褐藻胶是由L-古罗糖醛酸（α-L-guluronicacid）和D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronicacid）通过1, 4糖苷键连接而成，是一种天然高分子酸性多糖。目前，褐藻胶主要来源于褐藻门的海带、马尾藻、巨藻和泡叶藻等大型藻类[1]，已广泛应用于食品、生物、水处理和饲料等领域。通过Ca2+螯合形成稳定的凝胶可以作为食品的天然增稠剂[2]；在饲料中添加褐藻胶可以降低化学品的毒性效应，提高肠道吸收率[3]；褐藻胶对水体有机污染物吸附力强，可以用于有机物污染的废水处理[4]。但褐藻胶溶解性和生物活性差，导致其很难推广应用。褐藻寡糖（AOS）是褐藻胶的降解产物，具有抗氧化、免疫调节、调节血糖和血脂等生物活性，在水产养殖方面具有较大的应用潜力。将AOS运用在水产品保鲜中，能够有效去除冰冻水产品中的结晶水，减缓蛋白质的分解，从而改善水产品品质[5]。饲料中适量添加AOS可以有效改善大西洋鲑的肠道微生物群落区系组成[6]。AOS可改善幼鱼的肠道组织形态，提高肠道绒毛高度[7]，提高饲料的有效利用率。在微藻培养领域，添加AOS可以改善碳源，提高藻类的异养同化作用和光合作用[8]，降低金属离子对藻类生长的抑制[9]。文章介绍了褐藻胶裂解酶在制备AOS过程中的重要作用以及AOS在水产行业的应用，为AOS在水产养殖中的应用提供参考。1褐藻胶裂解酶概述褐藻胶裂解酶是制备AOS的重要的工具酶，早期褐藻胶裂解酶是从梭菌（Clostridium alginolyticum）分离得到[1]。目前，褐藻胶裂解酶的产品开发依然面临酶活力较低、酶稳定性差、产物较低等问题。但随着对褐藻胶裂解酶研究的增加，已经在极大程度上拓宽了AOS在食品、农业及医药等各领域的应用。1.1褐藻胶裂解酶的来源及分类目前，制备AOS的褐藻胶裂解酶主要来源有海洋藻类、软体动物、棘皮动物和多种微生物。褐藻胶裂解酶的来源与特征见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.026.T001表1褐藻胶裂解酶的来源与特征酶来源家族底物专一性主要产物文献来源AlyPMPseudoalteromonas sp. SM05247polyM2 or 3LI等[10]AlgBVibrio sp. Ni17polyM2 or 3SHA等[11]VxAly7DVibrio xiamenensis QY1047polyM and polyG1~3TANG等[12]Alyw203Vibrio sp. W27polyG1~2LIU等[13]AlgBVibrio sp. W137polyM and polyG2~5ZHU等[14]VsAlyDVibrio sp. QY1087polyM and polyG不饱和单糖（DEH）ZHANG等[15]AlgptPaenibacillus sp. LJ-23.6 or 31—2~8WANG等[16]AlgL6Microbulbifer sp. ALW16polyGDEHLONG等[17]Aly1281Pseudoalteromonas carrageenovora ASY57polyM and polyG2ZHANG等 [18]ALFA3Formosaalgae KMM 3553T7polyM1~20BELIK等[19]ALFA4Formosaalgae KMM 3553T6polyMG1~20BELIK等[19]TAPL7AThalassotalea algicola7polyM and polyG1~2CAO等[20]AlyC3Psychromonas sp. C-37polyM1~3XU等[21]AlyYAYangia sp. SJ-H-125polyM2张文彬等[22]注：“—”表示文献未提及。由表1可知，海洋细菌中的褐藻胶裂解酶最为丰富，如弧菌属（Vibrio sp.）、微球藻属（Microbulbifer sp.）、交替单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.）、类芽孢杆菌属（Streptomyces sp.）、链霉菌属（Streptomyces sp.）、黄杆菌属（Flavobacterium sp）等。海洋藻类[17]海带（Laminaria）、昆布（Saccharina）、马尾藻（Scagassum）以及软体动物[10]皱纹盘鲍（Haliotis discushannai)中也有丰富的褐藻胶裂解酶。褐藻胶裂解酶按其降解褐藻多糖的作用方式，在生物酶分类数据库（enzyme classification，EC）中被分为多聚α-L-1, 4-古洛糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.11）和多聚β-D-1, 4-甘露糖醛酸裂解酶（EC 4.2.2.3）。基于氨基酸序列比对，可分为不同的多糖裂解酶（PL）家族，包括PL5、PL6、PL7、PL8、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36、PL39和PL41家族（http://www.cazy.org/）。基于作用方式的差异，褐藻胶裂解酶可进一步分为内切酶和外切酶，褐藻胶裂解酶的酶切位点及作用方式见图1。目前已知的褐藻胶裂解酶大多是内切型，内切型褐藻胶裂解酶，主要产物为DP2-20的不饱和寡糖，是可以直接利用的AOS，能够发挥各种生物活性。而外切褐藻胶裂解酶作用于褐藻胶或AOS的非还原末端，释放出的DEH可用作生物燃料[23]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.026.F001图1褐藻胶裂解酶的酶切位点及作用方式注：实心箭头处为内切褐藻胶裂解酶作用位点，空心箭头为外切型褐藻胶裂解酶作用位点根据褐藻胶裂解酶相对分子质量的不同可将其大致分为3类：第1类[24]分子量在20～35 kDa之间；第2类[25]分子量约为40 kDa；第3类[26]分子量约为60 kDa。1.2褐藻胶裂解酶的结构褐藻胶裂解酶在其结构上也表现出很大的变化，随着X射线、衍射等结构生物学技术的发展，更多的褐藻胶裂解酶的结构被确定。目前为止，褐藻胶裂解酶的三维结构属于不同的多糖裂解酶家族，并已得到解析。不同家族褐藻胶裂解酶的结构见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.026.F002图2不同家族褐藻胶裂解酶的结构注：（a）为PL5家族（α/α）n桶状结构；（b）为PL6家族右手β螺旋桶状结构；（c）为PL36家族Aly36B的β果冻卷结构；（d）为PL7家族β果冻卷结构；（e）PL17家族（a/a）n桶状结构+β折叠片的组合结构。(α/α)n桶状结构主要由PL5、PL15和PL17家族表现出来，如PL5家族中的AlgL（PDB:4OZV）[27]。而PL6和PL31家族中的裂解酶同为右手β螺旋桶状结构，如PL6家族中的AlyGC（PDB:6ITG）[28]。β果冻卷结构存在于PL7、PL14、PL18以及PL36家族中，如PL7家族中的AlyV（PDB:7W16）[29]。(α/α)n桶状结构+β折叠片的组合结构，如PL17家族的Alg17c（PDB:4OK2）[30]，PL15和PL39家族褐藻胶裂解酶多为这种结构[31]。目前还有两个家族的结构未被解析，分别是PL32和PL34家族褐藻胶裂解酶。1.3褐藻胶裂解酶的酶学性质从海洋细菌筛选的褐藻胶裂解酶多为内切型裂解酶，多为中性（pH值7.0~9.0），通常具有一定的盐度适应性，在1 000 mmol/L内。金属离子以及表面活性剂（如SDS和EDTA）对不同酶会产生不同的作用。大部分褐藻胶裂解酶的温度适应性在30~55 ℃。CAO等[20]从北极海水中克隆表征TAPL7A具有极端的耐寒性，在15 ℃还具有很高的活性。极少数酶能在极端pH值下存活，但LIU等[13]克隆表达的Alyw203现出优异的pH值稳定性（耐受pH值3.0~12.0），最适pH值为10.0。大多数褐藻胶裂解酶需要金属离子激活，一般对大多数褐藻胶裂解酶起激活作用的有Ca2+、K+和Mg2+，其他金属离子大多会抑制其活性。Alyw203能够受到更多金属离子的激活（Fe3+、Cu2+、Zn2+和Al3+），且只被表面活性剂抑制。褐藻胶裂解酶对底物的选择和产物均具有特异性，多数褐藻胶裂解酶裂解产生DP2-20的寡糖，少部分能够裂解出特定长度的寡糖。如YANG等[32]克隆表征的AlyM具有裂解产生特定M/G比的褐藻酸钠，具有制备特定分子量的AOS的潜力。1.4褐藻胶裂解酶制备褐藻寡糖生物酶法制备AOS就是通过褐藻胶裂解酶的特异性裂解[33]制备出不同低分子量片段的AOS。生物酶法制备AOS具有反应条件温和、催化效率高、底物聚合度可控、无污染等优点，与其他方式相比，酶法制备的AOS可以完整地保留生物活性。本文旨在探寻酶法制备的AOS在水产上的应用，探究AOS在水产养殖中的研究价值和未来的发展方向。2褐藻寡糖在水产养殖中的应用2.1褐藻寡糖在海洋微藻培育上的应用海洋微藻是水产养殖中重要的生物饵料。AOS能够通过提高植物碳、氮同化能力，从而促进其生长[34-35]。AOS对纤细角毛藻（Chaetocerosgracilis）[9]、眼点微绿球藻（Nannochloropsis oculata）[36]、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）[37]、小球藻（Chlorella sp.）和杜氏盐藻（Dunaliella salina）[8]的生长具有明显的促进作用。YOKOSE等[36]研究发现，加入20 g/L的AOS可将拟眼点微绿球藻（Nannochloropsis oculata）的生长速率较对照组提高5倍，但添加量达到40 g/L时，其促生长作用略有下降；AOS能够通过螯合作用与Cu2+结合，从而减少水中Cu2+对眼点绿球藻的抑制作用。YAMASAKI等[37]研究发现，由酶解产生的AOS可以显著提高莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的生长速率，并提高棕榈酸（C16∶0）、亚麻酸（C18∶2）等一系列脂肪酸水平，而由酸解所产生的AOS则无此效果。原因可能是由酶解所产生的AOS具有与生物活性相关的末端不饱和双键结构。马冬冬等[8]发现，AOS可作为有机碳源可显著提高小球藻（Chlorella sp.）和杜氏盐藻（Dunaliella salina）在光下的生长速率。黑暗条件下，两种微藻均可依赖AOS实现完全异养培养。AOS对两种微藻的生长促进作用机制不同，促进小球藻（Chlorella sp.）生长主要通过异养同化作用；对于杜氏盐藻（Dunaliella salina），除异养同化作用外，AOS还可通过促进光合作用促进其生长。2.2褐藻寡糖在水产养殖中的应用AOS具有无毒、无害、无污染且不产生残留等特点，已被研究人员和养殖企业应用到水产养殖当中[38]。AOS除具有通用寡糖特点外，还具有提高水产动物的生长性能，改善水产动物的健康状况[39]等多种生物学功能，且能够有效刺激肠道蠕动，促进肠道健康[40]，是一种绿色、健康的新型饲料添加剂。AOS的添加量对不同水产动物的影响见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.026.T002表2AOS的添加量对不同水产动物的影响水产动物AOS添加量作用文献来源海参400 mg/L增强海参的非特异性免疫力WANG等[41]草鱼5 g/kg抗炎，抗菌，增加脂肪代谢并调节肠道细菌群落组成和丰度LI等[42]斑马鱼300 mg/L提高斑马鱼体内的抗氧化能力，降低血糖KIM等[43]大菱鲆5 000 mg/kg抗炎，抗菌，提高非特异性免疫霍圃宇[44]红鳍东方鲀0.2%提高非特异性免疫苏鹏[45]鲳鲹0.7 g/kg降低卵形鲳鲹血浆中葡萄糖和甘油三酯的浓度。黄健彬等[46]2.2.1褐藻寡糖对水产动物血液生化指标的影响AOS作为新型功能性糖原，可以通过调节相关蛋白从而实现对一系列活动通路的调控，显著降低血液中葡萄糖和甘油三酯的浓度，改善脂类代谢，提高血液中抗氧化物酶的活性，增强机体抗氧化能力，进而提高水产动物存活率[43-45]。KIM等[43]通过蛋白质组学对3组斑马鱼（对照组、高血糖组、AOS处理的高血糖组）进行比较分析，发现AOS通过不断提升斑马鱼血液中超氧化物歧化酶1（SOD 1）、过氧化物还原酶3（PRDX 3）和过氧化物还原酶6（PRDX 6）的表达提高了斑马鱼体内的抗氧化能力，有助于提升高血糖斑马鱼的存活率，并阐明了AOS降低血糖的作用机制（见图3），预测AOS可能是一种通过刺激葡萄糖氧化和抑制乳酸途径改善血糖水平的添加剂。黄健彬等[46]研究发现，在卵形鲳鲹幼鱼饲料中添加0.7 g/kg AOS可以降低卵形鲳鲹血浆中葡萄糖和甘油三酯的浓度。霍圃宇[44]研究发现，添加AOS能够缩小大菱鲆血液中红细胞体积，有利于大菱鲆血液中的氧气运输，提高大菱鲆的耐低氧能力。张梦婷等[47]发现，添加AOS组的红鳍东方鲀，血清溶菌酶活性分别提高了201.761、51.235 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.026.F003图3AOS降低血糖的作用机制2.2.2褐藻寡糖对水产动物免疫功能的影响AOS作为一种绿色新型饲料添加剂，通过提高水产动物体内的免疫酶活性和刺激免疫因子的产生增强水产动物的免疫功能和抗病性，AOS对嗜水气单胞菌、白色念珠菌、鳗弧菌有较强的抑制作用[36]。适量添加AOS可以减少养殖中抗生素的使用，降低养殖动物体内药品残留。LI等[42]研究发现，在草鱼饲料中添加适量AOS可显著增加草鱼肠道中杯状细胞的数量和黏液物质分布，有助于消化吸收，激活了脂肪代谢相关途径的基因表达，显著提高了草鱼肠道的抗氧化能力，降低了炎症因子和上调了免疫细胞因子的表达（见表3）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.026.T003表3AOS对水产动物体内免疫和炎症因子的影响水产动物免疫因子/炎症因子作用效应文献来源海参集落刺激因子（CSF）刺激不同的造血干细胞形成细胞集落，是血细胞发生不可缺少的刺激因素升高WANG等[41]海参免疫球蛋白（lgM）结合补体、中和细菌毒素、增强免疫细胞吞噬能力，是血液中主要的抗体升高WANG等[41]海参组织相容性复合体Ⅱ（MHC Ⅱ）参与抗原识别，呈递免疫信息，具有重要的免疫学生理功能升高WANG等[41]草鱼和海参肿瘤坏死因子（TNF-α）抗肿瘤，参与炎症反应，致热，形成恶病质下降LI等[42]、WANG等[41]草鱼和海参白细胞介素-1β（IL-1β）协同刺激抗原呈递细胞（APC）和T细胞活化，易引起发热和恶病质下降LI等[42]、WANG等[41]草鱼和海参白细胞介素-10（IL-10）抑制炎症细胞因子产生，减弱炎症反应，促进抗体生成升高LI等[42]、WANG等[41]大菱鲆和红鳍东方鲀溶菌酶（LYZ）抗菌、消炎、抗病毒。可表示机体的非特异性免疫水平升高苏鹏[45]、霍圃宇[44]大菱鲆和红鳍东方鲀过氧化物酶（POD）解毒、调节氧浓度、氧化脂肪酸、含氮物质的代谢升高苏鹏[45]、霍圃宇[44]草鱼、大菱鲆和红鳍东方鲀超氧化物歧化酶（SOD）消除自由基，提高抗氧化能力升高苏鹏[45]、霍圃宇[44]草鱼、大菱鲆过氧化氢酶（CAT）催化体内多种反应，降解过氧化氢升高LI等[42]、霍圃宇[44]草鱼谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）降解过氧化物、反映机体硒（Se）水平升高LI等[42]WANG等[41]研究了不同分子量的AOS对海参（Apostichopus japonicus）的影响，结果发现，添加200 mg/L聚合度为2-5DP的AOS可以长时间显著提高海参体腔细胞的吞噬能力、溶菌酶（LYZ）活性，并且低分子量的AOS对体腔细胞中过氧化物酶（POD）活性影响更为明显，证明了AOS可作为海参培养中潜在的低成本免疫刺激剂。霍圃宇[44]在饲料中添加不同水平的AOS，观察其对大菱鲆幼鱼的影响，结果发现，AOS可以显著提高血液中酸性磷酸酶、碱性磷酸酶的活性和白细胞含量，提高血液免疫力；通过攻毒试验发现，AOS可提高头肾淋巴细胞的吞噬率，进而提高对迟缓爱德华氏菌的抵抗作用，并且随着浓度的增加，其抗菌活性也不断增强。黄健彬等[46]也发现，AOS能够提高卵形鲳鲹幼鱼超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）等一系列免疫酶的活性，增强幼鱼的免疫功能。苏鹏[45]在红鳍东方鲀饲料中添加AOS（0.05%、0.1%和0.2%），饲养56 d后，发现部分试验组红鳍东方鲀血清中LYZ、POD和SOD的活性显著提高。2.2.3褐藻寡糖对水产动物肠道微生态与生长性能的影响AOS作为益生元，可以通过改变pH值、与细菌特异性结合，参与和改变肠道菌群，从而提高饲料利用率，也可以通过提高脂肪代谢相关基因的表达加强脂肪代谢和营养吸收，从而提高水产动物生长性能，为提高水产动物经济效益提供新的路径。GUPTA等[6]研究AOS对大西洋鲑的影响，结果发现，添加0.5 g/100 g的AOS促进了某些变形菌门（Proteobacteria）、螺旋体菌门（Spirochaetes）和放线菌门（Actinomycete）细菌的生长，抑制了某些厚壁菌门（Phylum Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroides）细菌的生长（见图4），相关菌群的改变可改善大西洋鲑的生产性能，提高经济效益。HU等[48]研究AOS对草鱼（Ctenopharyngodon idella）生长、脂肪代谢的潜在作用，发现AOS可以提高草鱼的生长性能，原因可能是改善了鱼体内肠道菌落结构，提高了饲料吸收率。并且随着AOS浓度的提高，载脂蛋白A1（Apoa 1）、载脂蛋白A2（Apoa 2）、二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）、酰基转移酶（MGAT）和胆固醇代谢基因（ABCG 5）等一系列与脂肪代谢相关的基因的表达量也会上升，促进脂肪代谢。适量添加AOS也可以改善卵形鲳鲹幼鱼的肠道组织形态[46]，提高肠道绒毛高度，其机制可能是AOS诱导益生菌产生短链脂肪酸，从而降低环境pH值，抑制有害微生物生长，为肠上皮细胞提供了能量，促进肠绒毛增殖和修复的同时降低了饲料系数。潘金露等[49]研究发现，AOS能够显著提高大菱鲆肠道褶皱高度，增加肠道与食物的接触面积，提高消化吸收效率。AOS为肠道修复、调节肠道细菌群落提供了新的思路。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.026.F004图4AOS对大西洋鲑的肠道菌群影响2.3AOS在水产品保鲜上的应用ZHANG等[50]发现，使用AOS处理冷冻的凡纳滨对虾虾肉（Litopenaeus vannamei）可以降低Ca2+-ATP酶活性，有效地抑制总巯基、活性巯基和羰基含量的增加以及肌原纤维蛋白水迁移的变化。AOS和海藻糖（TR）的浸泡可以显著缓解肌原纤维的降解，取代肌球蛋白表面的部分水分子，保持Ca2+-ATP酶活性，稳定了系统中肌球蛋白的构象结构。YAN等[51]研究发现，添加AOS可以通过降低pH值和挥发性碱性氮含量抑制微生物的生长，减缓蛋白质的分解，显著提高虾肉的储存稳定性。虞铭霞等[5]研究了TR和AOS对冻藏紫贻贝的抗冻保水作用，发现TR分子可与肌肉中水分子形成较强结合作用，TR和AOS显著降低了冻藏紫贻贝的解冻损失率，保持了较好的肌肉弹性、咀嚼性以及肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性，同时抑制紫贻贝中菌落总数的增加及保持了组织结构的相对完整。杨天等[52]研究了AOS对鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）鱼糜品质的影响，发现添加1%的AOS可以提高鲢鱼鱼糜的热稳定性，能够对鱼糜蛋白质等离子键起到保护作用。AOS作为一种多功能新型寡糖，不仅能够去除冰冻产品中的结晶水，还能够与水产品中的蛋白质发生作用，改善水产品品质，为冷冻水产品无磷抗冻保水剂的开发提供了新选择。3展望未来国内外市场对饲用AOS添加剂的需求将会持续增加，可进一步挖掘新型的褐藻胶裂解酶，降低寡糖生产成本，创制更多种类的AOS活性多糖；继续对AOS的作用机理进行深入研究，解决AOS的作用途径、不同动物在不同生理状态下的最佳添加量和添加方式、寡糖与其他营养元素之间的协同作用等问题，使AOS添加剂作为抗生素替代品在动物养殖中应用更广泛。