目前，采用组织工程技术对大面积骨缺损进行治疗与修复[1]，临床上采用植入自体骨、异体骨进行治疗，虽然这些材料取得了较好的治疗效果，但这些自体骨移植存在供体不足、异体骨移植免疫排斥、疾病传播等风险[1-2]。人工骨修复材料的兴起为解决骨缺损及骨源短缺的问题提供了新的研究思路。目前在临床上使用的人工骨修复材料包括磷酸钙陶瓷、硫酸钙骨水泥、聚甲基丙烯酸甲酯等，这些人工骨修复材料在不同的应用场景均取得了一定的修复效果[3-4]。但是，由于骨组织缺损的形状一般不规则，目前的骨缺损修复材料很难与骨缺损相匹配[5]。3D打印技术的发展为个性化定制骨缺损修复材料提供了新的机遇。Diao等[6]采用3D打印的方法制备了多孔β-TCP陶瓷，用于颅骨和胫骨缺损的修复并取得了较好的修复效果。Du等[7]制备了3D打印介孔生物活性玻璃/丝素蛋白复合支架，结果表明：支架具有高成骨能力和良好的力学性能。因此，3D打印技术与骨缺损修复材料的结合将能够改善骨缺损修复的效果。聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯）(P34HB)作为一种生物可降解材料已经广泛应用于骨缺损修复，并显示出可促进细胞的黏附和增殖[8-9]。但是，对于大段的骨缺损修复，其成骨活性还有待提高。目前有研究利用氧化石墨烯[10]、改性蒙脱石[11]对P34HB进行改性，结果表明：P34HB的促成骨性能得到提升。本实验采用与人体骨组织无机成分类似、具有良好促骨活性的掺锶羟基磷灰石(SrHA)[12]与P34HB进行复合，从而提高P34HB的力学性能和成骨活性。利用3D打印技术制备个性化的3D打印P34HB/SrHA复合人工骨支架，并探究了SrHA用量对支架的打印性能、体外降解性能和促成骨活性的影响，以期为P34HB/SrHA复合人工骨支架的临床应用提供参考。1实验部分1.1主要原料聚（3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯）(P34HB)，粉末状，珠海麦得发生物科技股份有限公司；掺锶纳米羟基磷灰石(SrHA)，粉末状，实验室制备；胎牛血清、DMEM培养基，美国Gibco公司；细胞增殖与毒性检测试剂盒，CCK-8、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司。1.2仪器与设备毛细管流变仪，RG20，德国GOTTFERT仪器公司；傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)，EQUINOX55、X射线衍射仪(XRD)，D8 Focus，德国Bruker公司；扫描电子显微镜(SEM)，XL-30ESEM，荷兰飞利浦公司；电子万能拉伸试验机，Kinexus Pro+，英国马尔文公司。1.3样品制备使用SolidWorks三维立体结构设计软件，构建一个有规整结构的三维圆柱体人工骨支架，支架的高度为3 mm，直径均为10 mm，然后将其分割成STL格式文件。将SrHA粉末与P34HB粉末按照不同的比例混合均匀，SrHA占P34HB的质量比分别为0、5%、10%和20%，制备的样品分别命名为P34HB、P34HB/5%SrHA、P34HB/10%SrHA、P34HB/20%SrHA。采用毛细管流变仪剪切速率46~2 304 s-1，测试温度140~155 ℃，测试不同比例P34HB/SrHA混合粉末的流变性能，确定3D打印所需条件。将不同比例的P34HB/SrHA混合粉末装入料桶内，利用生物3D打印机的熔融沉积成型(FDM)模式按照设计的人工骨支架结构进行打印，计算机控制其加热后的打印喷头进行打印，得到具有适合孔隙率、孔隙大小以及规整内部结构的3D打印P34HB/SrHA复合支架。1.4性能测试与表征FTIR测试：测试范围500~4 000 cm-1。XRD测试：管电压为40 kV，管电流为20 mA，扫描速率为2 (°)/min，扫描范围为10°~50°。SEM测试：对样品进行真空喷金处理，观察复合支架的结构。压缩性能测试：按GB/T 1040.2—2022进行测试，压缩速率20 mm/min。降解性能测试：以PBS溶液为降解介质，取4个干燥干净的50 mL离心管分别加入40 mL、pH值为7.4的PBS溶液，将P34HB/SrHA多孔支架分别浸没于PBS溶液，在37 ℃恒温振荡箱（振荡频率为160 r/min）中进行体外降解实验。在固定的时间点取出样品，用足量的去离子水进行冲洗，在60 ℃恒温真空干燥箱干燥24 h后称重并计算质量损失率。使用pH计测量取出支架后的PBS缓冲液的pH值。细胞增殖测定：将灭菌后的P34HB/SrHA复合支架放置在48孔培养板中，每组设置3个平行样，以2×105的密度接种细胞，当细胞在骨水泥片上培养1、4和7 d后，加入300 μL CCK-8工作液（10%CCK8原液，90%细胞培养液（含有10%FBS）），在细胞培养箱中孵育1 h，取100 μL上清液到96孔板中，利用酶标仪测定溶液在450 nm处的吸光度值（OD值）。细胞分化测定：将细胞与P34HB/SrHA复合支架进行共培养，分别为7 d和14 d后，将原培养液弃去，加入冷PBS溶液清洗3次，向孔板中加入0.1%的Triton X-100 pH值为7.4的细胞裂解液将细胞完全裂解（温度保持在4 ℃左右）。将溶液在冰浴中用细胞粉碎机粉碎1 min，静置后取上清液，然后利用ALP试剂盒测定P34HB/SrHA复合支架与细胞共培养之后的ALP活性。ALP活性为ALP活性与裂解液中总蛋白的量(mg)的比值，所得到的数值是归一化的。2结果与讨论2.1P34HB/SrHA复合材料的流变行为分析由于P34HB/SrHA复合材料是作为3D打印原料使用的，其流变学性能对3D打印参数的设定具有参考价值。图1为SrHA含量对P34HB/SrHA复合材料表观黏度的影响。从图1可以看出，P34HB/SrHA复合材料的表观黏度随着剪切速率的增加而逐渐下降，说明P34HB/SrHA复合材料属于剪切变稀流体，因此在3D打印的过程中需要设置适宜的打印速度[13]。当剪切速率相同时，P34HB/SrHA复合材料的表观黏度随着SrHA含量的增加而逐渐减小，这是因为P34HB分子间分子链之间相互缠绕，具有较强的分子间作用力，分子链在剪切力的作用下取向较为困难，因此表观黏度也较大；然而，加入SrHA后，SrHA颗粒在P34HB中起“润滑剂”的作用，从而减弱了P34HB的分子间作用力，使得P34HB分子链在剪切力作用下更容易取向，进而P34HB/SrHA复合材料的表观黏度下降[14-15]。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F001图1SrHA含量对P34HB/SrHA复合材料表观黏度的影响Fig.1Effect of SrHA content on the apparent viscosity of P34HB/SrHA composites本实验采用生物3D打印机的FDM模式对P34HB/SrHA复合材料进行3D打印，打印温度是影响FDM打印的因素之一。图2为温度对P34HB/SrHA复合材料的表观黏度的影响。从图2可以看出，P34HB/SrHA复合材料的表观黏度随着温度升高逐渐降低，说明复合材料对温度具有敏感性。这是因为温度越高，分子的热运动越剧烈，分子链间缠结点在分子热运动的作用下逐渐解缠结，相应地分子间作用力减弱和分子内的自由体积增加，因此表观黏度下降[16]。P34HB/SrHA复合材料在3D打印过程中可以通过调节温度，从而调节材料的打印性能。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F002图2温度对P34HB/SrHA复合材料的表观黏度的影响Fig.2Effect of temperature on the apparent viscosity of P34HB/SrHA composites2.2P34HB/SrHA复合支架的形貌图3为不同SrHA含量下P34HB/SrHA人工骨支架的结构。从图3可以看出，纯P34HB支架在打印过程中有少许塌陷，这可能是由于纯P34HB在打印的过程中发生收缩。而P34HB/SrHA复合支架均具有规则的外观，且外表面平滑而且没有裂纹，说明SrHA能够改善P34HB材料的打印性能。此外，不同比例下P34HB/SrHA复合支架均获得较规整的内部孔隙结构，且支架孔隙之间有较好的连通性。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F003图3不同SrHA含量下P34HB/SrHA人工骨支架的结构Fig.3Structure of P34HB/SrHA artificial bone scaffolds with different SrHA content图4为不同SrHA含量下P34HB/SrHA复合支架的SEM照片。图4不同SrHA含量下P34HB/SrHA复合支架的SEM照片Fig.4SEM images of P34HB/SrHA composite scaffold with different SrHA content10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F4a110.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F4a210.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F4a310.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F4a4从图4可以看出，不同SrHA用量下P34HB/SrHA复合支架的表面结构均较为均匀，丝的直径均约为400 μm，且未出现断丝现象，这说明打印温度等打印条件的选择较适宜。此外，SrHA在P34HB基体中能够均匀分散，并未出现相分离现象，说明二者之间具有较好的相容性。但当SrHA用量为20%时，P34HB/SrHA复合支架的表面出现了少许小的团聚颗粒，这可能是由于SrHA粒子具有较高的表面能，当SrHA在P34HB体系中添加量较高时，SrHA粒子之间容易团聚从而形成较大颗粒。2.3P34HB/SrHA复合支架的FTIR分析图5为不同SrHA含量下P34HB/SrHA复合材料支架的FTIR谱图。P34HB/SrHA复合材料中SrHA的化学式为Ca10(PO4)6(OH)2，含有羟基—OH和PO43-。从图5可以看出，3 390 cm-1处为—OH（分子内缔合）的伸缩振动峰，1 080 cm-1处为PO43-的伸缩振动峰，584 cm-1处为PO43-中P—O键的弯曲振动峰[17]。P34HB中1 710 cm-1处为C=O（酯）的伸缩振动峰，868 cm-1处为C—O—C对称伸缩振动峰，1 450 cm-1、1 410 cm-1处的两个峰为—CH3的伸缩振动峰[11]。FTIR谱图中的峰与P34HB和SrHA中的基团相对应，且并未产生新峰，说明二者之间只是简单的物理混合过程，在3D打印的过程中并未产生化学反应。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F005图5不同SrHA含量下P34HB/SrHA复合支架的FTIR谱图Fig.5FTIR spectra of P34HB/SrHA composite scaffolds with different SrHA content2.4P34HB/SrHA复合支架的XRD分析图6为不同SrHA含量下P34HB/SrHA复合材料所对应的XRD谱图。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F006图6不同SrHA含量下P34HB/SrHA复合材料的XRD谱图Fig.6XRD patterns of P34HB/SrHA composites with different SrHA content从图6可以看出，2θ为17.5°为P34HB的主要特征衍射峰，当SrHA的含量不断增大时，P34HB衍射峰的位置和强度基本未变化，这说明P34HB属于弱结晶性的高分子。SrHA在25.9°、32.06°、33°处分别出现典型的衍射峰，分别对应HA的(002)、(211)、(300)晶面，说明本实验制备的SrHA与HA的晶型结构一致[18]。此外，P34HB/SrHA复合材料中32.06°和33°的衍射峰强度随着SrHA含量的增加而增强，也说明了SrHA在共混过程中其晶体结构没有被破坏。2.5P34HB/SrHA复合材料的体外降解性能材料的降解速率以及降解产物所形成的环境对于骨缺损的修复至关重要，图7为不同SrHA含量下P34HB/SrHA复合材料的体外降解性能。图7不同SrHA含量下P34HB/SrHA复合材料的体外降解性能Fig.7In vitro degradation performance of P34HB/SrHA composites with different SrHA content10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F7a1（a）质量损失10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F7a2（b）pH值从图7a可以看出，4种不同SrHA含量的P34HB/SrHA复合支架的质量均随着降解时间的延长而逐渐降低，添加了SrHA的P34HB/SrHA复合支架降解率相对较快，且降解率与SrHA的含量成正比。这主要是由于SrHA均匀分散在P34HB基体中，SrHA在PBS中主要依靠溶解的方式进行降解，与P34HB相比降解更快，因此SrHA含量较多时，复合材料质量下降更快。从图7b可以看出，纯P34HB的pH值在整个降解周期内逐渐下降，主要是由于P34HB在降解的过程中产生少量的酸性物质。然而，加入SrHA后的P34HB/SrHA复合支架在降解过程中的pH值并没有较大波动，pH值均保持在7.4±0.1。这可能是SrHA呈弱碱性，其降解产物能够中和P34HB所产生的酸性产物，从而起稳定pH值的作用。由于人体的pH值在7.4左右，因此材料的降解所产生的pH值微环境与人体pH值越接近，说明材料具有良好的生物相容性，这可以避免引起机体的免疫排斥以及诱发炎症，促进骨缺损的快速修复。2.6P34HB/SrHA复合支架的压缩强度图8为不同SrHA含量下P34HB/SrHA复合支架的压缩强度。从图8可以看出，P34HB/SrHA多孔复合支架的压缩强度随着SrHA含量的增加而逐渐增加。这主要是因为SrHA具有较高的强度，SrHA与P34HB进行复合时能够起增强的作用，在复合材料受到压缩应力的作用时SrHA还能够起到传递和分散应力的作用。随着SrHA含量的增加，复合材料的压缩强度不断增强。当SrHA含量为20%时，P34HB/SrHA复合支架的压缩强度与P34HB支架相比增加了83.1%，力学性能得到显著提升。但是，SrHA并不能无限对P34HB进行增强，SrHA含量分别为10%和20%时，二者的强度相差不大。这主要是由于当SrHA含量超过一定值时，SrHA在P34HB基体中发生团聚，分散性减弱，实际上能起到增强作用的SrHA纳米粒子减少，因此P34HB/SrHA复合支架的压缩强度增加的趋势减弱。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F008图8不同SrHA含量的P34HB/SrHA复合支架的压缩强度Fig.8Compressive strength of P34HB/SrHA composite scaffolds with different SrHA content2.7P34HB/SrHA复合支架的成骨活性成骨细胞的增殖对于骨缺损修复至关重要，缺损处成骨细胞数量直接影响骨缺损的修复速率。图9为MC3T3-E1细胞与P34HB/SrHA复合支架共培养后增殖情况。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F009图9MC3T3-E1细胞与P34HB/SrHA复合支架共培养后增殖情况Fig.9Proliferation of MC3T3-E1 cells and P34HB/SrHA composite scaffold after co-culture从图9可以看出，将材料与细胞共培养1 d时，P34HB/SrHA组与P34HB组之间的增殖情况无显著性差异，这也说明了P34HB/SrHA对于成骨细胞无细胞毒性。培养4 d和7 d时，P34HB/SrHA复合支架与纯P34HB组之间的增殖出现了显著差异，其细胞增殖明显增多，细胞的增殖能力增强，说明Sr2+对于成骨细胞的增殖起促进作用[19]。此外，SrHA的含量越多，P34HB/SrHA复合支架对细胞增殖的促进作用越强，这是由于SrHA在P34HB中能够缓慢降解并释放出Sr2+，进而起到促进细胞增殖的作用；同时，Sr2+的缓慢释放还避免了培养液中的含量过高导致的抑制细胞增殖的可能性[20]。为了测定与不同SrHA含量的P34HB/SrHA复合支架共同培养之后的成骨分化能力，本实验对细胞的ALP活性进行测定。图10为MC3T3-E1细胞与支架共培养后的ALP活性定量结果。从图10可以看出，培养时间为7 d时，P34HB/SrHA复合支架与纯P34HB组相比ALP活性有所增加，且均具有显著性的差异，说明SrHA与P34HB的复合能够提高P34HB的ALP活性。共培养14 d后，P34HB/SrHA复合支架与纯P34HB组同样具有显著性的差异，SrHA用量为20%时，ALP活性明显比其他组高。这可能是由于Sr2+能够通过激活Wnt/β-catenin通路，诱导细胞中β-catenin蛋白的表达，诱导其向成骨细胞分化[21-23]。结果表明，P34HB/SrHA复合支架具有良好的成骨诱导活性，从而有益于促进骨缺损的快速修复。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.12.007.F010图10MC3T3-E1细胞与支架共培养后的ALP活性定量结果Fig.10Quantitative results of ALP activity of MC3T3-E1 cells and scaffolds co-cultured3结论（1）P34HB/SrHA复合材料的表观黏度分别随着温度、剪切速率和SrHA含量提高而逐渐降低，SrHA的增加改善了P34HB的可打印性能。3D打印P34HB/SrHA复合材料均具有规则的外观和较规整的内部孔隙结构，且支架孔隙之间有较好的连通性。（2）FTIR结果表明，P34HB/SrHA复合材料在打印过程中保持了二者本身的性质，未发生化学反应。XRD谱图中分别出现了P34HB和SrHA的特征衍射峰，且SrHA的衍射峰的强度与SrHA的掺入量成正比。力学测试结果表明，SrHA显著增加了P34HB的力学性能，起增强作用。（3）体外降解结果表明，P34HB/SrHA复合支架的质量均随着降解时间的延长而逐渐降低，且降解率与SrHA的含量成正比，同时SrHA在降解的过程中起到维持pH值稳定的作用。（4）SrHA与P34HB复合后显著提高了P34HB的体外细胞相容性，与P34HB相比，P34HB/SrHA能够明显促进细胞的增殖活性，并上调了细胞的成骨相关蛋白ALP的表达，具备较好的成骨诱导活性，有益于促进骨缺损快速修复。