肠道不仅是营养物质消化吸收的器官，还是动物体与外界接触面积最大的器官，承担与外界的屏障功能。动物肠道中存在大量微生物，肠道上皮与肠道菌群组成的微环境影响了动物体的消化吸收和免疫调节等生理生化过程[1]。目前，犬猫食品常用的肠道调理产品是益生菌、益生元以及二者的混合（合生元）产品[2]。益生菌、益生元和合生元的补充已被证实具有一定的肠道调理作用[3]。但犬猫食品主要为膨化干粮，需经过高温膨化这一过程[4]，高温导致益生菌类难以存活，使益生菌的应用受到一定限制。后生元是对宿主健康有益的灭活微生物或菌体成分，也包含其代谢物，是灭活的菌体成分，不受高温的影响。同时，一些后生元成分被证实具有平衡肠道菌群，增强肠道上皮屏障功能，增强免疫调节和促进新陈代谢等多种功效[5]，备受宠物食品生产商的重视。但目前关于后生元在犬猫中应用的研究报道还较少。因此，本研究比较了12只笼养比格犬在采食含后生元犬粮前后粪便特性、血清生化指标及肠道菌群的变化，分析添加后生元对犬健康的影响，以期为后生元在宠物食品中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料本研究所采用的基础日粮及后生元日粮均由上海爪福宠物用品有限公司提供。基础日粮主要原料为鲜鸡肉、鸡肉粉、红薯粉、木薯粉、鸡肝、奶酪粉、马铃薯粉、鱼油、复合维生素和矿物质等，其营养水平见表1。基础日粮中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、总钙和总磷分别依照GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006、GB/T 6434—2022、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2018及GB/T 6437—2018测定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.T001表1基础日粮营养水平项目粗蛋白粗纤维粗脂肪粗灰分钙总磷含量36.107.0415.127.761.120.95注：营养水平为实测值。%后生元原料由上海创百生物科技有限公司提供，后生元日粮中含灭活植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum L-137）8.0×109 CFU/kg，实际日粮按0.05%添加。1.2试验设计本试验在上海交大实验实习场进行，试验方案得到上海交大实验实习场动物伦理委员会批准。12只比格犬均单独饲养于2 m×1.5 m×4 m笼中，犬舍在试验期间保持（25.0±3.0）℃，每日9：00和16：00各喂食1次，每次喂食约100 g日粮，充足饮水，每日9：00清扫犬舍。试验前比格犬根据体重和性别一致的原则，随机分成两组（A组和B组），每组6只，每只为1个重复。采用常规全价粮在适应性喂养1周后开始试验，试验期共5周。前两周A组给予犬200 g/d基础日粮C，B组给予犬200 g/d后生元添加日粮P；在试验第14 d时进行第1次采样，收集血样及粪便样品；15~21 d为恢复期，所有比格犬均喂食适应期饲喂的常规全价日粮，从第22 d开始，交换两组比格犬的饲喂日粮，即A组饲喂含后生元的日粮P，B组更换为基础日粮C。饲喂2周后（第35 d），进行第2次采样，收集血样及粪便样品，动物试验设计见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.F001图1动物试验设计1.3测定指标及方法1.3.1样品采集所有试验犬均在试验开始前和结束后由执业医师进行采血。血样经前肢静脉采集，4 ℃冰箱放置过夜后，于4 ℃、3 500 r/min离心15 min后吸取上清，分装2~3管后，-20 ℃保存。粪样使用无菌一次性肛拭子经肛门内采集。1.3.2采食量、精神状态及体重试验期间观察试验犬精神状态。于试验一期开始、试验一期结束（14 d）、试验二期开始（21 d）、试验二期结束（35 d）时测定体重，计算采食不同日粮时比格犬体重增长率；并在12~14、33~35 d测定采食量，并计算采食率。体重增长率=(末重-初重)/初重×100%(1)采食率=(饲喂量-剩余量)/饲喂量×100%(2)1.3.3粪便评分粪便评分依照文献[6]推荐的方式进行，即坚硬、干燥或小石头样的粪便记1分；成型、干结，但软硬适度的粪便记2分；柔软、成型及润湿条状的粪便记3分；柔软不成形的粪便记4分；水状粪便记5分。1.3.4血清指标血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）的含量及谷丙转氨酶（ALT）活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测。血清二胺氧化酶（DAO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）及白细胞介素-6（IL-6）含量采用ELISA法检测，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。血清D-乳酸（D-LA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）及免疫球蛋白M（IgM）含量采用上海科顺生物有限公司生产的ELISA试剂盒检测。1.3.5粪便菌群高通量测序粪便拭子于-20 ℃保存，送至广东美格基因科技有限公司进行DNA提取和菌群多样性分析。分析采用Illumina MiSeq平台进行，采用通用引物（F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）扩增，用细菌V3-V4区的469 bp片段。1.4数据统计与分析采用Excel软件整理数据，SPSS 18.0软件进行统计分析，采用配对样本T-test进行差异比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1补充后生元对犬采食量、精神状态及体重的影响（见表2）试验期间所有犬精神状态良好，无明显精神萎靡、暴躁等情绪产生，均采食完所提供的日粮。由表2可知，两组犬体重增长率、采食率差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.T002表2补充后生元对犬采食量及体重的影响项目体重增长率采食率P值0.0700.133基础日粮组0.83±0.5798.53±0.00后生元日粮组0.76±0.6599.51±0.00%2.2补充后生元对犬粪便评分的影响（见图2）由图2可知，采食基础日粮犬的平均粪便评分为2.97±0.01；采食添加了后生元的日粮后，平均粪便评分为2.54±0.01，极显著低于采食基础日粮（P0.01）。日粮中后生元补充能够降低犬的粪便评分，使其硬度更为理想。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.F002图2补充后生元对犬粪便评分的影响2.3补充后生元对犬血清生化指标的影响（见表3）由表3可知，与采食基础日粮相比，采食添加了后生元的犬血清TG含量下降了51.16%（P0.05），TC含量下降了29.92%（P0.05）；同时，采食添加了后生元的犬血清UA含量显著下降（P0.05）。后生元补充对犬其余常规血清生化指标无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.T003表3补充后生元对犬血清生化指标的影响项目基础日粮组后生元日粮组P值TP/(g/L)55.86±1.1059.35±2.350.087ALB/(g/L)34.85±1.0735.65±2.190.706GLB/(g/L)21.01±1.3921.70±2.640.107A/G1.66±0.141.64±0.200.812TG/(mmol/L)0.86±0.120.42±0.030.008TC/(mmol/L)3.71±0.322.60±0.350.004HDL-C/(mmol/L)6.43±0.526.17±0.480.581UA/(μmol/L)2.10±0.131.86±0.140.033BUN/(mmol/L)3.96±0.473.05±0.620.325CREA/(μmol/L)72.08±5.7561.45±5.760.249ALT/(U/L)5.51±0.785.81±0.880.5862.4补充后生元对犬血清免疫指标的影响（见表4）由表4可知，与采食基础日粮相比，采食后生元补充日粮的比格犬血清IgG、IgM、TNF-α及IL-1含量分别降低了7.85%、1.71%、23.97%、29.54%（P0.05），表明后生元具有抑制犬炎症发生的作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.T004表4补充后生元对犬血清免疫指标的影响项目IgG/(mg/L)IgA/(mg/L)IgM/(mg/L)TNF-α/(ng/L)IL-1/(ng/L)IL-6/(ng/L)P值0.0170.1290.0420.0150.0300.653基础日粮组1 605±64231.9±3.4752.5±6.798.14±12.4010.19±1.1781.42±8.94后生元日粮组1 479±59225.6±3.7739.6±6.274.62±7.267.18±0.4885.94±7.772.5补充后生元对犬肠道屏障完整性相关指标的影响（见表5）肠道屏障完整性破坏是引发动物腹泻、炎性肠病的主要因素之一。DAO是动物小肠黏膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，肠道屏障损伤时进入血液引起血清DAO含量升高[7]。D-LA是细菌代谢产物，当肠道屏障损伤时，肠道中细菌产生的大量D-LA通过受损的肠道黏膜进入血液，使血清D-LA水平升高[8]。由表5可知，比格犬采食添加后生元的日粮后，血清D-LA含量下降（P=0.051），提示日粮中补充后生元具有改善比格犬肠道屏障完整性的潜力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.T005表5补充后生元对犬血清肠道屏障完整性相关指标的影响项目DAO/(mg/L)D-LA/(ng/L)P值0.2940.051基础日粮组32.54±2.1214.87±0.55后生元日粮组29.00±2.9914.27±0.622.6补充后生元对犬粪便菌群的影响2.6.1补充后生元对犬粪便菌群α-多样性的影响（见表6）α-多样性是指局域均匀生境下的物种的多样性程度。Chao1指数表示了样本中物种丰富度，Simpson指数和Shannon指数均是反映物种多样性的参数，数值越大表示多样性程度越高。由表6可知，添加后生元显著降低了犬粪便菌群的Chao1指数（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.T006表6补充后生元对犬粪便菌群α-多样性的影响项目Chao1指数Simpson指数Shannon指数P值0.0450.2120.080基础日粮组575.65±59.270.12±0.0533.02±0.45后生元日粮组509.71±71.390.14±0.0462.74±0.382.6.2补充后生元对犬粪便中部分菌群相对丰度的影响（见图3）由图3可知，采食基础日粮的犬粪便中优势属为普雷沃氏菌（Prevotellaceae）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、阴性丹毒菌（Negativicutes）及月形单孢菌（Selenomonadales）等，采食后生元添加中优势属为杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、乳酸杆菌科（Lactobqcilllaceae）及乳酸菌属（Lactobacillus）等。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.F003图3犬粪便菌群的线性回归分析（LDA）进一步在门和属水平上对丰度前15分类群绘制相对丰度分布图（见图4）。图4犬粪便菌群的线性回归分析（前15分类群）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.F4a1（a）门水平上相对丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.024.F4a2（b）属水平上相对丰度由图4（a）可知，在门水平上，添加后生元后，犬肠道菌群结构差异不明显，均以厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和ε变形菌门（Epsilonbacteraeota）为主。由图4（b）可知，在属水平上，添加后生元前后群落结构差异较大。3讨论2012年，Tsilingiri等提出后生元一词，并于2021年国际益生菌与益生元协会正式定义为“对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分制剂”[9]。无论是膨化宠物食品还是罐头均需经过严格的高温杀菌过程，传统益生菌无法在这一生产工艺下存活，添加活菌失去其原有意义。后生元类产品已被证实具有促进健康的作用[10]，且因其由无生命成分组成，宠物食品生产所需的高温加工工艺对其无影响，适合在宠物食品中添加使用。3.1日粮中补充后生元对犬体重和健康的影响宠物的采食量、精神状态、毛发情况、体重、粪便形态是最容易被宠主感知的指标。本研究表明，后生元添加未影响宠物犬的采食量、精神状态和体重，采食量无变化提示后生元添加对日粮的适口性未产生明显影响；精神状况无变化初步表明后生元中不含严重致病成分。有研究表明，断奶仔猪中添加嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）后生元能够提高断奶仔猪的体重[11-12]，但其作用机制可能与后生元缓解了仔猪腹泻有关。而SUKEGAWA等[13]研究显示，灭活的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）可促进断奶仔猪机体对营养元素的吸收效果，降低腹泻率，提高仔猪的生长性能。徐大海等[14]研究发现，日粮添加750 g/t后生元对1~3周龄肉鸡体重和平均日增重无显著影响，但对肉鸡的肠道发育和养分表观代谢率具有较好的改善作用。本研究中，采食基础日粮的犬本身无腹泻等情况发生，体重亦无显著变化。目前后生元在宠物粮中的应用研究较少，其适宜的添加量也不明确，这在一定程度上影响其在实际生产中的应用及作用效果。LOH等[15]研究发现，当植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）液体代谢物添加量为0.5%时，可以显著提高断奶仔猪的生长性能，添加量为0.1%的效果并不明显，添加量为0.3%时效果居中。吴飞等[12]研究发现，无抗日粮中添加嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）可促进断奶仔猪的生长，0.9%后生元可以显著提高断奶仔猪的平均日增重，添加0.6%后生元还能够调节仔猪肠道菌群结构。肥胖已成为犬猫的一大安全隐患[16]。CHELAKKOT等[17]发现，细胞外囊泡有助于控制体质量增加，提高葡萄糖耐量。LEE等[18]发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum L-14）提取物可用于预防和治疗肥胖和代谢紊乱，定期口服提取物能够抑制脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞的分化，控制小鼠体重增加和脂质分布。本研究表明，添加后生元不会引起犬肥胖问题；同时，体重无变化提示添加后生元未对犬粮的消化率造成显著影响。3.2日粮中补充后生元对犬粪便特性的影响2~3分的粪便评分通常被认为是较为理想的粪便状态[6]。本研究中，在采食对照日粮期间，犬粪便评分为2.97，较接近理想状态的上限；而采食添加后生元的日粮期间，犬的粪便评分为2.54，更接近理想状态的平均值。同时，宠物主人为了清洁方便，也更倾向较为干燥的粪便。因此，本研究表明，后生元的添加改善了犬的粪便特性。对其他动物的研究也得到了相似结论，如添加后生元能够降低断奶仔猪的腹泻率[11]。3.3日粮中补充后生元对犬血脂和蛋白质代谢的影响血清生化指标能够在一定程度上反映动物的健康情况。本研究提示，采食后生元日粮期间，犬血清TC和TG含量均显著下降，提示后生元具有调节犬血脂的作用。本研究中加入的后生元是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum L.）制品，这与YE等[19]发现植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum L.）的后生元制品具有保护肝脏和脂代谢调节作用一致。李月[20]的试验也证实了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum L.）具有血脂调节作用。同时，本研究结果显示，补充后生元显著降低了犬血清BUN含量，提示植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum L.）能够提升犬机体蛋白质代谢能力。3.4日粮中补充后生元对犬肠道上皮屏障的影响研究表明，后生元能够增强肠道上皮屏障功能和免疫功能[5]。IgG是体液免疫的主要参与者，具有调理吞噬细胞、中和毒素等功能，在炎症反应发生时数量增加。炎性肠病发生时，血清IgG含量升高，当疾病缓解和恢复后，血清IgG含量下降，血清IgG含量与肠道双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳酸菌（Lactobacillus）等益生菌丰度呈负相关[21]。IgA主要存在于黏膜中，如鼻腔、肠道，血清中也存在一定量的IgA，但犬血清IgA含量不能反映黏膜IgA水平[22]。IgM是初次免疫应答反应中最早出现的抗体。TNF-α和IL-1均为促炎性细胞因子，可诱导组织细胞的炎性反应。本研究中，采食后生元添加日粮期间，比格犬血清IgG、TNF-α和IL-1含量显著降低。由此可以推测，后生元通过抑制TNF-α和IL-1分泌，降低了炎症反应，与IZUDDIN等[23]在断奶羔羊中的试验中得到的机制相同。同时，IZUDDIN等[23]还发现，添加植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum L.）制备的后生元产品能够上调肠道紧密连接蛋白表达，这解释了本研究中添加植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum L.）后生元降低血清中D-LA含量、保护肠道上皮屏障的机制。3.5日粮中补充后生元对犬肠道菌群结构的影响后生元中含有多种抗菌成分，可调节动物肠道微生物群，改善肠黏膜屏障完整性，进而维持动物肠道健康，提高动物生长性能[24]。大量研究表明，后生元的脂质代谢调节、免疫调节均与其能够调节肠道菌群相关[10,19,21]。日粮添加后生元可增加盲肠中的非致病菌群，并减少热应激肉鸡的肠杆菌科菌群和大肠杆菌群的数量[25]。本研究结果提示，添加后生元可增加犬粪便中乳杆菌属（Lactobacillus）和芽孢杆菌（Bacillus）的含量。乳杆菌属（Lactobacillus）益生菌能够抑制动物肠道病原菌生长，维持肠道菌群平衡，刺激和调节机体免疫应答，减少疾病发生[26]。肠上皮屏障是一道物理屏障，其结构的完整性和功能的正常发挥是抵抗外界物质入侵肠道以及维持肠道稳态的重要前提。研究表明，多种乳杆菌能够加强肠上皮屏障功能，保护肠上皮屏障免受外来不利因素的损伤[27]；同时，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum L.）还能够抑制大肠杆菌等有害菌群的繁殖[28]，建立优势菌群，这与本研究发现补充后生元后比格犬粪便菌群多样性降低一致。芽孢杆菌属的代表枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有提高机体免疫力和抗氧化能力的作用[29]。盛宣博[30]研究表明，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可对产肠毒素大肠杆菌（ETEC）攻毒仔兔产生较好的肠道保护效果。杨敏敏[31]研究发现，日粮中添加枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可缓解脂多糖应激条件下肉仔鸡生长性能的下降，提高血清抗氧化性能，降低组织中促炎细胞因子的含量，改善肠道屏障功能，促进小肠生长发育，进而提高养分载体转运水平。添加后生元后可显著减少梭杆菌属（Fusobacterium）和厌氧螺菌属（Anaerobiospirillum）的含量。梭菌属广泛分布在环境中，可产生外毒素，部分种类对动物有毒。具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）是一种条件致病菌，能够破坏肠道上皮屏障，损伤细胞DNA，影响肿瘤相关microRNAs的表达和促进肿瘤细胞转移[32-33]。厌氧螺菌属可引起动物的腹泻。本次试验结果提示，后生元通过调整肠道菌群结构起到了促进比格犬健康的作用。4结论本研究表明，日粮中补充后生元（植物乳杆菌）能够提高犬粪便质量，调节脂肪代谢，增强肠道屏障功能，提高机体抗炎功能，提示日粮中补充一定量的后生元能够改善犬的肠道健康。