滩羊舍饲养殖后,日运动量下降,饲粮品种丰富度降低,且饲喂量较高,使育肥期滩羊胴体脂肪过度沉积、免疫力下降[1]。动物消化吸收营养物质的主要器官是小肠,小肠中的细菌、真菌等可将饲料中的大颗粒营养物质转化为动物可直接或间接吸收的小分子营养物质[2],从而改变动物肉品质[3]。有氧运动可以调节动物肠道菌群结构和丰度。大鼠进行8周自由轮转运动可以增加肠道普氏栖粪杆菌、双歧杆菌属、乳杆菌属等菌群含量,普氏栖粪杆菌产生的丁酸可调节核因子κB(NF-κB)活化、氧化应激及肠道免疫并可向周围环境分泌抗炎物质,抑制机体炎症发展[4]。肠道乳酸杆菌、双歧杆菌及鼠李糖乳杆菌等有益菌可以纠正HPA轴的过度激活,避免动物机体内环境紊乱[5]。乳杆菌可以促进食物消化吸收,抑制肠道中产气荚膜梭菌的生长[6]。有氧运动可以增加肠道菌群多样性,下调肠内炎性因子水平,改善血脂代谢[7]。本试验利用16S rRNA测序技术研究规律的有氧运动对育肥期滩羊小肠不同部位微生物丰度的影响,为舍饲条件下滩羊的健康养殖提供参考。1材料与方法1.1试验设计试验选取滩羊母羔羊60只,随机分为3组,每组20个重复,每个重复1只羊。试验1组滩羊除每日在圈舍内自由活动外,沿生态牧场运动跑道有氧运动行走8~10 km;试验2组滩羊除每日在圈舍内自由活动外,沿生态牧场运动跑道有氧运动行走4~6 km;对照组滩羊母羔羊每日只在圈舍内自由活动。各组试验羊佩戴北斗定位器,记录每日运动轨迹及行走路程,试验期130 d。试验期内各组试验羊日粮饲喂量及营养成分完全一致。1.2测定指标及方法1.2.1生长性能在试验开始和结束当天对育肥羊进行个体空腹称重。每日记录各组育肥羊采食量。采食量=投喂饲料量-食槽剩余饲料量(1)平均日增重=(末重-初重)/试验天数(2)平均日采食量=每只羊总采食量/试验天数(3)料重比=平均日采食量/平均日增重(4)1.2.2肠道菌群试验结束后,各组随机选取5只育肥羊屠宰,并在30 min内分别取5 mL育肥羊十二指肠、空肠和回肠内食糜,装于10 mL冻存管中,投入液氮中速冻,于-80 ℃超低温冰箱保存,备用。(1)DNA提取。本试验使用HiPure Stool DNAKits DNA提取试剂盒(上海芃硕生物科技有限公司)提取试验羊十二指肠、空肠、回肠内食糜样本的总基因组DNA。试验通用引物BacterialV3/V4(341F+805R)(5'-ACTCCTAVGGGAGGCAGCA-3')和(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对小肠食糜内微生物基因组总DNA的16S rRNA V3-V4高变区进行PCR扩增。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,产物选择400~450 bp的主带序列纯化回收,回收使用试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]。建库使用TruSeq DNA PCR-Free LibraryPreparation Kit试剂盒[因美纳(中国)科学器材有限公司],Qubit和Q-PCR定量合格后,利用Illumina NovaSeq PE250平台测序。(2)测序数据处理及分析。根据Bacterial序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分各样本序列,采用FLASH V1.2.7软件质控,去除嵌合体后得到有效序列。采用Uparse V7.0.1001软件将序列聚类成OUTs并筛选代表序列。使用Mothur方法与Silva-138-99数据库进行物种注释分析,统计门和属水平群落组成。(3)功能预测。提取KEGG数据库原核全基因组16S rRNA基因序列,与Silva SSURef NR数据库建立相关矩阵,将注释的KEGG数据库的原核全基因组功能信息映射到Silva数据库,得到功能注释。测序样本以Silva数据库序列为参考序列,聚类OTU样本,获取功能注释信息。1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析,LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示,P0.05表示差异显著,P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1有氧运动对滩羊生长性能的影响(见表1)由表1可知,与对照组相比,试验1组和试验2组滩羊末重、平均日增重、平均日采食量及料重比差异均不显著(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.T001表1有氧运动对滩羊生长性能的影响组别初重/(kg/只)末重/(kg/只)平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[kg/(只·d)]料重比试验1组19.77±1.4943.84±4.84185.15±0.031.121±0.0805.91±0.22试验2组19.97±1.2341.00±4.64161.76±0.031.019±0.2106.15±0.47对照组19.77±1.0343.34±6.11181.35±0.501.084±0.0605.94±0.172.2各组滩羊小肠食糜质控数据统计(见表2)由表2可知,通过质控发现,各组间滩羊十二指肠、回肠和空肠食糜中序列数目均差异不显著(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.T002表2各组滩羊小肠食糜质控数据统计组织组别原始数据有效序列双端合并序列最终有效序列十二指肠试验1组154 975.71±44 686.43145 261.28±42 769.65121 870.00±24 564.34114 577.00±20 151.11试验2组131 477.42±37 051.92124 226.42±35 426.13112 790.85±29 716.49105 675.42±26 970.84对照组159 158.14±40 467.42151 040.14±38 406.42139 918.85±38 993.04129 930.71±41 447.75空肠试验1组98 884.71±31 461.0293 847.14±30 201.4385 996.00±28 865.7184 601.42±28 166.16试验2组143 946.28±123 342.71134 103.00±120 750.24108 269.42±88 222.82100 809.14±79 004.78对照组139 633.71±60 569.03132 750.28±58 467.02121 836.85±57 040.28117 336.42±54 009.11回肠试验1组130 477.42±23 676.81122 516.71±22 580.39114 705.00±19 814.26107 761.00±16 051.11试验2组120 393.00±35 819.12112 869.00±33 499.53105 917.71±32 456.9898 974.28±32 124.94对照组128 508.85±49 587.18120 408.00±46 149.80113 759.00±42 380.34105 742.71±35 992.202.3各组滩羊小肠菌群Venn图(见图1~图3)由图1可知,3个组十二指肠共有4 128个OTU。其中,对照组独有400个OTU,试验1组独有568个OTU,试验2组独有1 311个OTU,3组共有OTU有906个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.F001图1十二指肠Venn图由图2可知,3个组空肠共有10 178个OTU。其中,对照组独有2 374个OTU,试验1组独有2 876个OTU,试验2组独有2 297个OTU,3组公共OTU有1 042个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.F002图2空肠Venn图由图3可知,3个组回肠共有1 974个OTU。其中,对照组独有235个OTU,试验1组独有518个OTU,试验2组独有225个OTU,3组公共OTU有534个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.F003图3回肠Venn图试验1组滩羊小肠3个部位OTU个数均高于对照组,表明育肥期滩羊每日运动8~10 km可以提高小肠微生物的种类和多样性。2.4各组滩羊小肠菌群α多样性分析(见表3)由表3可知,各组十二指肠、空肠和回肠的Observe指数、Chao1指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数及J指数均差异不显著(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.T003表3各组滩羊小肠菌群α多样性分析组织组别Observe指数Chao1指数Ace指数Shannon指数Simpson指数J指数十二指肠试验1组820.00±393.62832.17±392.92826.59±394.724.07±0.740.92±0.070.61±0.08试验2组536.14±217.11544.15±223.57542.64±221.963.70±0.780.89±0.080.59±0.10对照组539.71±160.80553.96±164.82553.16±164.543.58±0.230.91±0.030.57±0.04空肠试验1组1 008.85±359.381 058.32±417.081 064.25±426.924.18±0.670.91±0.060.60±0.08试验2组940.00±599.04999.59±653.111 007.39±660.504.07±1.240.88±0.070.61±0.15对照组889.42±479.54950.65±519.98961.59±534.933.99±0.710.90±0.070.59±0.08回肠试验1组388.00±65.52391.63±66.68391.96±66.513.88±0.280.94±0.020.65±0.03试验2组374.42±49.11379.17±48.56378.12±48.533.83±.0810.93±0.040.64±0.09对照组334.14±62.73337.04±61.85337.29±61.913.46±0.380.90±0.060.59±0.05试验1组滩羊十二指肠、空肠和回肠中Observe指数、Chao1指数、Ace指数、Shannon指数及Simpson指数均高于对照组,可知试验1组滩羊十二指肠、空肠和回肠中实际观察到的菌群ASV种类数、数目指数、样本中微生物丰度和多样性均高于对照组。2.5各组滩羊小肠菌群β多样性分析(见图4~图6)图4十二指肠菌群主坐标和非度量多维尺度分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.F4a1(a)主坐标 (b)非度量多维尺度图5空肠菌群主坐标和非度量多维尺度分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.F5a1(a)主坐标 (b)非度量多维尺度β多样性分析使用Wilcox秩和Kruskal-Wallis进行检验,分析比较不同样本在物种多样性方面存在的相似程度,各组之间数据离散程度越大,说明组间差异越大。本试验采用加权(Bray Curtis和Weighted Unifrac)方式分析β多样性。由图4~图6可知,各试验组之间相距较远,各试验组与对照组相距较远,说明各试验组滩羊十二指肠、空肠和回肠微生物区系存在组间差异。图6回肠菌群主坐标和非度量多维尺度分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.F6a1(a)主坐标 (b)非度量多维尺度2.6各组滩羊小肠细菌组成与菌落结构分析2.6.1门水平结构分析(见表4)由表4可知,十二指肠菌群在门水平上共检测到24个菌门。3个组滩羊十二指肠食糜中菌门主要是厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、髌骨细菌门(Patescibacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和拟杆菌门(Bacteroidota),占比达到97.08%。与对照组相比,试验1组十二指肠食糜中变形菌门相对丰度显著升高(P0.05),脱硫菌门和互养菌门相对丰度升高(P0.05),厚壁菌门、放线菌门和Unassigned相对丰度降低(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.T004表4十二指肠、空肠、回肠门水平菌群丰度分析组织项目试验1组试验2组对照组十二指肠厚壁菌门(Firmicutes)58.85±8.7257.76±20.7071.01±7.21变形菌门(Proteobacteria)17.66±6.25a11.00±7.39ab8.79±6.76b髌骨细菌门(Patescibacteria)7.74±1.0118.30±6.925.28±0.68放线菌门(Actinobacteriota)6.92±3.754.70±3.369.65±3.27拟杆菌门(Bacteroidota)5.91±2.886.53±1.276.66±0.26Unassigned0.34±0.110.06±0.011.53±1.19脱硫菌门(Desulfobacterota)0.74±0.110.37±0.040.36±0.15蓝细菌(Cyanobacteria)0.49±0.150.17±0.040.25±0.11广古菌门(Euryarchaeota)0.09±0.010.43±0.120.11±0.07互养菌门(Synergistota)0.21±0.030.14±0.080.05±0.02空肠厚壁菌门(Firmicutes)54.36±4.5948.85±11.4050.88±7.23变形菌门(Proteobacteria)25.56±6.13ab32.85±9.34a21.19±10.69b拟杆菌门(Bacteroidota)7.91±3.057.61±2.957.75±1.24放线菌门(Actinobacteriota)5.42±1.083.19±0.288.04±1.69髌骨细菌门(Patescibacteria)2.44±0.371.53±0.352.08±0.33浮霉菌门(Planctomycetota)0.43±0.092.43±0.530.27±0.09广古菌门(Euryarchaeota)0.84±0.180.45±0.080.94±0.15绿弯菌门(Chloroflexi)0.50±0.111.02±0.560.33±0.13梭杆菌门(Fusobacteriota)0.43±0.190.52±0.200.40±0.05蓝细菌(Cyanobacteria)0.24±0.070.28±0.080.47±0.15其他类(Others)0.27±0.030.55±0.280.16±0.06回肠厚壁菌门(Firmicutes)80.89±1.3468.96±4.4073.18±9.21变形菌门(Proteobacteria)4.22±1.164.90±1.9618.70±8.45放线菌门(Actinobacteriota)9.72±1.50ab14.93±5.00a2.93±0.70b髌骨细菌门(Patescibacteria)2.91±0.584.54±1.592.17±1.01拟杆菌门(Bacteroidota)0.43±0.092.98±0.801.63±0.23广古菌门(Euryarchaeota)1.14±0.291.58±0.570.65±0.11疣微菌门(Verrucomicrobiota)0.06±0.021.78±0.530.31±0.05蓝细菌(Cyanobacteria)0.44±0.270.22±0.020.18±0.02螺旋菌门(Spirochaetota)0.41±0.270.04±0.020.08±0.02洗脱微生物菌门(Elusimicrobiota)0.03±0.020.97±0.231.44±1.05其他类(Others)0.65±0.400.50±0.190.10±0.07注:同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P0.05),不同大写字母表示差异极显著(P0.01),无字母或相同字母表示差异不显著(P0.05);下表同。由表4可知,空肠细菌在门水平上共检测到23个菌门。3个组滩羊空肠食糜中菌门主要是厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和髌骨细菌门,占比达到95.69%。与对照组相比,试验2组空肠食糜中变形菌门相对丰度显著升高(P0.05),试验1组空肠食糜中变形菌门、髌骨细菌门、浮霉菌门、绿弯菌门和其他类相对丰度升高(P0.05),放线菌门、广古菌门和蓝细菌相对丰度降低(P0.05)。由表4可知,回肠细菌在门水平上共检测到28个菌门。3个组滩羊回肠食糜中菌门主要是厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、髌骨细菌门和广古菌门,占比达到98.88%。与对照组相比,试验2组回肠食糜中放线菌门相对丰度显著升高(P0.05);试验1组回肠食糜中厚壁菌门、放线菌门、髌骨细菌门、广古菌门、蓝细菌和螺旋菌门相对丰度升高(P0.05),变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门和洗脱微生物菌门相对丰度降低(P0.05)。2.6.2属水平结构分析(见表5)由表5可知,十二指肠细菌在属水平上共包含332个菌属,其中有16个菌属相对丰度比例在1%以上。与对照组相比,试验2组十二指肠食糜中粪球菌属相对丰度显著降低(P0.05),试验1组和试验2组十二指肠食糜中Solobacterium菌属相对丰度极显著降低(P0.01);试验1组十二指肠食糜中候选单胞生糖菌属、假单胞菌属、瘤胃球菌属、毛螺菌科NK3A20类群、丹毒丝菌UCG-007和其他类相对丰度升高(P0.05),真杆菌属和欧陆森氏菌属相对丰度降低(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.014.T005表5十二指肠、空肠、回肠属水平菌群丰度分析组织项目试验1组试验2组对照组十二指肠乳酸杆菌属(Lactobacillus)19.85±7.4516.39±2.0420.80±3.11候选单胞生糖菌属(Candidatus_Saccharimonas)6.34±1.2217.90±7.152.40±0.82假单胞菌属(Pseudomonas)11.88±3.036.05±1.076.15±1.45真杆菌属(Eubacterium_coprostanoligenes_group)5.62±2.854.36±0.9112.70±1.51粪球菌属(Coprococcus)3.46±0.53ab1.95±0.91b9.33±1.12a欧陆森氏菌属(Olsenella)3.97±0.322.69±0.326.03±1.28Solobacterium2.70±0.88B1.53±0.16B8.30±1.29A瘤胃球菌属(Ruminococcus)1.53±0.417.62±1.380.21±0.01毛螺菌科NK3A20类群(Lachnospiraceae_NK3A20_group)3.47±0.732.45±0.871.71±0.16丹毒丝菌UCG-007(Erysipelotrichaceae_UCG-007)3.77±0.732.45±0.871.71±0.16其他类(Others)37.41±7.3635.8±7.5630.4±8.73空肠乳酸杆菌属(Lactobacillus)26.69±4.2624.48±4.7824.84±5.60假单胞菌属(Pseudomonas)16.90±2.4618.36±4.3713.46±2.622.39±0.62b1.61±0.76B8.74±2.66Aa真杆菌属(Eubacterium_coprostanoligenes_group)欧陆森氏菌属(Olsenella)3.31±1.080.96±0.536.12±3.75普雷沃菌属(Prevotella)3.67±1.591.44±0.383.64±2.18埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)1.53±0.563.81±2.892.59±1.13Ureaplasma0.36±0.146.84±5.100.09±0.05毛螺菌科NK3A20类群(Lachnospiraceae_NK3A20_group)1.39±0.421.34±0.671.63±0.44聚乙酸菌属(Acetitomaculum)0.82±0.450.44±0.202.99±1.83支原体(Mycoplasma)1.91±1.470.26±0.101.92±1.45琥珀酸菌属(Succiniclasticum)3.97±0.860.12±0.000.06±0.03其他类(Others)38.87±2.3440.35±8.7633.92±2.66回肠罗姆布茨菌属(Romboutsia)19.79±10.012.87±4.0714.40±9.29苏黎世杆菌属(Turicibacter)11.13±2.5712.60±6.9510.77±6.68狭窄梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)6.36±3.19b9.07±5.42ab14.08±6.09a真杆菌属(Eubacterium_coprostanoligenes_group)8.79±4.076.21±4.587.92±5.83埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)0.99±0.21b2.68±0.68ab15.60±1.99a双歧杆菌(Bifidobacterium)1.39±0.509.54±4.500.02±0.01支原体(Mycoplasma)4.25±2.771.57±0.544.49±0.57欧陆森氏菌属(Olsenella)4.56±2.553.33±2.072.01±0.37乳酸杆菌属(Lactobacillus)2.92±0.562.03±0.023.58±1.70候选单胞生糖菌属(Candidatus_Saccharimonas)2.13±0.723.99±1.381.49±0.50其他类(Others)37.69±4.6236.11±6.7025.55±5.47由表5可知,空肠细菌在属水平上共包含328个菌属,其中有14个菌属相对丰度比例在1%以上。与对照组相比,试验1组空肠食糜中真杆菌属相对丰度显著降低(P0.05),试验2组空肠食糜中真杆菌属相对丰度极显著降低(P0.01);试验1组空肠食糜中乳酸杆菌属、假单胞菌属、Ureaplasma、琥珀酸菌属和其他类相对丰度升高(P0.05),欧陆森氏菌属、埃希氏菌-志贺氏菌属、毛螺菌科NK3A20类群和聚乙酸菌属相对丰度降低(P0.05)。由表5可知,回肠细菌在属水平上共包含336个菌属,其中有18个菌属相对丰度比例在1%以上。与对照组相比,试验1组回肠食糜中狭窄梭菌属和埃希氏菌-志贺氏菌属相对丰度显著降低(P0.05),罗姆布茨菌属、苏黎世杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌、欧陆森氏菌属、候选单胞生糖菌属和其他类相对丰度升高(P0.05),乳酸杆菌属相对丰度降低(P0.05)。3讨论3.1有氧运动对滩羊小肠菌群丰度和多样性的影响适宜的有氧运动量不仅有利于提高动物机体健康状况[8],降低血脂浓度[9];同时还可改变肠道菌种丰度和多样性,提高肠道有益菌群数量及丰度,降低有害菌群数量及丰度[10-11],进而影响畜禽生长及营养物质的沉积[12]。CHOI等[13]发现,运动组小鼠肠球菌属数量约是对照组小鼠的24倍,提示运动改变了小鼠肠道菌群丰度。本试验发现,试验1组空肠与回肠共有与特有的OTU数目均高于其他两组,试验1组小肠中Observe指数、Chao1指数、Ace指数、Shannon指数及Simpson指数均高于对照组;β多样性分析结果显示,试验组小肠微生物区系丰度和多样性较高,说明育肥期滩羊每日有氧运动8~10 km可使小肠菌落结构、丰度和多样性发生改变,与THOMSON等[14]研究结果一致。3.2有氧运动对滩羊小肠菌群门水平和属水平的影响本试验中,育肥期滩羊每日有氧运动8~10 km时,十二指肠、空肠、回肠中门和属水平的菌群数量多于其他组,其中变形菌门、拟杆菌门、脱硫菌门、真杆菌属、选单胞生糖菌属、假单胞菌属和瘤胃球菌属等相对丰度升高,而Unassigned、疣微菌门和狭窄梭菌属等相对丰度降低。有氧运动可改善小肠门和属水平菌群丰度[15]。LI等[16]研究发现,PSD大鼠连续4周跑台训练后,小肠乳酸杆菌属、真杆菌属及双歧杆菌属丰度增加。3.3肠道菌群变化与动物生长性能及肠道健康的相关性分析肠道菌群及其代谢产物可对宿主的消化吸收、免疫防御、神经调节等产生影响[17]。MAILING等[18]研究发现,连续6 d自由轮转运动后,小鼠肠道内乳杆菌属、真杆菌属和双歧杆菌增加,可促进γ-氨基丁酸(GABA)及5-羟色胺(5-HT)合成,增加肠道短链脂肪酸(SCFAs)含量,降低肠道pH值,从而抑制肠道病原菌的生长与动物机体炎症反应。厚壁菌门与拟杆菌门比值降低会影响机体对食物能量的吸收[19]。本试验中,试验1组空肠中厚壁菌门与拟杆菌门的比值(6.87)高于其他两组(6.41和6.56),试验1组回肠中厚壁菌门与拟杆菌门的比值(188.1)远高于其他两组(23.14和44.89),表明有氧运动可以升高滩羊空肠和回肠中厚壁菌门与拟杆菌门的比值,提高滩羊小肠对食物的消化吸收水平。动物运动后机体能量消耗增加,在日粮饲喂量和营养成分相同的情况下,生长性能降低,而本试验中各组试验羊体重依然保持相对一致。因为试验1组滩羊每日有氧运动8~10 km后,肠道菌群结构发生改变,增强了肠道对营养物质消化吸收的能力,提升了肠道健康水平。试验1组小肠中双歧杆菌及乳酸杆菌增加,减轻了肠道菌群因外界因素变化引起的紊乱,保护了肠道屏障,抑制机体炎症的发生[20],有氧运动引起肠道菌群的变化构建起有氧运动与滩羊机体免疫调节之间的桥梁。有氧运动可以提高滩羊生产性能和肠道健康水平。4结论本试验结果表明,舍饲滩羊每日有氧运动8~10 km可以提高小肠中有益菌厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、乳酸杆菌属、假单胞菌属、琥珀酸菌属、双歧杆菌及候选单胞生糖菌属等丰度,降低有害菌疣微菌门、欧陆森氏菌属及狭窄梭菌属等丰度。可见,舍饲滩羊每日有氧运动8~10 km可调节小肠微生物菌落结构、丰度和多样性,改变肠道菌群比例,增强小肠对营养物质消化吸收的能力,提升肠道健康水平,有利于育肥期滩羊健康生长。

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