锦鲤属于鲤科，为鲤鱼的变异杂交品种，是由于养殖环境的改变引起鲤鱼体色突变，再经过长时间的人工选育和杂交培育出来的。近年来，由细菌或病毒感染的疾病使锦鲤养殖业产生较为严重的经济损失。维氏气单胞菌又称维罗纳气单胞菌，是一种人畜及水生生物均可感染的病原菌，适宜生长温度为25~30 ℃，广泛分布在自然水体、泥土及水生生物体内，主要感染锦鲤和罗非鱼等淡水鱼类[1-2]。感染维氏气单胞菌的病鱼具有体表出血溃烂、肛门及腹部红肿、腹水、鳃发白等症状，严重时可致鱼类死亡，给养殖户带来巨大的经济损失[3-4]。中药柴胡，又名地熏、茈胡、山菜，是伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根，主要分布在我国东北、华北、湖北及四川等地区[5]。现代药理学研究表明，柴胡具有解热、镇静、镇痛、抗炎、抗菌、增强免疫力、抗抑郁及抗肿瘤等作用[6-7]。近年来，有关柴胡的研究大多数针对人和陆生动物进行，很少有关于其在水生动物中应用的研究。因此，本试验探究饲料中添加柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼生长、血清生理生化指标、肝脏抗氧化能力的影响，通过腹腔注射维氏气单胞菌，探索在锦鲤饲料中添加柴胡及其提取物对锦鲤抗维氏气单胞菌的影响，为柴胡及提取物在锦鲤养殖中的高效应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物锦鲤幼鱼购自隆锦养殖有限公司，养殖于天津农学院，置于71.4 cm × 42.8 cm × 50.2 cm的循环水箱中暂养，每缸内放40尾锦鲤幼鱼，每天饱食投喂，待鱼状态稳定后测量体长，称量体重。锦鲤幼鱼的平均体长为（10.5±0.5）cm，平均体重为（21.0±0.5）g，水温为（25±1）℃。1.1.2菌株维氏气单胞菌由天津农学院吕爱军教授惠赠，该菌株在发病鲤鱼内脏中分离，与维氏气单胞菌序列相似性达99.93%以上，-80 ℃保存。1.1.3试验饲料基础饲料为自拟配方的外加工膨化饲料，由天津市宝坻晨辉工厂提供。基础饲料组成及营养水平见表1。柴胡取自甘肃省甘南藏族自治州卓尼县，选用茎秆部。将基础饲料分为3组，每组5 000 g平铺在塑料上。使用小型颗粒粉碎机粉碎柴胡，过180 μm筛，取25 g柴胡粉末添加0.5%的海藻酸钠，使用70~80 ℃适量蒸馏水与5 000 g饲料搅拌均匀，阴凉处晾干，密封保存。采用大孔吸附树脂提取柴胡总皂苷[8]，经测定提取液中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D总含量为0.53%，符合《中国药典》（2020年版第一部）中柴胡的质控要求。将25 g柴胡粉末的醇提取液均匀喷洒在5 000 g基础饲料上，阴凉处晾干，密封保存。柴胡组与柴胡提取物组中的柴胡添加量均为5‰，对照组不添加任何药物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.010.T001表1基础饲料组成及营养水平（风干基础）原料组成含量营养水平合计100.00秘鲁鱼粉15.00粗蛋白39.99豆粕30.00粗脂肪12.12菜粕5.00粗灰分8.38虾壳粉5.00水分5.84面粉5.00细麸皮12.00DDGS10.00螺旋藻粉7.00磷酸二氢钙0.35预混料1.00植物油4.40胆碱0.25玉米5.00注：1.预混料购自天津市宝坻晨辉工厂。2.营养水平均为实测值。%1.2试验方法1.2.1试验设计选择体表无伤、健康、活泼的锦鲤360尾，初始体重为（21.0±0.5）g，初始体长为（10.5±0.5）cm，随机分为3组，每组3个重复，每个重复40尾。K组、C组、T组锦鲤分别饲喂基础饲料、基础饲料+5‰柴胡生粉、基础饲料+5‰柴胡提取物。试验期14 d。分别在0、7、14 d共采集3次样本。采样前锦鲤停食24 h，每组随机取15尾，第14 d测定体长、体重等生长指标。试验鱼经MS-222麻醉后，尾柄静脉采血4 ℃静置24 h，4 000 r/min离心10 min，取上清液，-80 ℃保存。取出锦鲤的肝脏放入冻存管，放入-80 ℃冰箱中保存。养殖结束后不再投喂，进行人工感染维氏气单胞菌试验，试验周期为96 h。分别于24、48、96 h采样，每次每组取10尾，取样步骤和方法与上述相同。1.2.2饲养管理养殖水箱采用高锰酸钾浸泡消毒，驯化7 d后开始试验。试验期间水温保持（25±1）℃，溶解氧3 mg/L以上。日投喂量为锦鲤体重的2%~3%，一天投喂2次，分别是9：00、16：00。试验期间每天排污并换水30%。1.2.3菌液制备吸取200 μL菌液于50 mL液体培养基中，将液体培养基置于摇床中，28 ℃、120 r/min培养12 h。取一定量的培养液于50 mL离心管，3 000 r/min离心10 min，去除上清液，使用0.85%的无菌生理盐水调整沉淀浓度。1.2.4攻毒预试验维氏气单胞菌对锦鲤幼鱼半致死剂量的测定方法参考文献[9]。随机选取60尾锦鲤幼鱼，将菌液分3组浓度梯度，分别为1×106、1×107、1×108 CFU/mL，每浓度组20尾。锦鲤幼鱼腹腔注射0.2 mL维氏气单胞菌液，每天观察记录死亡情况，试验持续1 w。攻毒12 h后锦鲤出现脱磷、腹部出血、尾鳍出血、鳃发白等症状，陆续死亡。1×106、1×107、1×108 CFU/mL维氏气单胞菌液的致死率分别为30%、45％和65%，1×107 CFU/mL接近半致死率。结果证明该菌具有致病性。1.2.5攻毒试验每组随机挑选60尾，将0.2 mL的1×107 CFU/mL菌液通过腹腔注射，统计24 h各组死亡数，计算保护率。于24、48、96 h对存活鱼进行采样工作。保护率=(对照组死亡率-试验组死亡率)/对照组死亡率×100%(1)1.3测定指标及方法1.3.1生长指标养殖14 d后，称重并记录数量，计算存活率（SR）、增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、饲料系数（FCR）和肥满度（CF）存活率=终末尾数/初始尾数×100%(2)增重率=(末重-初重)/初重×100%(3)特定生长率=(ln末重-ln初重)/试验天数×100%(4)饲料系数=总摄入饲料量/(末重-初重)(5)肥满度=末重/终末鱼体长3×100%(6)1.3.2生理生化指标蛋白（TP）、溶菌酶（LZM）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-13（IL-13）、免疫球蛋白M（IgM）指标均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。1.4数据统计与分析数据采用Statistica 17.0软件进行统计分析，经过单因素方差分析，LSD法进行组间差异显著性的多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼生长性能的影响（见表2）由表2可知，各组锦鲤幼鱼的生长性能均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.010.T002表2柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼生长性能的影响组别存活率/%增重率/%特定生长率/(%/d)饲料系数肥满度/%K组10016.13±1.510.69±0.093.07±0.232.78±0.24C组10015.52±1.450.67±0.063.16±0.313.05±0.31T组10016.68±1.630.72±0.073.59±0.432.86±0.132.2柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼血清和肝脏部分生理生化指标的影响（见表3、表4）由表3可知，C组和T组锦鲤幼鱼14 d时的血清LZM活性均显著高于0 d（P0.05），14 d时C组锦鲤幼鱼血清LZM活性显著高于K组（P0.05）；C组锦鲤幼鱼7 d时的血清AKP活性显著高于0 d（P0.05）。T组锦鲤幼鱼14 d时的血清AKP活性显著高于0 d（P0.05）。14 d时，C组、T组锦鲤幼鱼血清AKP活性显著高于K组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.010.T003表3柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼血清部分生理生化指标的影响项目组别0 d7 d14 dLZM/(mg/L)K组26.37±5.7633.23±13.6138.16±8.31BC组25.14±4.52b43.02±6.18ab63.56±6.67aAT组26.04±5.53b49.75±13.16ab52.64±8.70aABAKP/(金氏单位/100 mL)K组1.08±0.121.52±0.201.17±0.15BC组1.13±0.11b2.06±0.28a1.85±0.18abAT组1.09±0.12b1.40±0.14ab1.77±0.18aAACP/(金氏单位/100 mL)K组53.07±11.1261.31±8.2359.56±7.89C组51.07±11.5363.15±9.5365.45±8.78T组49.17±10.9757.56±10.4261.96±9.03AST/(U/L)K组10.38±1.3512.21±0.769.33±1.64C组12.38±1.1711.95±1.8610.85±2.04T组11.38±1.2213.36±1.739.57±1.13ALT/(U/L)K组21.75±5.1239.46±5.3711.76±5.85C组20.15±5.3834.84±11.8234.41±9.73T组22.75±4.5335.46±12.1319.35±9.85注：小写字母表示同行数据的差异显著性，大写字母表示同列数据的差异显著性，数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。由表4可知，C组、T组锦鲤幼鱼14 d时的肝脏LZM活性均显著高于0 d（P0.05）；14 d时，C组锦鲤幼鱼肝脏LZM活性显著高于K组（P0.05）。T组锦鲤幼鱼14 d时的肝脏AKP活性显著高于0 d（P0.05）；C组锦鲤幼鱼14 d时的肝脏ACP活性显著高于0 d（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.010.T004表4柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼肝脏部分生理生化指标的影响项目组别0 d7 d14 dLZM/(mg/L prot)K组1.59±0.142.00±0.161.97±0.26BC组1.71±0.26b2.55±0.29ab4.28±0.31aAT组1.63±0.21b2.65±0.93ab3.10±0.98aABAKP/(金氏单位/g prot)K组0.19±0.070.20±0.050.20±0.08C组0.26±0.080.39±0.110.56±0.18T组0.24±0.06b0.30±0.03ab0.63±0.12aACP/(金氏单位/g prot)K组2.37±0.192.35±0.623.03±0.50C组2.26±0.21b2.63±0.41ab4.13±0.44aT组2.35±0.243.60±0.773.35±0.30AST/(U/g prot)K组23.38±1.5227.76±2.6224.11±1.31C组22.96±1.6823.85±1.8821.54±2.33T组24.28±1.9326.85±2.2025.44±2.45ALT/(U/g prot)K组63.25±10.3755.59±5.6737.21±4.48C组52.42±8.3756.50±4.5535.39±11.26T组55.24±7.1353.47±12.8942.18±3.582.3柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼肝脏抗氧化指标的影响（见表5）由表5可知，C组锦鲤幼鱼14 d时的肝脏SOD活性和T-AOC显著高于0 d（P0.05）；T组锦鲤幼鱼14 d时肝脏CAT活性显著高于0 d（P0.05）；14 d时，C组锦鲤幼鱼的肝脏MDA含量低于0、7 d，显著低于T组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.010.T005表5柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼肝脏抗氧化指标的影响项目组别0 d7 d14 dSOD/(U/mg prot)K组1.19±0.531.33±0.411.32±0.16ABC组1.25±0.76b1.26±0.45b1.68±0.84aAT组1.24±0.651.32±0.951.47±0.57ABCAT/(U/mg prot)K组1.85±0.232.31±0.182.86±0.50C组2.04±0.312.23±0.352.29±0.26T组1.79±0.44b2.28±0.48ab3.41±0.53aT-AOC/(U/mg prot)K组1.22±0.341.12±0.131.31±0.20C组0.90±0.41b1.58±0.21ab1.74±0.18aT组0.94±0.351.37±0.121.63±0.15MDA/(μmol/g prot)K组6.21±0.258.69±0.276.50±0.54ABC组7.45±0.456.99±0.465.92±0.56BT组6.44±0.597.47±0.427.60±0.54A2.4锦鲤幼鱼维氏气单胞菌攻毒试验结果（见表6）由表6可知，攻毒12 h后，各组部分锦鲤开始出现脱磷、腹部出血、尾鳍出血、鳃发白等症状，陆续死亡，24 h内K组锦鲤的死亡率为41.7%；C组死亡率为18.3%，保护率为56%；T组死亡率为21.7%，保护率为48%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.010.T006表6锦鲤幼鱼维氏气单胞菌攻毒试验结果组别攻毒尾数死亡尾数死亡率（24 h）/%免疫保护率/%K组602541.7—C组601118.356T组601321.748注：“—”表示无相关数据。2.5柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼抗维氏气单胞菌感染的影响（见表7、表8）由表7可知，C组锦鲤幼鱼96 h的血清IL-4含量显著高于24 h（P0.05），T组锦鲤幼鱼48、96 h血清IL-4含量显著高于24 h（P0.05）；48 h时，T组锦鲤幼鱼的血清IL-4含量显著高于K组、C组（P0.05），96 h时，C组、T组锦鲤幼鱼的血清IL-4含量显著高于K组（P0.05）。C组锦鲤幼鱼48 h的血清IL-13含量显著高于24、96 h（P0.05）。C组锦鲤幼鱼48、96 h的血清IgM含量显著高于24 h（P0.05），T组48 h的IgM含量显著高于24 h（P0.05）；48 h时，T组锦鲤幼鱼的血清IgM含量显著高于K组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.010.T007表7柴胡及其提取物对攻毒后锦鲤幼鱼血清免疫指标的影响项目组别24 h48 h96 hIL-4/(ng/L)K组207.03±13.39230.02±15.33B224.78±15.21BC组197.08±16.16b247.61±17.31abB283.66±17.08aAT组212.72±10.97b287.02±17.24aA271.70±16.72aAIL-13/(ng/L)K组241.70±20.39219.14±25.21254.99±18.47C组226.53±16.70b283.38±16.79a221.94±26.05bT组214.95±26.96268.41±32.34266.01±28.25IgM/(μg/L)K组25.34±1.1326.71±0.92B28.17±1.62C组24.12±0.63b28.79±1.56aAB31.17±1.28aT组26.56±1.18b32.78±1.25aA30.39±1.96ab由表8可知，C组锦鲤幼鱼48 h的肝脏IL-4含量显著高于24 h（P0.05），T组锦鲤幼鱼48、96 h肝脏IL-4含量显著高于24 h（P0.05）；C组锦鲤幼鱼48 h的肝脏IL-13含量显著高于24 h（P0.05），48 h时，C组锦鲤幼鱼肝脏IL-13含量显著高于K组（P0.05）。C组锦鲤幼鱼48、96 h肝脏IgM含量显著高于24 h（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.010.T008表8柴胡及其提取物对攻毒后锦鲤幼鱼肝脏免疫指标的影响项目组别24 h48 h96 hIL-4K组219.77±22.63275.01±31.17299.36±34.33C组210.01±16.08b318.77±14.14a302.18±31.39abT组251.55±39.32b302.52±28.06a259.59±16.20aIL-13K组206.24±14.60262.42±13.44B282.34±10.23C组221.19±35.01b355.36±10.21aA300.64±10.62abT组242.23±34.10295.89±25.85AB289.38±20.82IgMK组27.51±1.6032.63±0.7931.46±1.41C组28.25±0.75b38.75±1.79a38.50±1.64aT组27.34±1.2233.79±1.7737.65±0.49ng/g prot3讨论3.1柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼生长指标的影响许多植物和植物提取物在水产养殖中具有促生长、抗应激、刺激食欲、免疫刺激和抗病原体等多种活性[10]。据报道，饲料中添加地黄可以提高鲤鱼生长性能，添加蒲公英提取物和山楂提取物对杂交石斑鱼的生长速度具有积极影响[11-12]。ZOU等[13]研究表明，饲料中添加柴胡提取物提高了石斑鱼的生长性能和饲料利用率，抑制了脂质积累，同时提高了机体免疫能力。本试验中，经过14 d的养殖，各组锦鲤幼鱼生长指标均有所提高，但差异不显著。该结果可能与试验周期较短有关，未来需要进一步研究。3.2柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼血清和肝脏免疫指标的影响非特异性免疫因子LZM常作用于外来病原菌，血清LZM活性与鱼类免疫能力有着紧密的联系。本研究结果显示，饲料中添加柴胡及其提取物能够提高锦鲤幼鱼血清LZM活性，在美国红鱼研究中也发现相似的结论[14]，柴胡及其提取物对在鱼类养殖中具有较好的抗菌作用。AKP和ACP是溶酶体的重要成分，在免疫中起到至关重要作用[15]。本试验中，与对照组相比，投喂柴胡及其提取物的锦鲤幼鱼血清AKP活性升高，与其他时间相比，7 d时C组锦鲤幼鱼血清AKP活性显著升高。与对照组相比，试验组锦鲤幼鱼血清ACP活性无显著差异，与马爱敏等[14]研究结果相似。柯浩等[16]研究表明，饲料中添加中草药5号配方（柴胡含量10%）可以提高幼鲍血淋巴的ACP活性，而饲料中添加中草药4号配方（柴胡含量10%）降低了幼鲍血淋巴的ACP活性，表明带有柴胡的方剂可调节杂色鲍幼鲍的免疫酶活力。本试验中锦鲤幼鱼血清ACP活性无显著性。原因可能是鱼类与贝类的免疫防御体系存在差异，也可能是因为不同中草药与柴胡配伍后的作用机理具有差异。本试验中，随着投喂天数增加，锦鲤幼鱼肝脏中的ACP、AKP、LZM活性逐渐升高；锦鲤幼鱼血清和肝脏中的AKP活性均呈上升趋势，但柴胡与柴胡提取物对锦鲤幼鱼血清和肝脏的作用效果不同；投喂柴胡对锦鲤幼鱼血清ACP活性无显著影响，对肝脏ACP活性有显著影响。这可能与柴胡的护肝作用有关。JIA等[17]研究表明，柴胡可以提高肝细胞的成活率，不同程度地抑制脂多糖/D-半乳糖胺（D-GalN/LPS）损伤引起的肝细胞培养上清液中干扰素-γ（INF-γ）、环氧化酶-2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）含量的升高，降低细胞内乳酸脱氢酶（LDH）、AST和ALT活性以及细胞凋亡率，对肝细胞结构具有明显的保护作用；同时显著抑制凋亡相关基因胱天蛋白酶3（caspase-3）、胱天蛋白酶9（caspase-9）、p53肿瘤抑制蛋白（P53）的上调，促进免疫相关基因Toll样受体3（TLR3）的上调。本试验中，与K组相比，锦鲤幼鱼14 d时C组肝脏LZM活性显著升高，与血清中LZM活性结果相同。柴胡及其提取物能够提高锦鲤幼鱼肝脏免疫能力，并具有一定的护肝作用。AST和ALT是反映肝细胞受损程度的重要指标。正常情况下，AST在心肌细胞中活性最高，其次为肝脏；ALT在肝脏中活性最高，血清中活性极低，其主要存在于肝细胞线粒体内，活性变化与肝细胞的变化密切相关[18]。本试验中，各组锦鲤幼鱼血清和肝脏中ALT、AST活性无显著差异，说明柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼肝脏无损伤。3.3柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼肝脏抗氧化功能的影响SOD、CAT等抗氧化酶构成抗氧化防御系统。在CAT的协同下，SOD能够清除体内多余的氧自由基。机体遭受逆境胁迫时产生大量的氧自由基，使膜脂质发生过氧化反应，产生MDA，过量的MDA积累会导致细胞膜的结构和功能发生改变[17]。MDA常用于评价脂质过氧化物程度[19]。本试验中，柴胡能够提高锦鲤幼鱼肝脏CAT和SOD活性，降低MDA含量，提高T-AOC。这说明柴胡可以增强锦鲤幼鱼的抗氧化能力。柴胡的有效成分包含多糖类、皂苷类、挥发油类和黄酮类等[20]。柴胡皂苷是中药柴胡的主要活性成分，包括原生苷、同环双烯类、异环双烯类、齐墩果酸型和△12齐墩果烷型等5种类型。柴胡皂苷具有强抗炎活性，体内研究结果显示，柴胡皂苷可以有效缓解炎症性疾病，降低促炎性细胞因子的表达。柴胡皂苷可以显著降低MDA含量，增强SOD和CAT的活性[21]。本试验中，投喂14 d锦鲤幼鱼的抗氧化能力比投喂7 d高。与柴胡提取物相比，柴胡生药提高锦鲤幼鱼抗氧化能力的效果更好。这可能是锦鲤幼鱼对柴胡提取液的吸收利用率比柴胡生药低，原因是柴胡生药中各种成分相互作用，比单一的皂苷对锦鲤幼鱼机体抗氧化能力的影响显著。3.4柴胡及其提取物对锦鲤幼鱼抗维氏气单胞菌感染的影响本试验中，对照组锦鲤幼鱼的死亡率为41.7%，接近半致死量；柴胡组的死亡率为18.3%，保护率达到56%；柴胡提取物组的死亡率为21.7%，保护率为48%。这说明饲料中添加柴胡及其提取物能够有效提高锦鲤幼鱼的抗维氏气单胞菌感染能力，且柴胡组效果更突出。杨天鸣等[22]发现，柴胡在机体体外、体内直接抑菌效果良好。白细胞介素是由单核-巨噬细胞、淋巴细胞等分泌的信使分子，参与免疫细胞的激活与调节、T细胞和B细胞的活化、增殖与分化及炎症反应等过程[23]。在免疫系统中，IL-4和IL-13触发Th2 T细胞分化、M2巨噬细胞极化、MHCⅡ表达、B细胞和浆细胞分化以及抗体同型转换等过程[24-26]。机体感染细菌后，会产生相关炎症反应，机体的免疫系统通过提升抗炎细胞含量抑制炎症的发生，进而保护自身。本试验中，人工感染维氏气单胞菌48 h时，各组锦鲤幼鱼血清、肝脏中的IL-4和IL-13含量均有升高，柴胡组效果更为突出。IgM是鱼类含量最高、分布最广的免疫球蛋白[27-29]，是适应性体液免疫中较早出现的抗体[30-31]。本试验中，锦鲤被维氏气单胞菌感染后，血清和肝脏中IgM含量呈增长趋势，柴胡组效果更为突出。根据以上结论可以推断，饲料添加柴胡及其提取物可以在一定程度上提高锦鲤幼鱼抗维氏气单胞菌感染能力，且柴胡生药的效果更加显著。4结论在饲料中添加5‰柴胡及其提取物养均可以提高锦鲤幼鱼的抗氧化能力，缓解肝功能损伤，进而提高锦鲤幼鱼机体的免疫能力，并且对维氏气单胞菌感染具有良好的抵抗作用，感染后48 h的抗菌效果较好。饲料中添加柴胡生药在提高锦鲤幼鱼生理生化指标、增强抗氧化及抗菌方面的效果更佳。