近年来，随着集约化高密度养殖模式的发展，水产动物疾病频发，给水产养殖业造成了重大的经济损失。目前，抗生素仍是主要防治水产动物细菌性疾病的药物。使用抗生素会导致耐药细菌的产生，对水体造成一定的污染，残留的药物还会进入人体，危害人类的健康[1-2]。与抗生素相比，植物提取物具有天然、多功能性、毒副作用小等特点，在防治水产动物疾病方面具有独特的优势[3-4]。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是从绿茶等茶叶中提取的一种酯型儿茶素，约占绿茶儿茶素总量的50%~80%[5]，是茶多酚中发挥生物学功能的主要成分，具有抗氧化、抗肿瘤等多种活性[6-7]。本文对EGCG的理化性质、提取方法及其在水产养殖中的应用进行综述，以期为EGCG在水产养殖行业中的应用提供参考。1EGCG概述1.1理化性质EGCG分子式为C22H18O10，相对分子质量为458.37，化学结构包含3个芳香环、1个吡喃环和8个酚羟基[8]，在常温下为白色粉末或晶体，在空气环境中易氧化呈浅粉红色，无特殊气味，可溶于水和甲醇、乙醇、丙酮等极性溶剂[9]。EGCG稳定性较差，受浓度、温度、紫外光照、pH值及溶剂等因素影响，会导致EGCG分解或转化[10-12]。在中性或碱性条件下EGCG相对不稳定，大量的活性酚羟基是其生物活性来源，进入机体后主要发生甲基化、葡萄糖醛酸化、磺化等生物转化反应[13-14]。EGCG的结构见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.031.F001图1EGCG的结构[15]1.2提取工艺EGCG从绿茶等植物中提取，提取方法包括水提、醇提、萃取及柱层析法等多种形式。郑琳等[16]研究发现，从茶叶中用纯水浸提EGCG的适宜条件为液料比20 mL/g、70 ℃的条件下浸提60 min，并得出了聚酰胺树脂纯化分离浸提液的纯化最佳工艺条件，经过两次柱层析制得的EGCG纯度达95.21%。CUI等[17]在提取剂中加入β-环糊精（β-CD）替代有机溶剂提取茶叶中的EGCG，发现15 g/L β-CD提取EGCG的效率高于水和50%乙醇的提取效率，25 g/L β-CD水溶液在60 ℃下提取60 min，EGCG达到最大产率，为118.7 mg/g，提高了茶叶中酚类物质的回收率。LAI等[18]研发了一种含有β-CD的二氧化硅吸附剂，用于绿茶提取物中分离纯化EGCG，结果显示，EGCG的吸附平衡容量高于55 mg/g，吸附率高于95%，洗脱后纯度和回收率约为90%，EGCG的产率约为每次6 mg，还证实了β-CD和EGCG之间存在特异性相互作用，包括β-CD络合作用、氢键相互作用和π-π相互作用。2EGCG在水产养殖中的应用2.1抗病毒作用EGCG已被证明能够抑制多种DNA病毒和RNA病毒，其机制包括抑制病毒核酸的合成、破坏病毒颗粒以及干扰病毒对宿主细胞的附着、影响病毒蛋白质代谢等[19]。在水产养殖中，EGCG能够抑制草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）、鲤疱疹病毒2型（cyprinid herpesvirus Ⅱ，CyHV-2）、大口黑鲈病毒（largemouth bass virus，LMBV）、白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV）以及石斑鱼虹彩病毒（singapore grouper iridovirus，SGIV）等病毒的活性。2.1.1抗GCRV作用GCRV是导致草鱼出血病的主要病原，疾病暴发时，草鱼的死亡率高达85%，从而造成了巨大的经济损失[20]。WANG等[21]研究发现，EGCG能够作为37/67-kDa层黏连蛋白受体（LAMR）的配体，影响GCRV颗粒与LAMR的结合，从而抑制GCRV颗粒在CIK肾脏细胞表面上附着。WANG等[22]研究表明，EGCG能够显著抑制GCRV感染的CIK细胞噬斑的形成，显著降低病毒产量；使用最适浓度（50%）的EGCG可显著降低草鱼的死亡数量，在攻毒第5 d后死亡率降为0。ZHANG等[23]研究表明，EGCG在草鱼体内会部分代谢为表没食子儿茶素（ECG）；ECG作为EGCG的主要代谢产物，具有与EGCG相似的代谢趋势和抗病毒活性，浓度高于20 mg/L的ECG可显著抑制GCRV的活性，浓度为20 mg/L的ECG可显著降低GCRV感染CIK细胞的细胞病变效应（CPE），而当ECG浓度达到40 mg/L时未出现明显的CPE，呈剂量依赖性。2.1.2抗CyHV-2作用CyHV-2是一种高传染性病原体，可致金鱼和鲫鱼的造血器官坏死，造成重大的经济损失，相关的病例已在多个国家被报道[24]。SHEN等[25]研究表明，EGCG作用于异育银鲫尾鳍细胞系（GiCF）的安全浓度低于10 mg/L；体外试验结果显示，质量浓度为50 mg/L的EGCG与CYHV-2共孵育2 h后，对病毒的灭活率可达99.99%；70 mg/L EGCG可完全灭活CYHV-2，能够直接作用于病毒粒子而发挥抗病毒作用。LU等[26]研究表明，EGCG能够通过调控KEAP1-NRF2通路相关基因的表达，抑制CYHV-2在感染早期诱导的金鱼鳍条细胞系（RyuF-2）内活性氧的增加，同时抑制CYHV-2基因转录以及蛋白质的合成，从而发挥抗病毒的作用。2.1.3抗其他病毒作用CHENG等[27]评价了EGCG的安全性，确定了该物质对胖头鲤细胞（FHM）的安全浓度为不高于10 mg/L；研究还发现，EGCG能够缓解LMBV感染细胞的病变，阻碍LMBV即刻早期蛋白（ICP46）的表达，并且对LMBV感染的吸附期和侵袭期均有不同程度的抑制作用，对LMBV颗粒、LMBV与宿主细胞结合、LMBV侵袭和LMBV在细胞内复制的抑制作用分别为84.89%、98.99%、95.23%、11.38%，其作用机制为破坏病毒颗粒的结构，影响病毒颗粒与细胞受体的结合，从而阻止其侵入宿主细胞。WANG等[28]研究表明，注射1 mg/kg EGCG能够显著提高被WSSV感染的拟穴青蟹的存活率，其机制为抑制WSSV的复制、阻断WSSV晚期基因的表达、提高拟穴青蟹先天免疫系统等。LI等[29]研究表明，EGCG作用于石斑鱼脾脏细胞（GS）的安全浓度为12 mg/L，并且对SGIV的抑制作用呈剂量依赖性，抑制率可达98.31%。2.2抗菌作用EGCG作为绿茶儿茶素中的主要成分，其抗菌机制与对细胞膜的损伤、抑制酶的活性（脂肪酸合成酶）以及DNA旋转酶等有关，单独使用时能够起到较好的抑菌作用，且可与抗生素等配合使用，发挥协同作用以达到更好的抑菌效果[30-31]。研究发现，EGCG对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为25~50 mg/L，作用机制为：改变细胞膜的通透性引发细胞内物质渗漏，从而影响细胞代谢，导致细胞死亡。此外，有试验还采用光谱学分析证实了EGCG能够以嵌插方式结合到细菌DNA的双螺旋碱基对中，从而改变了细菌的DNA构象[32-33]。SHEN等[25]研究发现，EGCG对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为256 mg/L，2 MIC浓度的EGCG会使细菌出现明显的胞壁破裂、皱缩、凹陷等形态学变化；体内试验结果显示，口服40 mg/kg的EGCG能够显著降低鱼内脏的细菌负荷，提高鱼体内细菌的清除率。吴林怡[34]研究表明，EGCG对3种水产致病菌柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌具有抑制作用，且与浓度呈正相关性，还证实了pH值为8时，EGCG具有最佳的抑菌效果。HAO等[35]研究表明，EGCG对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度为512 mg/L，而且亚抑菌浓度的EGCG能够在不抑制铜绿假单胞菌生长的情况下阻止生物膜的形成，并显著降低了毒力因子如弹性蛋白酶的产生和群体感应基因的表达。细菌的外排泵是引起耐药的主要因素之一，抑制外排泵有利于恢复细菌的药物敏感性，其中MexAB-OprM外排泵是导致铜绿假单胞菌耐药的主要原因，EGCG和抗生素联用时可以明显降低对铜绿假单胞菌的MIC值，并且与氯霉素或四环素联合使用的FIC指数均小于0.5，其机制与抑制细菌外排泵（MexAB-OprM）有关[36]。段合波等[37]研究表明，EGCG对拟态弧菌的最小抑菌浓度为256 mg/L，使用64 mg/L的EGCG与拟态弧菌共培养24 h后，提取的毒素粗提液诱导小鼠巨噬细胞，细胞凋亡率相比未加EGCG的粗提液由75.16%降至9.43%。GUO等[38]评价了植物提取物和抗生素的配伍对副溶血性弧菌的影响，结果显示，茶多酚（TP）是土霉素抑制副溶血性弧菌的最佳佐剂，1/64 MIC浓度的茶多酚和1/8 MIC浓度的土霉素联用可得到最小的FIC结果（0.14）。TP和土霉素联合使用可使脊尾白虾的存活率提高到53.3%，显著高于TP和土霉素组，还能够提高脊尾白虾的免疫力，达到较好的治疗效果。2.3抗寄生虫作用EGCG抗寄生虫作用的机制包括抑制虫体DNA和脂肪酸的合成、影响蛋白质活性以及能量代谢等[39]。PICON等[40]研究表明，浓度高于50 mg/L的EGCG作用3 h后对刺激隐核虫幼虫的致死率为100%。LEIRO等[41]经体外试验发现，500 µmol/L EGCG能够使大菱鲆舌齿鲈嗜污虫密度降低93%。SUZUKI等[42]研究发现，有效成分为EGCG的绿色提取物（GTE）能够去除大马哈鱼和马苏大马哈鱼鱼苗体表的波豆虫，使用0.9%的GTE浸泡5 min后，去除率可达100%；与仅感染波豆虫的大马哈鱼鱼苗相比，在海水激发试验中鱼苗的存活率由4%提高至92%。目前EGCG抗水产动物寄生虫的机制还未完全阐明，仍需进一步研究。2.4免疫调节作用EGCG具有较强的抗氧化功能，能够影响生物体内的抗氧化系统，清除自由基以及防止活性氧的产生[43-44]。在免疫调节方面，EGCG能够缓解及抑制病原微生物以及金属离子、毒素等对机体带来的氧化应激以及负面影响，维持机体的免疫功能。ZHANG等[45]发现，EGCG能够抑制节球藻毒素诱导的鲫鱼淋巴细胞凋亡，凋亡率从44.2%降至13.7%，其机制为降低凋亡相关基因Bax/Bcl-2的比值和Caspase-3的表达，提高抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）的活性，降低活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平，从而提高细胞的抗氧化能力，维持鱼类的正常免疫功能。LEE等[46]研究表明，EGCG能够有效缓解铜暴露对黄颡鱼的毒性作用，降低肝脏和鳃等组织中的铜含量，减缓铜在鱼体内的生物累积，还能够提高血液中溶菌酶的活性和免疫细胞的吞噬能力。WANG等[47]研究发现，EGCG促进了日本囊对虾酚氧化酶原激活系统（proPO）以及免疫缺陷（IMD）等先天免疫途径，提高了细菌、病毒感染后日本囊对虾的体液免疫水平，显著抑制了血细胞的凋亡，降低了WSSV的VP-28拷贝数，抑制病毒的复制，从而降低WSSV感染后的死亡率。ZHOU等[48]研究了EGCG缓解锰所致鲤鱼肾损伤的分子机制，结果显示，EGCG可以逆转过量锰引发的氧化应激，缓解由TRPM2-NLRP3-TNF-α-JNK途径引起的紧密连接功能障碍和炎症损伤。HUANG等[49]研究表明，以EGCG为主要成分的茶多酚能够缓解由黄曲霉毒素B1引起的南美白对虾肌肉水分、粗蛋白和粗脂肪等营养成分含量下降，抑制肌纤维间隙的扩张和肌小节断裂等损伤以及肌原纤维蛋白、肌浆蛋白等蛋白质含量的降低。ZHAO等[50]研究表明，以EGCG为主要成分的茶多酚能够缓解乙草胺引起的线粒体损伤和乳酸积累介导的草鱼肾细胞的凋亡和坏死，其机制为通过抑制CYP450S/ROS/MAPK/NF-κB通路和减轻瓦博格效应（Warburg effect）以减少细胞死亡。2.5水质调节作用水质对于水产动物的生存尤为重要，消毒剂残留、重金属污染以及在高温季节可能出现的蓝藻水华均会对水产养殖行业造成重大危害。LU等[51]发现，山茶对有毒蓝藻铜绿微囊藻的生长具有抑制作用，使用0.2 g/L的茶叶提取物处理初始浓度为106/mL的微囊藻12 d后，对微囊藻的抑制率可达90%；试验从茶叶中鉴定2种抑藻化合物，分别为EGCG和ECG。WANG等[52]研究表明，EGCG能够抑制铜绿微囊藻生长，80 mg/L的EGCG在48 h对铜绿微囊藻的抑制率可达92%，并且推测抑制机制可能为影响叶绿素合成、碳和硝酸盐同化以及细胞分裂。ZHANG等[53]以EGCG和铁为原料合成了一种新型的有机金属材料EGCG-Fe（EF），该材料对磷吸附迅速，最大回收率可达94.6%，平衡吸附量为4.61 mg/g；同时EF可直接将磷释放到水体中，作为磷肥利用。TAN等[54]研究表明，EGCG显著增强了广谱杀菌剂百菌清（CTL）的光降解速率，而且改变了光降解途径，避免了CTL高毒性代谢产物（CTL-OH）的产生，以减少CTL的水生毒性和污染。3展望植物提取物具有绿色、环保等优点，并且种类繁多，是近年来畜牧、水产养殖业的研究热点。EGCG作为茶多酚中的有效成分，具有抗氧化、抗病毒、提高机体免疫力等功效，在水产养殖行业中具有较大的应用价值。但目前EGCG的研究和应用主要集中于人类医学领域，因此，揭示EGCG在水产动物体内的代谢方式与作用机制是未来研究的趋势与重点，可为EGCG作为水产饲料添加剂和抑菌剂的开发和应用提供参考。