抗生素可以预防和治疗诸多细菌感染性疾病[1-2]。但由于抗生素自身作用机制，应用于临床的药物具有一定的副作用，使抗生素在临床应用上受到了限制[3-4]。因此，寻找新型绿色、安全、高效且能够防止胃蛋白酶水解的抗生素替代品成为畜牧生产中研究的重点。海绵胶煤炱菌（Scorias spongiosa）又称竹燕窝真菌，在蚜虫分泌的蜜露上生长，属于一种食用真菌，呈浅黄色或黑色的胶体珊瑚[5-7]。目前，海绵胶煤炱菌还没有大规模人工栽培，市场上开发的海绵胶煤炱菌产品均是野生资源[8-10]。海绵胶煤炱菌作为一种食用真菌，其中的活性物质含量较多。使用HPLC鉴定发现，海绵胶煤炱菌中含有一定的麦角甾醇，麦角甾醇与维生素D的结构相似，具有抑菌、消炎等作用[11-12]。粪肠球菌为短杆状或球形，是一种革兰氏阳性嗜厌氧细菌，生长条件较为苛刻。金黄色葡萄球菌的抵抗力较强、致病力较强、易产生耐药性、耐高盐。表皮葡萄球菌属于非致病性葡萄球菌，在普通培养基上生长良好，具有耐盐性。鼠伤寒沙门菌是一种重要的人畜共患病原菌，病死率较高。鸡沙门氏菌是引起家禽败血症的一种革兰氏阴性杆菌，具有活跃的运动能力。大肠杆菌是一种兼性厌氧细菌，生存较强，在普通固体培养下，菌落呈圆形。但目前有关竹燕窝提取物对上述菌种的抑菌作用的研究较少，因此研究竹燕窝乙醇提取物抑菌功能具有重要意义。本试验以竹燕窝为主要研究对象，使用乙醇对竹燕窝进行提取，并测定竹燕窝乙醇提取物的抑菌活性，考察pH值、温度处理对提取物抑菌活性的影响，旨在明确竹燕窝在抑菌领域的潜在应用价值，为抑菌产品的开发及其在动物养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂试验材料：竹燕窝样品购自川乐竹燕窝产品开发有限公司。试剂：75%乙醇（分析纯）、85%乙醇（分析纯）、95%乙醇（分析纯）、氯化氢（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、牛肉膏（分析纯）、蛋白胨（分析纯）、氯化钠（分析纯）、无菌滤膜、生理盐水及麦氏比浊管等均购自索莱宝生物科技有限公司。1.2菌株供试菌株：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）ATCC29212、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC29213、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC12228、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC7731、鸡沙门氏菌（Salmonella pullorum）ATCC7913、大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922均购自碧云天生物技术有限公司。1.3培养基营养肉汤（NB）液体培养基（1 L）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g，调节pH值至7.4±0.2。营养肉汤固体培养基配方（1 L）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂15 g，调节pH值至7.4±0.2。两个培养基分别置于100 mL的三角瓶中，每瓶装50 mL，121 ℃灭菌。1.4主要仪器SPX-250BⅢ生化培养箱购自天津市泰斯特仪器有限公司，HWS-26电热恒温水浴锅购自上海慧泰仪器制造有限公司，GY2019-SW恒温摇床购自郑州生元仪器有限公司，DHG-2150B烘箱购自郑州生元仪器有限公司，SW-CJ-1FD洁净工作台购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，GI100DS高压蒸汽灭菌锅购自致微（厦门）仪器有限公司，N-1300D-WB旋转蒸发仪购自上海爱郎仪器有限公司，Sorvall ST 16R高速冷冻离心机购自热电实验设备有限公司奥斯特罗德分公司，FSJ-A03E1小型高速粉碎机购自小熊电器股份有限公司，JTNJB牛津杯购自北京吉泰远成科技有限公司，36-150-23C游标卡尺购自平阳耕邦传动机械有限公司，9908便携式pH计购自长沙米淇仪器设备有限公司。1.5试验方法1.5.1竹燕窝乙醇提取物的获取取竹燕窝样品，置于烘箱内烘干24 h，粉碎，准确称取竹燕窝粉末20 g，按液料比为5 mL/g，使用100 mL 95%乙醇在水浴锅中50 ℃条件下浸泡2 h，5 000 r/min离心15 min，取上清液抽滤，合并滤液，采用旋转蒸发仪减压回收溶剂，得到竹燕窝的乙醇提取物。1.5.2抑菌试验（牛津杯法）将已经灭菌过的营养肉汤（NB）固体培养基在超净平台上加热至充分溶解，倒入灭菌的培养皿中，每个容器20 mL左右，使其冷却和固化。将每个试验菌种的单个菌落挑取到装有适量灭菌后的生理盐水的试管中，使用0.5麦氏比浊管作参照将其调整到同样的浑浊程度。将每一种试验菌液分别抽取1 mL于固化后的营养肉汤固态培养基中，然后采用涂布器将其均匀的涂覆在培养基表面，并分别做好记号。采用无菌法将牛津杯竖向放置于培养液的表面，轻轻按压，让牛津杯与培养液充分接触[4,11]，将竹燕窝乙醇提取物倒入杯中，置于37 ℃恒温培养箱中18 h；营养肉汤固体培养基中的竹燕窝乙醇提取物含量随着远离牛津杯而下降，并且细菌增殖受到了抑制，形成了一个清晰的抑菌圈[4,11]。采用十字交叉法的测量方式，用游标卡尺对抑菌圈的直径进行测量，每组试验进行3次。1.5.3正交试验优化竹燕窝乙醇提取物的工艺参考文献[12]确定各因素水平，为了找到竹燕窝乙醇提取物抑菌效果的最优组合，试验直接以大肠杆菌作为指示菌，使用乙醇作为提取溶剂，设计四因素三水平的正交试验。正交试验因素和水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.015.T001表1正交试验因素水平设计水平A乙醇浓度/%B液料比/（mL/g）C提取时间/minD提取温度/℃17556040285101205039515180601.5.4最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定根据正交试验中的最佳提取条件进行提取，在55 ℃下真空干燥至恒重。准确称取干燥后的竹燕窝提取物10 g，置于100 mL棕色的容量瓶中，使用纯化水溶解，采用0.22 μm无菌滤膜除菌并稀释至刻度，取适量至营养肉汤液体培养基试管中，以二倍递减稀释法将营养肉汤中的竹燕窝提取物的浓度依次稀释至100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39 g/L。分别将指示菌［革兰氏阳性菌（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）；革兰氏阴性菌（鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和大肠杆菌）］悬液接入含有各浓度竹燕窝提取物的营养肉汤液体培养基中，每根试管10 μL，无菌纯化水作为空白对照。每根试管分别置于37 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养24 h，以没有细菌生长的最小浓度作为竹燕窝乙醇提取物的MIC，每组试验进行3次[12]。在MIC的基础上，在37 ℃、200 r/min的恒温摇床中，将上述各试管继续培养12 h，以没有细菌生长的最小浓度作为竹燕窝乙醇提取物的MBC，每组试验进行3次[12]。1.5.5竹燕窝提取物抑菌稳定性测定方法根据正交试验中的最优提取工艺条件对竹燕窝进行提取。竹燕窝提取物的pH值稳定性以3种革兰氏阳性菌和3种革兰氏阴性菌作为指示菌，竹燕窝提取物的热稳定性则以革兰氏阴性菌中的大肠杆菌作为指示菌[12]，分别用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH调节pH值至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，按照MIC的测定方法与步骤分别进行抑菌试验，通过测定MIC研究不同pH值对竹燕窝提取物抑菌作用的影响。将竹燕窝提取物分别置于60、70、80、90、100 ℃水浴锅中水浴30 min，以恒温37 ℃为对照，通过测定MIC研究不同温度对竹燕窝提取物抑菌作用的影响。2结果与分析2.1正交试验极差分析及方差分析结果（见表2、表3）由表2、表3可知，以大肠杆菌作为指示菌时，根据R值判断乙醇浓度、液料比、提取时间及提取温度对竹燕窝提取物的抑菌效果的影响排序为乙醇浓度（A）＞液料比（B）＞提取温度（D）＞提取时间（C），竹燕窝乙醇提取物抑菌效果最优的组合为A2B1C3D2；即在乙醇浓度85%、液料比5 mL/g、提取时间180 min、提取温度50 ℃的条件下提取的竹燕窝乙醇提取物的抑菌效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.015.T002表2正交试验极差分析结果项目ABCD抑菌圈直径/mm1111115.012122214.863133314.094212318.025223117.166231217.127313216.048321315.119332113.58k114.6516.3615.7415.25k217.4315.7115.4916.01k314.9114.9315.7615.74R2.931.430.270.76最优水平A2B1C3D210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.015.T003表3正交试验方差分析结果项目Ⅲ类平方和自由度均方F值P值校正模型716.5256119.42146.6030.001截距115 641.2241115 641.22445 128.1950.001A451.5253150.50858.7350.001B226.525375.50829.4670.001C142.525347.50818.5400.062D101.525333.84213.2070.004误差41.000162.563总计112 412.00024校正总计734.52522注：1.R2=0.746（调整后R2=0.705）。2.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.2竹燕窝提取物MIC和MBC的测定结果（见表4、表5）由表4可知，竹燕窝提取物对革兰氏阳性菌的MIC远小于革兰氏阴性菌。竹燕窝提取物对革兰氏阳性菌（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）的MIC均为12.5 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.015.T004表4竹燕窝提取物MIC测定结果项目革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌粪肠球菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌鼠伤寒沙门氏菌鸡沙门氏菌大肠杆菌MIC12.512.512.550.050.025.0g/L竹燕窝提取物对革兰氏阴性菌中鼠伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌的MIC均为50 g/L，对大肠杆菌的MIC为25 g/L。由表5可知，竹燕窝提取物对革兰氏阳性菌中金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MBC均为25 g/L，对粪肠球菌的MBC为50 g/L。竹燕窝提取物对革兰氏阴性菌中鼠伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌的MBC均为50 g/L，对大肠杆菌的MBC为100 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.015.T005表5竹燕窝提取物MBC测定结果项目革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌粪肠球菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌鼠伤寒沙门氏菌鸡沙门氏菌大肠杆菌MBC5025255050100g/L2.3竹燕窝提取物抑菌稳定性测定结果2.3.1竹燕窝提取物的pH值稳定性测定结果（见表6、图1）由表6可知，竹燕窝提取物对粪肠球菌的MIC呈现随着pH值增加而增加的趋势。当pH值为2时，竹燕窝提取物对粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌效果均较好。在酸性条件下，竹燕窝提取物对金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌和大肠杆菌的MIC呈现先增后减的趋势。在碱性条件下，竹燕窝提取物对金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌和大肠杆菌的MIC呈现持续增长的趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.015.T006表6在不同pH值下竹燕窝提取物对细菌的最小抑菌浓度pH值革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌粪肠球菌金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌鼠伤寒沙门氏菌鸡沙门氏菌大肠杆菌212.512.512.550.050.025.0425.025.012.550.075.050.0625.012.525.075.050.025.0850.025.050.0100.075.050.01050.050.050.0125.0100.0100.01250.050.050.0125.0125.0125.0g/L由图1可知，当pH值为2和4时，竹燕窝提取物对表皮葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.015.F001图1不同pH值下竹燕窝提取物对细菌MIC的影响2.3.2竹燕窝提取物热稳定性测定结果（见表7）由表7可知，当温度为60 ℃时，竹燕窝提取物对大肠杆菌E. coli ATCC25922的MIC大于64.0 g/L；当温度为100 ℃时，竹燕窝提取物对大肠杆菌E. coli ATCC25922的MIC为1.0 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.015.T007表7在高温作用下竹燕窝对大肠杆菌E. coli ATCC25922的MIC处理MIC对照组0.560 ℃64.070 ℃32.080 ℃16.090 ℃1.0100 ℃10.0g/L因此，随着水浴锅温度的升高，竹燕窝提取物对大肠杆菌E. coli ATCC25922的MIC逐渐降低。3讨论长期使用抗生素可导致病原微生物的耐药性不断增长，药物残留严重[13]。抗菌肽产品因生物活性较高和独特的物理破膜机制，具有作为抗生素替代品的潜力[14]。但目前只有少数抗菌肽产品用于临床治疗。原因是抗菌肽仍存在生产成本高、抗菌性能不完善、结构效应对称关系不准确及体系不完善等问题[15]。此外，天然抗菌肽的抗菌作用温和、肽链过长和毒性较大[16]。因此，需要对毒性小、抑菌活性高、稳定性强的天然物质进行研发，以此获得能够应用到动物饲料中的饲料添加剂产品。竹燕窝中含有氨基酸、蛋白质、矿物元素、果胶和生物活性物质，具有较高的经济价值[17-18]。研究发现，海绵链球菌中多糖的含量较高，并且多糖具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗衰老及免疫调节等功能，具有开发成为饲料添加剂的潜力[19-21]。竹燕窝多糖的实质就是食用菌多糖。研究表明，食用菌多糖在抗癌、抑菌、降低血糖血脂及延缓衰老等方面均具有一定的作用。因此，若竹燕窝的乙醇提取物具有抗菌作用，可作为开发成为药物的潜力。目前对海绵足线虫的研究较少，一些具体机制尚不清楚，许多有效成分尚未找到。市场上流通的产品仅限于新鲜和干燥的产品，没有对竹燕窝进行深加工，因此对竹燕窝深加工产品的开发有待进一步研究。因此，竹燕窝及其提取物的开发具有广阔的发展前景[22-23]。3.1竹燕窝提取物的MIC分析竹燕窝能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物。有研究表明，竹燕窝的甲醇提取物在椎间盘扩散试验中显示出了抗真菌活性[24-25]。本试验结果初步阐明了竹燕窝提取物对3种革兰氏阳性菌（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）和3种革兰氏阴性菌（鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和大肠杆菌）均具有一定的抑菌效果，竹燕窝乙醇提取物对大肠杆菌的抑菌效果最好，竹燕窝乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的杀菌效果优于粪肠球菌，对鼠伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌的杀菌效果优于大肠杆菌。因此，竹燕窝提取物对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌。有研究表明，海绵胶煤炱菌乙醇提取物对姜瘟病菌、水稻白叶枯病菌、白菜软腐菌及柑橘溃疡病菌等细菌均具有抗菌活性，且抑菌圈直径均大于10 mm，敏感性较强；海绵胶煤炱菌乙醇提取物对油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、苹果腐烂病菌、葡萄黑痘病菌、苹果斑点落叶病菌、棉花枯萎病菌和番茄棉腐病菌等病原真菌均无抑制活性[26]。上述结果与本研究结果类似，表明竹燕窝乙醇提取物对病原菌具有抑菌活性，但抑菌活性的效果表现不同。原因可能是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁的组成和结构有所不同，革兰氏阳性细菌的细胞壁由磷酸肽和肽聚糖构成，但没有外膜，而革兰氏阴性细菌的细胞壁含有肽聚糖和脂多糖，且具有外膜。外膜阻止竹燕窝提取物的抑菌物质进入细菌细胞内。对不同病原菌抑制作用存在较大差异的原因需要进一步研究，从而为新型抗菌活性成分的发现和生物农药的研发提供参考[26]。3.2竹燕窝提取物的抑菌稳定性分析本试验发现，竹燕窝提取物在酸性的条件下抑菌效果最好，在pH值为2和6时，竹燕窝提取物对金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌和大肠杆菌的抑菌效果最好。当pH值为2和4时，竹燕窝提取物对表皮葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果最好。这可能是竹燕窝提取物中含有的抑菌物质在碱性条件下遭到一定程度的水解，降低了抑菌效果。有研究表明，当酸性越强，菌株S1-4的抑菌活性越强，当pH值大于6时，细菌素的抑菌活性基本丧失[27]。本试验研究结果与牛爱地等[28]的研究结果类似。本试验发现，随着水浴锅温度的提高，竹燕窝对于大肠杆菌E. coli ATCC25922的MIC逐渐降低。这可能是因为高温破坏了细菌细胞中的蛋白质、核酸和一些活性物质，从而使细菌的生命活动受到影响，使细菌更容易被竹燕窝提取物中的抑菌物质抑制生长。但是高温下竹燕窝提取物的MIC均大于对照组，这可能是温度升高对细菌生长具有限制作用，但竹燕窝提取物中含有的抑菌物质，如一些与抑菌功能相关的酶也在高温的条件下遭到一定程度的失活与变性，使竹燕窝提取物的抑菌效果变差。此试验结果与细菌素pentocin LPEM818W抑菌效果类似，其具体原因可进一步经试验进行验证[29]。此外，有研究表明，以海绵胶煤炱菌多糖作为复合壁材制成的姜黄素微胶囊能够有效干预DSS诱导的小鼠结肠炎，维持肠道屏障完整性和抗氧化能力[30]。本试验中的竹燕窝提取物的抑菌效果欠佳，原因可能是本试验只采用了乙醇作为提取溶剂，并未考虑采用其他溶剂提取，所以需要进行后续的试验加以对比。中草药中的甘草、马齿苋、麦冬、黄芩、蒲公英及金银花等的抑菌和杀菌效果较好。因此未来可进一步研究竹燕窝提取物与几种常见的有抑菌功能的中草药进行复方，从而提高竹燕窝提取物的抑菌效果，为抑菌方面有关产品的开发提供参考。4结论本研究表明，竹燕窝抑菌提取物的最优提取工艺为乙醇浓度85%、液料比5 mL/g、提取时间180 min、提取温度50 ℃。竹燕窝乙醇提取物对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于革兰氏阴性菌，试验明确了竹燕窝在抑菌领域的潜在应用价值，可为抑菌方面的有关产品的开发及应用提供参考。