大豆异黄酮存在于成熟的大豆种子中，是一种具有雌激素样活性的物质，具有剂量小、见效快和副作用小等优点[1-2]。异黄酮类物质作为一种生物调节剂，可以影响动物机体内源性激素的分泌，异黄酮类物质可以识别并作用于下丘脑、垂体等组织的雌激素受体（ER），从而影响动物内源性激素分泌水平，进而影响动物的免疫功能、生长发育及繁殖能力等[3-5]。刘帅等[6]研究表明，大豆异黄酮通过调控肠道炎症反应关键信号通路激活STAT蛋白，直接抑制病原体，减轻肠道炎症，从而提高机体免疫力。范红艳等[7]在小鼠饲粮中添加150、300、600 mg/kg的大豆异黄酮，结果表明，添加300、600 mg/kg的大豆异黄酮可以增加小鼠睾丸指数、精子密度，降低精子畸形率。在实际生产中，大豆异黄酮还具有剂量小、毒性低及见效快等优点。但大豆异黄酮中的染料木素属于低毒物质，动物摄入过多的植物雌激素会使繁殖机能出现障碍，如内膜囊肿、性成熟提早、流产及不孕不育等[8]。目前，对大豆异黄酮在家禽中的应用进行了广泛的研究，但由于动物种类、性别及年龄等因素，大豆异黄酮的安全使用剂量还不明确。因此，本试验研究不同剂量的大豆异黄酮对坝上长尾鸡生长性能、免疫功能、睾丸发育及生殖激素的影响，确定其合理添加范围，为新型绿色饲料添加剂的开发和应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料大豆异黄酮（4，7-二羟基异黄酮99.1%）由南京松冠生物科技有限公司提供，为黄色粉末。1.2试验设计本试验选取750只40周龄的坝上长尾公鸡，随机分为5组，每组3个重复，每个重复50只鸡。各试验组分别在基础饲粮中添加5、10、15、20、25 mg/kg大豆异黄酮，各组鸡初始体重无显著差异。坝上长尾鸡基础饲粮参照坝上长尾鸡饲养标准配制，其组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.007.T001表1基础饲粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米62.00代谢能/(MJ/kg)12.70豆粕24.00粗蛋白/%16.00小麦麸1.00钙/%1.22石粉8.00总磷/%0.42预混料5.00注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 1 500 IU、VD 200 IU、VE 10 mg、VB1 1.8 mg、VB2 3.6 mg、叶酸0.55 mg、生物素0.15 mg、胆碱13 000 mg、VB12 0.01 mg、泛酸10 mg、Mn 60 mg、Zn 40 mg、Fe 80 mg、Cu 8 mg、Se 0.15 mg。2.营养水平均为计算值。1.3饲养管理试验前，鸡舍进行全面消毒和净化，试验期间每日清扫，2~3 d消毒1次，保持环境清洁。其他养殖管理方法参照养殖场管理模式进行。坝上长尾鸡采用笼养方式，试验期间自由进食和饮水。每天记录鸡舍温度和湿度，观察鸡群健康状况并记录。预试期7 d，正式试验期63 d。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验期间按重复称量试验鸡的体重，记录各重复试验鸡的采食量，计算增重和平均日采食量（ADFI）。增重=末重-初重(1)ADFI=(加料量-剩料量)/试验天数(2)1.4.2免疫指标每组随机选取24只坝上长尾公鸡，处死并称重，取出脾脏、胸腺和法氏囊，待表面无血迹和水分后，称重，计算免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官重量(g)/体重(kg)(3)1.4.3睾丸发育试验结束时，各组随机选取24只公鸡进行屠宰，取左、右两侧的睾丸，称重。睾丸指数=睾丸总重(g)/体重(g)(4)1.4.4精液品质采精量：采用标有刻度的集精杯采集精液。精子活力等级：利用显微镜直接观察精子运动的能力。精子密度：采用血细胞计数法测定精子密度。精液pH值：采用pH计（PHS-3C，上海雷磁试验仪器制造有限公司）测量精液pH值。有效精子数：是射精量、精子密度和精子活率3个指标的乘积。精子畸形率=畸形精子数/精子总数×100%(5)1.4.5血浆生殖激素试验结束后，坝上长尾鸡禁食12 h，正常饮水，每组随机选取24只坝上长尾公鸡，心脏采血5 mL，将血样注入带有抗凝剂的离心管中，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，将血浆样品分装，置于-20 ℃冰箱保存。采用酶联免疫法（ELISA）测定鸡的睾酮（TESTO）、促卵泡生成素（FSH）和黄体生成素（LH）的含量，具体操作参照试剂盒说明书进行。ELISA试剂盒由上海科艾博生物技术有限公司提供。1.5数据统计与分析采用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析，LSD法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1大豆异黄酮对坝上长尾鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，饲粮中添加不同剂量大豆异黄酮后，各组坝上长尾鸡的末重无显著差异（P0.05）。Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组坝上长尾鸡增重显著高于Ⅰ组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.007.T002表2大豆异黄酮对坝上长尾鸡生长性能的影响项目初重/(g/只)末重/(g/只)增重/(g/只)ADFI/[g/(只·d)]P值0.0860.0580.0320.255Ⅰ组1 786.83±53.331 798.22±72.3411.44±1.18b62.95±2.48Ⅱ组1 798.49±53.581 810.33±108.9512.48±0.24a63.17±0.11Ⅲ组1 795.13±71.001 808.18±112.7012.99±0.17a63.16±0.72Ⅳ组1 802.01±88.031 814.61±94.1712.59±0.26a63.20±1.09Ⅴ组1 809.33±81.271 821.51±105.1212.16±0.22a61.21±0.37注：同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。2.2大豆异黄酮对坝上长尾鸡免疫功能的影响（见表3）由表3可知，Ⅲ组坝上长尾鸡的胸腺指数、法氏囊指数和脾脏指数最高，胸腺指数分别比Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组和Ⅴ组显著提高13.23%、5.91%、9.61%和16.20%（P0.05）；法氏囊指数分别比Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅴ组显著提高16.09%、14.70%和22.67%（P0.05）；脾脏指数比Ⅰ组显著提高17.98%（P0.05）。Ⅰ组坝上长尾鸡的脾脏指数显著低于Ⅱ组、Ⅴ组和Ⅳ组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.007.T003表3大豆异黄酮对坝上长尾鸡免疫功能的影响项目胸腺重量/g法氏囊重量/g脾脏重量/g胸腺指数/(g/kg)法氏囊指数/(g/kg)脾脏指数/(g/kg)P值0.0240.0450.0480.0430.0370.033Ⅰ组10.75±2.17b7.03±1.02b4.07±1.01b6.65±0.14b5.78±0.50b1.78±0.34bⅡ组12.87±1.47b7.37±0.61b4.59±0.59a7.11±0.58b5.85±0.93b1.98±0.13aⅢ组15.63±3.63a7.79±0.45a4.70±0.37a7.53±0.40a6.71±0.45a2.10±0.31aⅣ组9.96±1.03b7.48±0.64a4.43±0.95a6.87±0.90b6.15±0.12a1.91±0.09aⅤ组9.35±0.79b6.29±0.95b3.86±0.94a6.48±0.35b5.47±0.40b1.90±0.20a2.3大豆异黄酮对坝上长尾鸡睾丸指数的影响（见表4）由表4可知，Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组的睾丸重量、睾丸指数均与Ⅰ组差异显著（P0.05），睾丸指数分别比Ⅰ组提高10.90%、11.74%、11.22%和10.59%，Ⅲ组坝上长尾鸡的睾丸指数最高。随着大豆异黄酮添加剂量的增加，睾丸指数呈先上升再下降的趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.007.T004表4大豆异黄酮对坝上长尾鸡睾丸指数的影响项目体重/g睾丸重量/g睾丸指数/(g/kg)P值0.0580.0470.021Ⅰ组1 798.22±72.3417.15±1.79b9.54±0.97bⅡ组1 810.33±108.9519.16±1.61a10.58±0.99aⅢ组1 808.18±112.7019.27±1.35a10.66±1.19aⅣ组1 814.61±94.1719.26±0.79a10.61±0.52aⅤ组1 821.51±105.1219.22±0.65a10.55±0.37a2.4大豆异黄酮对坝上长尾鸡精液品质的影响（见表5）由表5可知，Ⅲ组坝上长尾鸡的采精量最高，分别比Ⅰ组和Ⅱ组显著提高9.52%和6.98%（P0.05）；Ⅲ组坝上长尾鸡的精子密度最高，分别比Ⅰ组和Ⅴ组显著提高4.79%和2.22%（P0.05）；Ⅲ组坝上长尾鸡的精子活力比Ⅰ组显著提高6.41%（P0.05)；Ⅲ组坝上长尾鸡的精子畸形率显著低于其他各组（P0.05)；Ⅲ组坝上长尾鸡的有效精子数最高，分别比Ⅰ组和Ⅱ组显著提高8.97%和7.13%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.007.T005表5大豆异黄酮对坝上长尾鸡精液品质的影响项目采精量/mL精子密度/(×108/mL)精子活力等级精子畸形率/%精液pH值有效精子数/×109个P值0.0450.0470.0340.0460.0940.023Ⅰ组0.42±0.03b9.650±1.142b0.905±0.068b4.59±0.16a7.2±0.213.859±0.002bⅡ组0.43±0.04b10.091±1.408a0.923±0.021a4.50±0.17a7.2±0.153.925±0.002bⅢ组0.46±0.08a10.112±1.713a0.963±0.045a4.30±0.14c7.2±0.374.205±0.004aⅣ组0.45±0.06a10.101±1.506a0.949±0.053a4.37±0.16b7.3±0.164.114±0.005aⅤ组0.44±0.09a9.892±1.346b0.913±0.067ab4.41±0.21b7.3±0.144.027±0.008a随着大豆异黄酮的添加量增加，精液品质呈先上升再下降的趋势。2.5大豆异黄酮对坝上长尾鸡血浆生殖激素的影响（见表6）由表6可知，Ⅲ组坝上长尾鸡的TESTO含量分别比Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅴ组显著提高10.42%、4.72%和6.42%（P0.05）；Ⅱ组和Ⅲ组坝上长尾鸡的FSH含量显著高于Ⅰ组、Ⅳ组和Ⅴ组（P0.05）；Ⅲ组坝上长尾鸡的LH含量分别比Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅴ组显著提高7.63%、5.83%和10.12%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.007.T006表6大豆异黄酮对坝上长尾鸡血浆生殖激素的影响项目TESTO/(μmol/L)FSH/(mIU/mL)LH/(mIU/mL)P值0.0380.0490.043Ⅰ组25.54±0.49b4.72±0.38b3.54±0.19bⅡ组26.93±0.18b5.25±0.10a3.60±0.22bⅢ组28.20±0.53a5.34±0.13a3.81±0.44aⅣ组27.95±0.54a4.68±0.61b3.63±0.40abⅤ组26.50±0.90b4.53±0.21b3.46±0.37b血浆生殖激素水平随着饲粮中大豆异黄酮添加量的升高呈现先上升后下降的趋势。3讨论3.1大豆异黄酮对坝上长尾鸡生长性能的影响集约化、机械化饲养模式导致家禽的生长处于长期应激状态，抗病力和生产性能降低。大豆异黄酮作为天然抗氧化剂，能够通过下丘脑-垂体-生长轴发挥促进动物生长的作用，并能提高生产效益[9-10]。高峰等[11]研究表明，依莎蛋公雏鸡饲粮中添加5 mg/kg大豆黄酮，能够极显著提高雏鸡的增重，同时料重比较对照组显著降低7.4%。饲粮中添加大豆异黄酮能够降低生长抑制激素水平，提高岭南黄羽肉鸡的生长性能[12]。本试验中，饲粮中添加大豆异黄酮能够提高坝上长尾鸡增重。分析原因可能是大豆异黄酮具有弱雌激素的作用，能够提高鸡十二指肠雌激素受体ESRα、生长激素（GH）和胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）水平，从而促进肠道消化吸收，改善鸡的生长性能。3.2大豆异黄酮对坝上长尾鸡免疫功能的影响胸腺是动物机体重要的淋巴器官[13-14]，能够分泌胸腺激素及激素类物质，T细胞在胸腺中发育、分化和成熟。法氏囊是重要的中枢免疫器官，受到抗原刺激时大部分B淋巴细胞在这里增殖分化，以发挥免疫作用。禽类重要的外周免疫器官是脾脏，大部分T淋巴细胞和B淋巴细胞被送至这里并发挥作用。因此，常用胸腺指数、法氏囊指数及脾脏指数反映家禽机体的免疫功能[15]。在禽类免疫方面的试验中，大豆异黄酮大部分呈现出正向的作用。郭晓红等[16]将不同剂量的大豆黄酮添加到艾维茵肉鸡的基础饲粮中，结果显示，免疫器官指数明显提高，血清新城疫病毒（NDV）抗体效价也有所提高。刘宝德等[17]在试验组雏鸡的基础饲粮中添加一定剂量大豆黄酮（Ⅱ）、低聚木糖（Ⅲ）及大豆黄酮+低聚木糖（W），与对照组相比，各试验组雏鸡的胸腺指数分别提高34.75%、26.58%和16.11%，脾脏指数分别提高28.99%、28.00%和18.28%。王洋等[18]试验表明，不同添加量的大豆异黄酮能够不同程度地促进法氏囊和脾脏的发育，与对照组相比，试验组肉仔鸡的细胞免疫功能显著增强，但高剂量组与低剂量组之间差异不显著。本试验中，饲粮中添加适宜水平的大豆异黄酮可以改善坝上长尾鸡免疫功能，与上述试验结果基本一致。原因可能是：大豆异黄酮可以直接作用于免疫系统中的雌激素受体；大豆异黄酮能够影响垂体分泌的催乳素（PRL）和GH水平，间接提高机体的免疫功能；大豆异黄酮降低了动物体内生长抑素（SS）的分泌水平，有助于垂体分泌GH，促进免疫系统发挥作用[19-20]。3.3大豆异黄酮对坝上长尾鸡精液品质的影响睾丸是形成精子的生殖器官，对雄激素的分泌、畜禽的繁殖性能起重要作用。李仲阳[21]研究大豆异黄酮对种公羊血液生殖激素浓度、抗氧化指标和精液品质的影响，试验表明，添加大豆异黄酮显著提高了精子长时间保存后的活力、精子有效存活时间、质膜完整性和顶体完整性，提高了精液常温和低温保存效果。HENG等[22]研究表明，在鸡的饲粮中添加5 mg/kg的大豆异黄酮对体重无显著影响，但可以明显提高睾丸指数。马海田等[23]研究表明，大豆异黄酮能够激活大鼠睾丸间质细胞中环磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）活性，同时抑制芳香化酶的活性，从而提高睾丸间质细胞睾酮含量。本试验的结果与上述结论相似，大豆异黄酮显著提高了睾丸重与睾丸指数。这可能是植物雌激素的作用，植物雌激素与下丘脑和垂体的雌激素受体作用后，使睾丸进一步发育；但睾丸指数并未随大豆异黄酮添加量的提高而提高，因为添加的大豆异黄酮的剂量越高，雄性动物体内雌激素过多，超过了雄性动物所能承受的范围，会抑制睾丸的发育[24]。本试验中，15 mg/kg大豆异黄酮组坝上长尾鸡睾丸指数最高。影响精子产生与成熟的最直接的因素是睾酮水平。大豆异黄酮属于具有低雌激素活性的植物雌激素[25]，能够在不同程度上结合雌激素受体（下丘脑、垂体等雌二醇受体），可以促进雄性睾丸激素的产生和释放。郭振慧等[26]研究表明，在饲粮中添加一定剂量的大豆异黄酮可以提高精液量，温度在19~25 ℃的时候效果不明显，可能与添加时间长短有关。随着时间的延长，高剂量组的精液量和精子密度有很大的改善，与对照组差异较大。大豆异黄酮对精子活力与畸形率的影响不太明显，但也略有变化。以小鼠为例，添加5 mg/kg大豆异黄酮和7-异丙氧基异黄酮可以提高精子活动性，使精子畸形率下降；但添加100 mg/kg大豆异黄酮和7-异丙氧基异黄酮反而会降低精子活力，使精液畸形率增加，这说明饲粮中大豆异黄酮剂量过高会导致小鼠精液品质下降[27]。本试验也得到相似的结论，说明适宜剂量的大豆异黄酮能够提高睾酮的水平，促进精子的成熟与发生，促进睾丸的生长，改善动物的精液品质；但过高剂量的大豆异黄酮会抑制调节性腺激素的下丘脑-垂体-性腺轴功能，使睾丸萎缩，生精细胞能力减弱，睾丸间质细胞发生改变，睾酮分泌量过少，精液品质下降。3.4大豆异黄酮对坝上长尾鸡血浆生殖激素的影响大豆异黄酮的雌激素可作用于生殖轴，在睾丸的生长发育以及精子发生过程中起重要作用，影响动物的生殖性能[28]。TESTO由睾丸间质细胞产生，作用于精细胞生成精子的过程。FSH与LH均由垂体前叶的嗜碱性粒细胞分泌，FSH作用于细胞核的生精小管，促进精子形成；LH由垂体前叶嗜碱性细胞分泌，LH与FSH协同促进间质细胞发育和TESTO的分泌。饲粮中添加一定剂量的大豆异黄酮可以提高TESTO的分泌水平，此外一定剂量的大豆异黄酮也可以提高FSH、LH的分泌水平。黄金明等[29]在公鸡饲粮中添加不同剂量的大豆黄酮，结果发现，低剂量组的成熟精子数量增多，说明低剂量的大豆黄酮更能促进精子生成，原因可能是大豆黄酮在低剂量情况下促进了FSH的分泌，FSH进一步刺激睾丸曲细精管的成熟度，并产生了大量精子，表明种公鸡睾丸发育与大豆黄酮的剂量有关。在基础饲粮中添加不同剂量（0、5、10、15、25 mg/kg）的大豆异黄酮，检测公鸡血浆生殖激素水平，结果表明，低剂量的大豆异黄酮能够明显促进公鸡生殖激素的分泌水平，高剂量的大豆异黄酮使血浆生殖激素分泌水平下降。本试验中，适宜水平的大豆异黄酮能够显著提高血浆生殖激素的分泌水平，且随着大豆异黄酮添加剂量的提高，生殖激素呈先升高后降低的趋势。本试验结果与上述研究基本一致，原因可能是：大豆异黄酮特异性识别并结合睾丸间质细胞膜上的雌激素受体，使ATP脱磷酸成环磷酸腺苷（cAMP），cAMP作为第二信使激活蛋白激酶（PKA），而PKA激活了与睾酮合成相关的一系列酶，促进睾丸间质细胞蛋白磷酸化，进而促进TESTO大量合成，提高精子的生成率[30]；大豆异黄酮也具有独特的识别能力，能够在不同程度上影响促性腺激素释放激素（GnRH）分泌。4结论在本试验条件下，大豆异黄酮能够改善坝上长尾鸡的生长性能、免疫功能、睾丸发育、精液品质及血浆生殖激素的分泌水平，最适添加量为15 mg/kg。