黄芩茎叶为唇形科植物黄芩的地上部分，含有丰富的类黄酮化合物，具有较强的抗氧化、抗炎、镇痛、抗病毒及提高机体免疫力等药理学活性功效[1]。黄芩茎叶的高效合理利用已成为制药产业的研究重点[2]。发酵是指在特定的环境下利用微生物或细胞等生物体的新陈代谢，将有机物通过生物转化的途径分解或合成和转化[3]。于潇洁等[4]发现，红茶菌发酵黄芩具有抗菌作用，且对果蝇及小鼠的细菌性肠道炎症具有改善作用。胡会玲等[5]发现，黄芩茎叶经鸡源产β-葡萄糖苷酶菌群发酵后能够提高黄羽肉鸡表观消化率，增强机体的免疫功能。安琦等[6]发现，经植物乳杆菌发酵的黄芩药渣能够有效提高仔猪增重，降低仔猪腹泻率，有助于提高仔猪免疫力，调节仔猪肠道微生物菌群。目前尚未见非药用部位的黄芩茎叶抑菌效果及炎症作用的相关报道。因此，本试验采用本地酒曲发酵黄芩茎叶，探究其对痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的体外抑菌效果及对小鼠全身炎症的作用，以期为非药用部位的黄芩茎叶在畜禽养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1药材来源黄芩茎叶（云南楚雄姚安县）由云南农业大学动物医学院中兽医实验室鉴定为甘肃黄芩。1.1.2试验菌种酒曲JC购自昆明晋宁，痢疾志贺氏菌（BNCC103609）、金黄色葡萄球菌（BNCC336455）、大肠杆菌（BNCC441027）、沙门氏菌（BNCC337204）购自北纳创联生物技术有限公司。1.1.3试验动物供试动物为昆明医科大学的5周龄SPF级昆明鼠50只，合格许可证号：SCXK（滇）K2015-0002，体重（20±5）g，随机分成5组（对照组、造模组、阳性药物组、原药组和发酵药物组），每组10只。1.1.4试剂及仪器主要试剂：LB肉汤培养基（北京陆桥技术股份有限公司）、LB琼脂培养基（北京陆桥技术股份有限公司）、酵母膏（北京奥博星生物技术有限公司）、MRS培养基（北京索莱宝科技有限公司）、脂多糖（北京索莱宝科技有限公司）、地塞米松（上海源叶生物科技有限公司）；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（上海酶联生物有限公司）。主要仪器：DHG-9240A烘干箱（上海一恒科学仪器有限公司）、5427R离心机（德国艾本德股份公司）、超纯水仪器（RephiLe Bioscience LtdTM-D）、DW-HL528S冰箱（合肥美菱股份有限公司）、SK-1涡旋振荡器（常州市华普达仪器有限公司）、Xiande-3000旋转蒸发仪（上海贤德实验仪器有限公司）、SCIENTZ-18N冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、SPX-150恒温生化培养箱（浙江托普云农科技股份有限公司）、全波长酶标仪（Thermo Fisher1530-800673）、CHA-S恒温摇床（常州智博瑞科技有限公司）、超净工作台（北京六一生物科技有限公司）。1.2黄酮原药（SBSL）与发酵黄酮（FSBSL）的制备1.2.1SBSL制备于7—8月采集地上黄芩包括花及部分籽实在内的部分60 ℃烘干，粉碎过40目筛，密封常温保存，粉末经70%乙醇在料液比为1∶10 g/mL下，超声提取1 h。1.2.2FSBSL制备黄芩茎叶粉碎过筛（40目），精密称取2 g，经高压冷却后加入酒曲JC，34 ℃，料液比为1∶5 g/mL，接菌量为6 mL（即20%），碳源及氮源添加量均为2%，发酵5 d。1.3SBSL与FSBSL的体外抑菌效果评价1.3.1MIC和MBC测定取96孔板，设计A~F排为试验孔，G排为阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液），H排位阳性对照（加菌液不加药液）。每个孔加入LB肉汤培养基100 μL。1~12列逐个2倍稀释，每种药设3个平行复孔，取平均值。每孔中加入稀释好菌液100 μL（阴性对照除外），将96孔板放入37 ℃恒温培养箱16~20 h，每孔加入40 μL浓度为0.2 g/L INT显色试剂混匀。孵育15 min，溶液显紫红色表明有细菌生长，未显紫红色表明没有细菌生长。未显紫红色的最小药物浓度即为药物对细菌的MIC值[7]。将大于MIC的培养物分别取0.05 mL加到琼脂培养基上，菌液涂布涂匀至干燥，37 ℃倒置培养12~18 h后观察有无菌落生长。无菌落生长的最低药液浓度为最低杀菌浓度，即MBC值。1.3.2抑菌圈测定采用牛津杯法[8]测定抑菌圈。取第2代菌株加入无菌生理盐水以10倍梯度稀释，取稀释106浓度菌液150 μL于MH固体琼脂平板涂板至干燥，将4个无菌牛津杯均匀放入培养皿，分别打入2种供试药液100 μL，以无菌水为阴性对照、氨苄青霉素为阳性对照，每组3个重复，37 ℃培养12 h后观察结果并测定抑菌圈直径。抑菌圈敏感度判定[9]：抑菌圈直径d≤6 mm为不敏，6 mm≤d≤10 mm为低敏，10 mm≤d≤15 mm为中敏，15 mm≤d≤20 mm为高敏，d≥20 mm高敏。1.4SBSL及FSBSL对小鼠全身炎症作用1.4.1给药量确定将60%乙醇黄芩茎叶提取物溶于蒸馏水，配制成500 mg/mL的药液，选用2倍（1 mg/kg）、4倍（2 mg/kg）、8倍（4 mg/kg）、16倍（8 mg/kg）、32倍（16 mg/kg）的剂量灌喂小鼠，连续给药7 d后计算死亡率[10]。1.4.2试验设计50只SPF级昆明小鼠随机分为5组，每组10只，除对照组（Con组）外，各试验组小鼠均腹腔注射脂多糖（LPS，4 mg/kg），Con组灌胃相同剂量的生理盐水，造模组（LPS组）、阳性药物组（LPS+DM组）、原药组（LPS+SBSL组）和发酵药物组（LPS+FSBSL组）先注射LPS侵染24 h，后持续给药6 d；除Con组外，第3、5 d再次对小鼠腹腔注射LPS。试验期7 d。试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.T001表1试验设计组别小鼠数量/只造模药物治疗药物Con组10生理盐水生理盐水LPS组10LPS生理盐水LPS+DM组10LPS0.5 mg/kg地塞米松LPS+SBSL组10LPS8 mg/kg SBSLLPS+FSBSL组10LPS8 mg/kg FSBSL1.4.3测定指标及方法（1）临床症状观察及死亡率。试验期间观察小鼠临床症状并计算死亡率。（2）脏器质量。停止给药24 h后剖杀。剖杀前，小鼠禁食12 h，保定后摘取眼球采血，3 000 r/min离心15 min，取上清-80 ℃保存。采血后处死小鼠，分别取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏及肾脏，称重，分装在冻存管中-80 ℃保存。（3）血清和肺脏中IL-6、IL-1β及TNF-α含量。称取肺脏组织，加入适量PBS，冰浴研磨，离心取上清后按照ELISA试剂盒说明书操作。（4）切片制作。将甲醛溶液浸泡固定后修整好的组织用酒精进行脱水，二甲苯透明，将其进行浸蜡，包埋，待蜡块冷却凝固后把蜡修整好。使用石蜡组织切片机将组织进行切片，将切好的组织放入恒温水箱中进行展片。用防脱载玻片将切片捞出放入切片架内，放入恒温烤箱58 ℃烤制8 h。待切片冷却后进行HE染色，取出切片室温下晾干后用中性树胶联系封片。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2019软件进行整理统计，Graphpad Prism 8.0.1软件进行单因素方差分析。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1SBSL和FSBSL的体外抗菌效果（见表2~表6）由表2~表5可知，SBSL的MIC、MBC值最低的是金黄色葡萄球菌和痢疾志贺菌，FSBSL的MIC、MBC值最低的是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。FSBSL对痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌均具有较好的抑菌效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.T002表2SBSL对供试细菌MIC的影响项目SBSL浓度/(g/L)100.0050.0025.0012.506.253.131.560.78大肠杆菌------++痢疾志贺氏菌------++沙门氏菌------++金黄色葡萄球菌--------注：“-”表示阴性，“+”表示阳性；表3~表5与此同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.T003表3FSBSL对供试细菌MIC的影响项目FSBSL浓度/(g/L)50.0025.0012.506.253.131.560.780.39大肠杆菌--------痢疾志贺氏菌-------+沙门氏菌-------+金黄色葡萄球菌------++10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.T004表4SBSL对供试细菌MBC的影响项目SBSL浓度/(g/L)100.0050.0025.0012.506.253.131.560.78大肠杆菌------++痢疾志贺氏菌-------+沙门氏菌------++金黄色葡萄球菌------++10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.T005表5FSBSL对供试细菌MBC的影响项目FSBSL浓度/(g/L)100.0050.0025.0012.506.253.131.560.78大肠杆菌--++++++痢疾志贺氏菌-----+++沙门氏菌--++++++金黄色葡萄球菌-----+++由表6可知，在同一浓度（250 g/L）下，大肠杆菌、痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌对FSBSL和SBSL均为中敏，对沙门氏菌为低敏。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.T006表6体外抑菌效果组别大肠杆菌痢疾志贺氏菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌抑菌圈直径/mm判定结果抑菌圈直径/mm判定结果抑菌圈直径/mm判定结果抑菌圈直径/mm判定结果FSBSL15.333±3.897中敏13.513±1.063中敏7.230±0.295低敏14.343±0.331中敏SBSL15.340±2.727中敏13.143±1.220中敏6.990±0.336低敏13.063±1.049中敏阳性对照17.810±0.711高敏21.073±0.501高敏17.427±0.470高敏19.020±1.047高敏2.2SBSL和FSBSL对小鼠全身炎症的影响2.2.1给药量确定试验结果经500 mg/mL的FSBSL以不同倍比连续灌胃6 d后，发现灌喂2倍（1 mg/kg）、4倍（2 mg/kg）、8倍（4 mg/kg）、16倍（8 mg/kg）的FSBSL均对小鼠无影响，所以选定16倍（8 mg/kg）为最终给药量进行后续试验。2.2.2临床观察小鼠造模注射LPS后，LPS组、LPS+DM组和LPS+SBSL组小鼠均出现畏冷、扎堆、停止进食、运动痉挛且对外界刺激不敏感及眼屎等症状，持续腹泻2~6 h后各组出现不同程度的死亡。LPS+FSBSL组小鼠对外界刺激较敏感，除第一次给LPS时小鼠出现了不同程度的腹泻外，第3、5 d分别腹腔注射LPS后小鼠不再出现腹泻症状，但逐渐恢复健康。LPS组小鼠临床症状见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.F001图1LPS组小鼠临床症状停药24 h后剖杀小鼠，LPS组、LPS+FSBSL组肺脏及各处理组脾脏见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.F002图2LPS、LPS+FSBSL组肺脏及各处理组脾脏对比由图2可知，LPS组小鼠肺脏出现了明显的淤血，而LPS+FSBSL组的肺脏则明显可见淤血不明显。LPS会在临床上造成机体肺淤血，表明试验造模成功。此外，各组的脾脏大小存在明显差异。2.2.3SBSL和FSBSL对小鼠死亡率的影响造模后，前12 h死亡率为0，给药后24 h时LPS组、LPS+DM组和LPS+SBSL组均有小鼠死亡，小鼠死亡率见表7。由表7可知，各组死亡率分别为0、30%、20%和0，表明FSBSL在8 mg/kg的给药量下为安全剂量，对小鼠的死亡率具有明显的抑制效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.T007表7SBSL和FSBSL对小鼠死亡率的影响项目Con组LPS组LPS+DM组LPS+SBSL组LPS+FSBSL组结果03020100%2.2.4SBSL和FSBSL对小鼠脏器质量的影响（见图3）由图3可知，LPS+SBSL组小鼠肝脏质量极显著高于LPS+FSBSL组（P0.01），脾脏LPS组脾脏质量极显著高于Con组（P0.01）。各组小鼠心脏、肺脏及肾脏质量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.F003图3SBSL和FSBSL对小鼠脏器质量的影响注：“*”表示Con组与其他组对比差异显著（P0.05），“**”表示Con组与其他组对比差异极显著（P0.01）；“#”表示其他组间对比差异显著（P0.05），“##”表示其他组间对比差异极显著（P0.01）；“ns”表示差异不显著（P0.05）；图5、图6与此同。2.2.5SBSL和FSBSL对小鼠组织病理形态的影响（见图4）由图4可知，将小鼠处死后采集小鼠肝、脾、肾制作病理切片后进行病理组织学观察。LPS组脾组织有淋巴结和巨噬细胞的病变，有浸润发生，肾组织肾小管有上皮细胞扩张的病变，近曲小管和远曲小管正常；与模型组相比，LPS+DM组脾组织、肾组织病变减轻；与LPS组相比，LPS+FSBSL组脾组织和肾组织受损程度更小。结果表明，注射LPS对小鼠脾、肾组织会造成损害，FSBSL对小鼠脾和肾组织具有治疗修复的作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.F004图4各组小鼠组织病理形态学检查结果（HE400×）2.2.6SBSL和FSBSL对小鼠炎症因子含量的影响（1）SBSL和FSBSL对小鼠血清炎症因子含量的影响（见图5）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.F005图5SBSL和FSBSL对小鼠血液炎症因子含量的影响由图5可知，与LPS组比，LPS＋DM组和LPS+SBSL组小鼠血清IL-6含量极显著升高（P0.01）；与LPS+DM组比，LPS+SBSL组和LPS+FSBSL组小鼠血清IL-6含量极显著升高（P0.01）。各组小鼠血清IL-1β含量差异均不显著（P0.05）。与Con组比，LPS组小鼠血清TNF-α含量显著升高（P0.05）。（2）SBSL和FSBSL对小鼠肺脏中炎症因子含量的影响（见图6）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.012.F006图6SBSL和FSBSL对小鼠肺脏中炎症因子含量的影响由图6可知，与LPS组相比，LPS+FSBSL组小鼠肺脏组织中IL-6含量显著升高（P0.05）。与LPS+SBSL组相比，LPS+FSBSL组小鼠肺脏组织中IL-1β含量显著升高（P0.05）。3讨论3.1黄芩茎叶发酵黄酮抑菌作用分析大肠杆菌是条件致病菌，在一定条件下可引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染[11]。金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，广泛存在于自然环境中。金黄色葡萄球菌在适当的条件下能够产生肠毒素，引起食物中毒[12]。痢疾杆菌感染后则会出现发热、腹痛、腹泻及呕吐等典型症状[13]。本研究发现，FSBSL对大肠杆菌、痢疾志贺氏菌以及金黄色葡萄球菌均具有较好的抑菌效果，与刁红梅等[14]、张琳[15]的研究结果相似。黄水金等[16]研究发现，5个不同产地的黄芩提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑菌均具有显著的抑菌效果。韩红艳等[17]研究发现，黄芩对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑制效果。唐梅[18]研究发现，黄芩提取液对大肠杆菌、志贺氏痢疾杆菌及金黄色葡萄球菌均具有一定的抑制作用。3.2黄芩茎叶发酵黄酮抗炎作用分析炎症介质和炎症细胞因子可激活核转录因子，释放更多的细胞因子，增加炎症反应[19]。炎症反应失控会导致组织损伤，并与急性和炎症细胞因子、慢性炎症疼痛的发生密切相关[20]。IL-6是一种多功能细胞因子，在免疫系统中均具有重要作用，可以通过促进急性蛋白的合成而具有促炎性活性[21]。TNF-α在参与炎性反应和机体免疫应答中作为介质，是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的细胞因子，可以抑制病毒的复制，保护宿主细胞免受严重损伤[22]。IL-1β是启动抗菌炎性反应的关键细胞因子之一[23]。研究发现，黄芩茎叶与鸡肉衍生的β-葡萄糖醛酸的发酵可提高肉鸡的消化率和免疫功能[5]。有试验采用乳酸菌发酵黄芪并探究其在断奶仔猪中的应用，结果发现，添加0.6%黄芪可显著提升仔猪血清中免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）含量[24]。陈敏等[25]用热板法研究了灌胃和腹腔注射黄芩水煎剂对小鼠的影响，结果发现，发酵黄芩茎叶能够降低LPS感染小鼠的死亡率。本试验发现，FSBSL可显著降低血清中细胞因子TNF-α的含量。朱克春等[26]研究发现，蒺藜总皂苷能够抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、白细胞介素-2（IL-2）和一氧化氮（NO），与本研究结果相似。4结论本研究结果表明，FSBSL对大肠杆菌、痢疾志贺氏菌和金黄色葡萄球菌均具有较好的抑菌效果。8 mg/kg为FSBSL的安全剂量，对LPS感染后小鼠的死亡率具有明显的抑制效果。同时，FSBSL对LPS感染后小鼠血液和肺脏中炎症因子IL-6、IL-1β及TNF-α的释放均具有调节作用。