的作用[33]。研究表明，家禽应激通过细胞因子受体相互作用和Toll样受体信号传导信号通路诱导氧化应激，降低家禽采食量和生长，并损害免疫反应和功能，导致高易感性[35]。MAPK信号通路在真核生物信号传递网络中起到至关重要的作用，是细胞增殖、分化、细胞凋亡以及正常条件和病理条件下应激反应的关键信号通路[36]。P38级联反应作为经典的MAPK信号通路之一，主要与炎症反应相关，该通路作用机制主要是P38 MAPK激酶由ERK3/6磷酸化激活，进一步通过诱导转录因子及激酶促进细胞凋亡，抑制细胞增殖[37]。综上所述，芪芝口服液通过多通路、多靶点对家禽免疫发挥作用。本研究分子对接结果显示，芪芝口服液关键化合物成分与家禽免疫的核心靶点结合能均为负值，而结合能是分子结合时释放的能量，释放的能量越多说明分子间吸引力越大，越容易自发结合，所以分子体系越稳定[38]。4结论芪芝口服液通过多成分、多靶点、多通路共同作用家禽的免疫系统。芪芝口服液可能通过关键成分槲皮素、山柰酚、7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇、异鼠李素、刺芒柄花素和β-谷甾醇等化合物作用于IL-6、IL-10、NFKBIA、IFNG和MYC等关键靶点，通过C型凝集素受体信号通路、FoxO信号通路、Toll样受体信号通路、细胞因子受体相互作用信号通路、NOD样受体信号通路和MAPK信号通路等对家禽的免疫功能进行调控。利用分子对接方法初步验证了芪芝口服液化合物与免疫增长的潜在靶点相互作用的基础，为芪芝口服液提高免疫提供了临床依据，后续还需进一步通过动物试验进行验证。