鱼粉具有营养平衡、适口性好、易被水产动物消化及吸收等优点，被广泛应用于凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）饲料中。但是鱼粉需求量逐年增加，鱼粉价格高且供应不足[1-2]，因此寻找鱼粉的替代品势在必行。猪血球蛋白粉采用喷雾干燥生产工艺，氨基酸的生物降解很少[3]，蛋氨酸含量一般，但赖氨酸含量高[4]。玉米蛋白粉蛋白质含量高，抗营养因子少，蛋氨酸含量高，但赖氨酸和精氨酸含量低[5]。玉米蛋白粉可以替代部分鱼粉，对凡纳滨对虾生长无明显影响[6]。黑水虻的生长速度快、繁殖周期短，黑水虻粉蛋白质和脂质转化率高、产量大，被认为是具有发展潜力的昆虫饲料蛋白[7-8]。目前，脱脂黑水虻虫粉替代鱼粉蛋白已用于大黄鱼（Larimichthys crocea）、虹鳟（Oncorhynchus mykis）、乌鳢（Chana argus）、日本鲈鱼（Lateolabrax japonicus）等水产动物生产中[9]。酶解脱脂黑水虻粉富含抗氧化肽，能够抑制或减少自由基或非自由基反应引起的机体损伤害[10]。玉米蛋白粉和猪血球蛋白粉混合添加可以保证赖氨酸和蛋氨酸的平衡[4-5]，脱脂黑水虻粉可以部分替代鱼粉，三者混合替代鱼粉可以在一定限度上提高鱼粉替代比例。本研究拟用玉米蛋白粉、猪血球蛋白粉和酶解脱脂黑水虻粉组合替代鱼粉，探究复合蛋白源对凡纳滨对虾生长、血清生化指标、抗氧化和免疫功能的影响，以期降低饲料成本，为复合蛋白源替代鱼粉的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料本试验的凡纳滨对虾虾苗购自珠海海兴农种苗厂，试验在海大集团莲溪试验基地进行。以复合蛋白源（猪血球蛋白粉∶玉米蛋白粉∶酶解脱脂黑水虻粉=1.0∶1.0∶5.7）分别等氮等脂替代0、20%、40%、60%、80%和100%的鱼粉，制作6组配合饲料，分别命名为M1组、M2组、M3组、M4组、M5组和M6组。试验饲料组成及营养水平见表1。所有原料利用搅拌机混合均匀，放入压条机（F-75型双螺旋杆挤条机）压条，制成直径1.2 mm的条状饲料，放入制粒机（G-500型造粒机）制粒。制粒后所有饲料放入熟化桶内熟化30 min，25 ℃阴干后过筛，按组别分装，置于-20 ℃条件下保存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.010.T001表1试验饲料组成及营养水平项目M1组M2组M3组M4组M5组M6组原料组成秘鲁进口鱼粉25.0020.0015.0010.005.000虾粉7.007.007.007.007.007.00鸡肉粉7.007.007.007.007.007.00猪血球蛋白粉00.601.201.802.403.00酶解脱脂黑水虻粉03.446.8810.3213.7617.20虾膏2.002.002.002.002.002.00鱿鱼膏2.502.502.502.502.502.50玉米蛋白粉00.601.201.802.403.00豆粕12.0012.0012.0012.0012.0012.00花生麸5.005.005.005.005.005.00菜粕10.0010.0010.0010.0010.0010.00高筋面粉22.0022.0022.0022.0022.0022.00精炼鱼油1.001.001.001.001.001.00豆油1.000.970.940.910.880.85大豆磷脂油1.001.001.001.001.001.00磷酸二氢钙2.002.002.002.002.002.00微晶纤维素00.280.560.841.121.40氯化钠0.200.200.200.200.200.20氯化胆碱（60%）0.300.300.300.300.300.30L-赖氨酸盐酸盐（98.5%）00.060.120.180.240.30DL-蛋氨酸00.040.080.120.160.20L-苏氨酸00.010.020.030.040.05复合维生素1.001.001.001.001.001.00复合矿物质1.001.001.001.001.001.00合计100.00100.00100.00100.00100.00100.00营养水平水分8.209.108.408.609.008.50粗蛋白42.8042.4042.7042.6042.3042.50粗脂肪7.206.907.307.107.007.20赖氨酸2.532.542.562.562.622.63蛋氨酸0.830.810.780.820.850.86苏氨酸1.511.501.521.541.521.51注：1.秘鲁进口鱼粉由广东华昇贸易有限公司提供，粗蛋白68.0%、粗脂肪9.0%。2.猪血球蛋白粉由肇庆市金海源生物科技有限公司提供，粗蛋白92.3%、粗脂肪2.0%。3.酶解脱脂黑水虻粉由广东海大集团股份有限公司提供，蛋白质64.5%、粗脂肪8.0%。4.玉米蛋白粉由黑龙江金象生化有限责任公司提供，蛋白质60.9%、粗脂肪1.0%。5.复合维生素为每千克饲料提供：VA 12 000 IU、核黄素40 mg、VB12 0.02 mg、VB1 50 mg、VK 40 mg、VC 250 mg、叶酸10 mg、泛酸钙100 mg、烟酸120mg、生物素1 mg、VD3 2 000 IU、VE 120 mg、盐酸吡哆醇60 mg。6.复合矿物质为每千克饲料提供：一水硫酸亚铁30.41 mg、一水硫酸铜41.91 mg、一水硫酸锌274.34 mg、一水硫酸镁284.47 mg、碘酸钙6.14 mg、亚硒酸钠0.44 mg、硫酸钴2.89 mg。%1.2试验设计及饲养管理正式试验开始前，凡纳滨对虾使用相同的商业饲料暂养投喂20 d。暂养结束后，挑选初重（1.01±0.01）g健康有活力的凡纳滨对虾1 440尾，随机分为6组，每组4个重复，每个重复60尾虾。试验在室外土塘搭建的悬挂网箱系统中进行，系统由24个网箱（100 cm × 100 cm × 150 cm）组成。试验虾每日投喂3次（7：00、12：00、18：00），餐后1.5 h观察摄食情况，根据摄食情况调整投喂量并记录。试验期56 d。试验前期凡纳滨对虾较小，需要对饲料进行粉碎处理，粉碎后饲料通过16目和36目叠加的筛网，取两粒径筛网之间的碎料进行投喂，后期（试验虾体重5 g左右）逐渐转喂正常颗粒饲料。养殖期间，水中溶解氧含量为5.8~6.8 mg/L，氨氮含量为0~0.2 mg/L，水温为29~31 ℃，盐度为5‰~8‰，及时记录投喂情况。1.3氨氮胁迫试验生长试验结束后，提前进行预试验，以确定试验条件。正式进行氨氮应激试验时，每组各取18尾虾进行18 h氨氮胁迫试验，期间水中溶解氧含量为5.8~6.8 mg/L。每组虾放置在100 L水体中，并添加15 g氯化铵，搅拌均匀，使氯化铵溶液浓度为150 mg/L，水温保持29~31 ℃，盐度为6‰。试验期间，每隔3 h对试验虾状态进行观察，捞出死虾，统计剩余试验虾数量。1.4样品采集生长试验期间，每周进行1次称重，记录试验虾生长情况。生长试验结束后，统计每个网箱试验虾存活尾数、总重以及投喂的饲料总重等，计算存活率、增重率及饲料效率等。取样前试验虾禁食24 h，每组随机选取10尾虾于-20 ℃保存，用于体组成分析。另取10尾虾用肝素钠浸润的1 mL针管头部取血，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清，-80 ℃保存，用于血清生化指标分析。另取5尾虾测量体重、体长和肝胰腺重量，用于计算肝体比；同时采集肝胰腺，-80 ℃保存，用于抗氧化指标分析。1.5测定指标及方法1.5.1生长性能增重率(WG)=(末重-初重)/初重×100% (1)肝体比(HSI)=肝胰腺重/虾重×100%(2)肥满度(CF)=体重/体长3 (3)饲料效率(FE)=增重/摄食量(4)蛋白质效率(PER)=增重/蛋白质投喂量(5)蛋白质沉积率(PPV)=虾体蛋白质贮积量/摄入的蛋白质总量×100%(6)1.5.2虾体组成采用杜马斯燃烧法快速定氮仪（Elementar，德国）测定虾肌肉的粗蛋白含量，采用全自动脂肪仪（ANKOMx715自动脂肪仪，美国）测定虾肌肉的粗脂肪含量。全虾样品在烘箱中105 ℃烘干24 h，按照减重法计算水分含量。全虾样品在电炉上充分燃烧碳化后，置于马弗炉中600 ℃灼烧3 h，冷却后取出按减重法计算全鱼灰分。1.5.3血清生化指标采用全自动生化分析仪（Hitachi 7170，DAICHI，Tokyo，Japan）测定血清碱性磷酸酶（AKP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活性以及总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）水平。1.5.4肝胰腺抗氧化指标根据南京建成生物工程研究所的检测试剂盒的说明书测定虾肝胰腺丙二醛（MDA）含量以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活性。1.6数据统计与分析数据采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能和饲料利用的影响（见表2）由表2可知，M4组凡纳滨对虾的增重率和特定生长率显著高于M1组（P0.05）。M2组、M3组和M4组凡纳滨对虾的饲料效率显著高于M1组（P0.05）。M2组和M4组凡纳滨对虾的蛋白质效率显著高于M1组、M5组和M6组。M6组凡纳滨对虾的蛋白沉积率显著低于M1组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.010.T002表2复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能和饲料利用的影响项目M1组M2组M3组M4组M5组M6组初重/(g/尾)1.00±0.011.00±0.011.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00末重/(g/尾)10.96±0.28bcd11.32±0.36abc11.36±0.20ab11.51±0.42a10.85±0.19cd10.56±0.39d增重率/%992.52±29.48bcd1 029.87±37.07abc1 033.80±19.22ab1 047.46±40.70a982.80±19.62cd955.53±37.92d特定生长率/(%/d)4.27±0.05bc4.33±0.06ab4.34±0.03ab4.36±0.06a4.25±0.03bc4.21±0.06c存活率/%96.67±2.3697.08±2.8597.08±2.5097.08±2.8596.67±1.3695.83±2.15饲料效率0.94±0.01b0.98±0.01a0.98±0.02a1.00±0.01a0.93±0.02b0.89±0.02c蛋白质效率/%2.43±0.02c2.51±0.02ab2.48±0.04bc2.54±0.03a2.37±0.04d2.27±0.04e蛋白沉积率/%46.23±1.98ab48.00±1.27a47.12±0.88ab47.59±2.19ab44.99±1.22b42.15±2.03c肝体比/%3.63±0.163.65±0.393.80±0.693.62±0.433.57±0.293.66±0.23肥满度/(g/cm3)0.83±0.100.88±0.090.86±0.100.89±0.040.84±0.130.88±0.02注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05）。2.2复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾体组成的影响（见表3）由表3可知，复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾的全虾体组成无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.010.T003表3复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾体组成的影响（干重）组别水分粗蛋白粗脂肪灰分M1组77.13±0.2217.30±0.751.22±0.033.77±0.11M2组77.42±0.7017.43±0.421.22±0.053.56±0.19M3组76.54±0.3017.35±0.301.22±0.063.52±0.01M4组77.65±0.3617.08±0.641.19±0.063.46±0.32M5组77.43±0.4417.21±0.371.23±0.063.68±0.26M6组77.17±0.2817.20±0.381.22±0.063.59±0.12%2.3复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，M6组凡纳滨对虾血清中AST和ALT活性显著高于其他各组（P0.05），AKP活性和TP含量显著低于其他各组（P0.05）。M3组和M6组凡纳滨对虾血清中ALB含量显著高于M5组（P0.05）。M6组凡纳滨对虾血清中CHO和TG含量显著高于M1组和M2组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.010.T004表4复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾血清生化指标的影响组别AKP/(U/L)AST/(U/L)ALT/(U/L)TP/(g/L)ALB/(g/L)CHO/(mmoL/L)TG/(mmoL/L)M1组84.50±4.04ab523.75±13.46c442.50±17.17c83.17±8.07a7.08±0.17ab1.64±0.14b1.94±0.07bM2组86.75±4.99a531.73±23.06b419.55±31.23c82.40±6.77a6.95±0.19ab1.63±0.22b1.95±0.08bM3组79.50±2.65bc533.10±24.83b436.10±23.91c84.85±6.93a7.35±0.59a1.88±0.22ab2.20±0.29abM4组82.50±4.51ab530.70±17.95b457.38±26.71c81.03±3.13a6.90±0.32ab1.95±0.20a2.20±0.29abM5组75.25±4.57c469.88±39.01b498.53±10.65b80.13±6.53a6.40±0.82b2.13±0.18a1.87±0.41bM6组67.75±2.63d617.98±30.54a577.55±27.60a63.78±3.72b7.18±0.30a2.13±0.10a2.72±0.15a注：同列数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。2.4复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化指标的影响（见表5）由表5可知，M6组凡纳滨对虾肝胰腺GSH-Px、SOD和ACP活性显著低于其他各组（P0.05），MDA含量显著高于M1组、M2组和M3组（P0.05）。M5组凡纳滨对虾肝胰腺LZM活性显著低于M3组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.010.T005表5复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化指标的影响组别GSH-PxSODMDALZMACPAKPM1组25.78±4.35a21.35±2.30b2.43±0.38c2.24±0.27ab54.38±4.28a30.00±5.72M2组29.35±5.69a20.97±2.41b2.65±0.40c2.31±0.31ab54.44±3.91a31.45±5.51M3组25.74±3.85a23.83±2.52ab2.76±0.18bc2.73±0.39a49.41±1.99a28.84±1.57M4组28.58±3.72a26.60±1.81a3.18±0.12ab2.50±0.14ab52.63±6.84a33.48±1.39M5组28.26±3.88a20.55±3.59b3.13±0.22ab2.18±0.10b48.41±2.48a29.40±2.25M6组16.12±2.66b16.57±1.96c3.42±0.27a2.46±0.44ab40.38±4.87b27.06±4.36U/mg prot2.5复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾氨氮胁迫存活率的影响（见表6）由表6可知，氨氮胁迫18 h后，M6组凡纳滨对虾的存活率显著低于其他各组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.010.T006表6复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾氨氮胁迫存活率的影响组别氨氮胁迫时间/h369121518M1组100.0±097.2±3.295.8±2.887.5±2.876.4±2.862.5±5.3aM2组100.0±097.2±3.294.4±2.888.9±3.279.2±8.366.7±4.5aM3组98.6±2.895.8±2.893.1±5.388.9±7.981.9±5.366.7±7.9aM4组100.0±0100.0±098.6±2.893.1±2.881.9±9.569.4±7.2aM5组100.0±095.8±2.894.4±0.086.1±3.276.4±2.862.5±2.8aM6组100.0±095.8±2.888.9±4.584.7±2.869.4±7.250.0±4.5b%3讨论3.1复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能、饲料利用和体组成的影响本研究中，由酶解脱脂黑水虻粉、猪血球蛋白粉和玉米蛋白粉组合蛋白源替代60%的鱼粉可以显著提高凡纳滨对虾的生长性能，替代80%鱼粉也不会影响凡纳滨对虾的生长性能，但复合蛋白源完全替代鱼粉后会造成凡纳滨对虾增重率显著降低。研究发现，使用复合植物蛋白源（双低菜粕∶大米蛋白粉∶玉米蛋白粉=5∶3∶2）替代配合饲料中80%的鱼粉不会影响凡纳滨对虾的生长[11]。徐田田等[12]研究发现，配合饲料中复合植物蛋白（豆粕∶花生饼∶玉米蛋白粉∶菜粕=4∶3∶1∶1）替代鱼粉的比例最好在14%以下。造成这种差异的原因可能是本研究配制的复合蛋白源有动物蛋白和植物蛋白，且氨基酸组成更贴合鱼粉的氨基酸组成，高比例替代鱼粉并不会对凡纳滨对虾的生长性能造成负面影响。有研究发现，利用鸡肉粉、大豆浓缩蛋白和发酵豆粕组成的复合蛋白替代配合饲料中40%~80%的鱼粉对卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）的生长性能无显著影响[13]。配合饲料中利用复合蛋白替代一定比例的鱼粉不会对大口黑鲈（Micropterus salmoides）[14-15]、三倍体虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[16]和大菱鲆（Scophthalmus maximus）[17]的生长造成负面影响，这与本文的研究结果相似。凡纳滨对虾饲料中玉米蛋白粉最多替代10%的鱼粉[6]，黑水虻粉最多可替代15%的鱼粉[18]。动植物复合蛋白相较单一蛋白可以替代更多的鱼粉，过多的植物蛋白会造成饲料适口性下降，消化利用率降低[19]，从而导致替代鱼粉比例较低。单一动物蛋白存在氨基酸不平衡的问题，动植物复合蛋白可以调节氨基酸组成，从而提高复合蛋白替代鱼粉的比例。本研究发现，复合蛋白源100%替代鱼粉时会降低凡纳滨对虾FE、PER和PPV。刘尧等[11]研究发现，利用复合蛋白替代80%以上的鱼粉会使FE显著提高，大菱鲆配合饲料中利用动植物蛋白替代70%以上鱼粉时，会使FE大幅提高，均与本试验的研究结果有相似之处[20]。全替代组试验虾PER和PPV下降的原因可能是复合蛋白源的蛋白和氨基酸消化率低于鱼粉[21]。本试验条件下，复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾体组成、HSI和CF无显著影响，与动植物蛋白在海水鱼的研究结果一致[22-23]。3.2复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾血清生化指标的影响血清生化指标可以反映动物生理代谢健康情况[24]。本试验中，复合蛋白源完全替代鱼粉（M6组）会造成凡纳滨对虾血清AST、ALT活性以及ALB、CHO、TG含量显著升高；同时，血清AKP活性和TP含量显著降低。血清总CHO和TG的含量可以反映机体脂肪代谢的状况[25]。M6组凡纳滨对虾血清CHO和TG含量显著升高，可能是因为复合蛋白源替代鱼粉比例提高后，饲料中不饱和脂肪酸含量减少，影响了脂肪代谢酶活性[26]。有研究表明，水产动物中复合动植物蛋白替代鱼粉水平的升高，对动物肝胰腺造成了一定胁迫，导致ALT和AST大量游离到血液中[27]。血清总蛋白和白蛋白含量是衡量动物营养和健康的基本指标，其含量改变意味着鱼类处于营养不平衡、肝功能受到损害等[28]。有研究发现，饲料中添加复合植物蛋白会上调肝胰腺中促炎因子的表达。本试验结果表明，复合蛋白源替代鱼粉比例不宜高于80%，否则会对凡纳滨对虾健康产生负面影响。3.3复合蛋白源替代鱼粉对凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化指标和抗氨氮胁迫能力的影响生物体内存在由酶系统和非酶系统组成的抗氧化防御系统，其作用是缓解机体肝胰腺代谢异常产物产生的活性氧（ROS）对机体肝细胞产生的影响[29]。生物抗氧化酶系统主要包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等[30]。这些抗氧化酶相互依存，维持机体氧化与抗氧化系统的稳定[31]。本试验中，复合蛋白源替代100%的鱼粉会造成凡纳滨对虾肝胰腺GSH-Px和SOD活性显著降低，同时MDA含量显著升高。这与在虹鳟试验中观察到的现象一致[16]。有研究发现，饲料中添加20%黑水虻粉可以提高凡纳滨对虾抗氧化酶活性[24]，一定比例的脱脂黑水虻粉替代鱼粉，可使黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）[32]、花鲈（Pelteobagrus fulvidraco）[33]血清超氧化物歧化酶活性升高，当替代比例超过64%时，会显著降低花鲈血清过氧化氢酶活性。玉米蛋白粉替代鱼粉过多也会造成鲍鱼（Haliotis discus hannai）血清SOD、LZM、ACP和AKP活性下降[34]。本试验中，M5组试验虾肝胰腺LZM活性显著低于M3组，M6组ACP活性低于其他各组，说明复合蛋白源的替代鱼粉比例升高，会降低凡纳滨对虾的免疫力及抗氧化能力。这一结果也在氨氮胁迫试验中得到了验证，氨氮胁迫18 h后，M6组试验虾存活率显著降低。4结论本试验中，饲料中复合蛋白源（猪血球蛋白粉∶玉米蛋白粉∶酶解脱脂黑水虻粉=1.0∶1.0∶5.7）替代鱼粉的比例为60%时，能够改善凡纳滨对虾的生长性能；复合蛋白源替代鱼粉比例过高（超过80%）会降低凡纳滨对虾的饲料利用率、免疫力及抗应激能力。