鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）是由冠状病毒科、γ-冠状病毒属的传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）感染鸡引起的一种急性、高度接触性传染病[1]。IBV对所有品种、日龄的鸡均具有易感性，尤以4周龄以内的雏鸡最为易感[2]，感染IBV的鸡又容易遭受支原体、细菌等继发感染而导致死亡[3-4]。我国主要采用接种IB弱毒疫苗的方法控制IB[5]，截至目前尚无治疗IBV感染的有效药物，因而接种疫苗仍然是降低生产损失最常用、最有效的措施[6]。IB弱毒疫苗存在一定的传播能力和致病性，以及免疫原性差等问题[7-8]。因此，研制能够增强IB弱毒疫苗的免疫佐剂是成功控制和消除IB危害的重要手段。黄芪多糖（APS）是中药黄芪的主要活性成分，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，能够增强巨噬细胞的吞噬与分泌作用，具有调节免疫、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、抗辐射和抗应激等作用[9-10]。目前，APS作为免疫增强剂和饲料添加剂在家禽养殖业中已广泛应用[11-12]。研究表明，APS作为饲料添加剂，可以提高鸡的抵抗力和抗应激能力，改善鸡肉品质，提升生产能力[13-15]。张尧等[16]研究表明，饲料中添加黄芪多糖（200 g/t）可以提高蛋鸡生产性能与蛋品质，调节肠道菌群结构。张有增[17]研究表明，在日粮中添加APS有利于肉鸡免疫器官的发育，降低料重比，同时提高肉鸡抗氧化能力。作为免疫增强剂，APS可以增强家禽免疫力，进而提高疫苗免疫原性和保护原性[18-20]。研究发现，APS能够增强IB核酸疫苗免疫效果[21]，但APS是否能够影响IB弱毒疫苗的免疫效果尚不清楚。本试验以14日龄蛋鸡为研究对象，评价APS对禽传染性支气管炎H120弱毒疫苗的免疫增强作用，以及对蛋鸡生产性能的影响，为生产中采用APS提高IB弱毒疫苗免疫效果提供参考。1材料与方法1.1试验材料120只14日龄蛋鸡购自吉林德大有限公司。黄芪多糖粉（批号：1208061）购自爱迪森北京生物科技有限公司，溶解于无菌的生理盐水中，浓度为50 g/L，于-20 ℃冰箱中保存。H120弱毒疫苗购自哈药集团生物疫苗有限公司。M41毒株由本实验室保存。IDEXX IBV Ab ELISA试剂盒购自北京爱德士生物科技有限公司，鸡IgA ELISA Kit试剂盒购自Novus Biologicals，USA。1.2试验设计及饲养管理将120只14日龄蛋鸡随机分3组，每组4个重复，每个重复10只蛋鸡，分别设置试验组（APS+H120联合免疫组，50 g/L APS溶解H120疫苗，每只冻干疫苗用100 μL APS溶液溶解）、H120弱毒疫苗组以及磷酸缓冲盐溶液（PBS）阴性对照组。各组蛋鸡共进行3次免疫，每次间隔2周。每次鼻腔接种100 μL/只。最后1次免疫14 d后经鼻腔攻毒M41株，攻毒剂量为103.0 EID50/0.1 mL，100 μL/只。攻毒后连续观察14 d，每日记录蛋鸡临床症状。各组蛋鸡饲喂基础饲粮。基础饲粮参照《产蛋鸡和肉鸡配合饲料》（GB/T 5916—2020）[22]和NRC（1994）[23]进行配制，其组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.007.T001表1饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米67.00代谢能/(MJ/kg)12.01豆粕29.00粗蛋白/%18.51磷酸氢钙1.60钙/%0.93石粉1.00有效磷/%0.41食盐0.30赖氨酸/%1.02DL-蛋氨酸0.10蛋氨酸+胱氨酸/%0.68预混料1.00苏氨酸/%0.70色氨酸/%0.22注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 10 000 IU、VD3 3 000 IU、VE 30 IU、VK 1 mg、VB1 1.8 mg、VB2 3.6 mg、VB6 1.5 mg、VB12 0.02 mg、CuSO4 6 mg、ZnSO4 80 mg、FeSO4 80 mg、MnSO4 100 mg、KI 0.35 mg、CoCl2 0.40 mg、叶酸0.55 mg、泛酸10 mg、烟酸30 mg、生物素0.16 mg、胆碱13 mg。2.营养水平均为计算值。蛋鸡采用3层笼养，自由采食和饮水。机械通风与自然通风相结合，采用人工光照的方法逐渐加光。日常饲养管理严格按照养殖场的规定进行。1.3测定指标及方法1.3.1抗体效价的检测于首免后第14、28、42 d，以及攻毒后第5、10、15 d，随机采集各组15只蛋鸡的翅下静脉血，3 000 r/min离心5 min，分离血清后用IDEXX IBV Ab ELISA试剂盒分别鉴定免疫和攻毒后IBV特异性免疫球蛋白G（IgG）抗体水平变化。随机采集各组5只蛋鸡的气管，使用等量PBS进行反复地冲洗后用鸡IgA ELISA Kit试剂盒检测气管灌洗液中分泌型免疫球蛋白A（sIgA）抗体水平。1.3.2攻毒后肺脏和肾病毒含量的检测于攻毒后第5、10、15 d，随机无菌采集各组5只蛋鸡的肺脏和肾脏。将组织剪碎研磨，4 ℃、5 000 g离心10 min后，上清液用0.22 μm滤器过滤除菌。将组织研磨上清液经10倍倍比稀释后，取100 μL经尿囊腔接种9~11日龄SPF鸡胚。37 ℃培养3 d后，按照Reed-Muench法测定组织中病毒的半数感染量（EID50）。1.3.3生长性能蛋鸡攻毒后，记录蛋鸡56（攻毒当日）、70日龄（攻毒14 d）空腹体重，每天记录采食量，用于计算平均日采食量、平均日增重和料重比。平均日采食量=总采食量/(饲喂天数×蛋鸡只数)(1)平均日增重=(70日龄体重-56日龄体重)/饲喂天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.4数据统计与分析利用GraphPad Prism 7.0和SPSS 20.0软件进行数据分析，结果以“平均值±标准误”表示。攻毒后蛋鸡成活率用Kaplan-Meier法和Log-Rank Test进行分析。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1APS联合H120弱毒疫苗对体液免疫和黏膜免疫的影响（见图1）由图1可知，与PBS组相比，APS+H120组和H120组血清中IBV特异性IgG抗体水平和气管灌洗液中sIgA抗体水平均显著提高（P0.05）。图1APS联合H120弱毒疫苗对体液免疫和黏膜免疫的影响注：“*”表示P0.05，“**”表示P0.01，“***”表示P0.001，“****”表示P0.000 1，“ns”表示差异不显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.007.F1a1（a）血清中IBV特异性IgG抗体水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.007.F1a2（b）气管灌洗液中sIgA抗体水平由图1（a）可知，尽管二免前APS+H120组和H120组IgG的抗体水平差异不显著（P0.05），但二免后H120+APS组IgG的抗体水平显著高于H120组（P0.05）。由图1（b）可知，在免疫后采集气管灌洗液的各个时间点，H120+APS组气管灌洗液中sIgA抗体水平均显著高于H120组（P0.05）。2.2攻毒后APS联合H120弱毒疫苗对体液免疫和黏膜免疫的影响（见图2）由图2可知，H120+APS组和H120组攻毒后血清IgG和气管灌洗液sIgA抗体水平显著高于PBS组（P0.05）。攻毒后，H120+APS组血清IgG和气管灌洗液sIgA抗体水平在各个时间点均显著高于H120组（P0.05）。图2攻毒后APS联合H120弱毒疫苗对体液免疫和黏膜免疫的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.007.F2a1（a）血清中IBV特异性IgG抗体水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.007.F2a2（b）气管灌洗液中sIgA抗体水平2.3攻毒后APS联合H120弱毒疫苗对肺脏和肾脏组织载毒量的影响（见图3）由图3可知，各个时间点均可在PBS组蛋鸡的肺脏和肾脏检测到病毒。在攻毒后第5 d，可在H120+APS组和H120组蛋鸡的肺脏和肾脏检测到病毒，且与H120组相比，APS+H120组肺脏和肾脏的病毒滴度显著降低（P0.05）。在攻毒后第10 d，可在H120组肺脏和肝脏检测到少量病毒，在攻毒后第15 d，在H120组肺脏和肝脏检测不到病毒；H120+APS组肺脏和肝脏在攻毒后第10、15 d均检测不到病毒。研究表明，APS能够促进H120弱毒疫苗降低IBV在肺脏和肝脏的病毒滴度。图3攻毒后APS联合H120弱毒疫苗对肺脏和肾脏组织载毒量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.007.F3a1（a）肺脏10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.007.F3a2（b）肝脏2.4攻毒后APS联合H120弱毒疫苗对蛋鸡的临床症状和生长性能的影响为确定APS是否能够增强H120弱毒疫苗的免疫保护效果，本试验统计了各组蛋鸡在感染IBV后14 d内的死亡情况，免疫攻毒后鸡的生存曲线见图4。在攻毒后第3 d，PBS组部分蛋鸡出现甩头、流鼻涕等症状，有1只蛋鸡死亡。攻毒后第4~10 d时，蛋鸡流鼻涕、甩头明显，在此期间共有5只蛋鸡死亡，剖检发现蛋鸡的气管和喉头黏液分泌旺盛。H120组在攻毒后除了前3 d有轻微呼吸道症状，第3 d有1只鸡死亡外，此后再无发病症状和死亡。H120+APS组蛋鸡在攻毒后未出现典型的IB症状和不良反应，保护率达到100%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.007.F004图4免疫攻毒后鸡的生存曲线攻毒后APS联合H120弱毒疫苗对蛋鸡生长性能的影响见表2。由表2可知，与PBS组相比，攻毒后H120组、H120+APS组蛋鸡平均日增重、平均日采食量显著提高（P0.05），而H120组和H120+APS组之间无显著差异（P0.05）。由此表明，APS能够提高H120弱毒疫苗的免疫保护作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.007.T002表2攻毒后APS联合H120弱毒疫苗对蛋鸡生长性能的影响项目56日龄体重/(g/只)70日龄体重/(g/只)平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[g/(只·d)]料重比P值0.924 90.000 30.000 10.009 90.000 1H120+APS组653.32±11.94827.96±13.56a12.47±0.68a54.15±2.34a4.35±0.31bH120组652.02±13.46810.29±15.72a11.30±0.41b53.27±1.43a4.71±0.12bPBS组649.80±12.65766.56±15.75b8.34±0.47c49.68±1.48b5.97±0.22a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。3讨论3.1APS联合H120弱毒疫苗对蛋鸡体液免疫功能的影响APS作为一种饲料添加剂可改善家禽的蛋品质以及肉品质，提高家禽的抗病力[13-15]。APS也可以作为免疫佐剂用于增强各种疫苗的抗体效价[24-26]。研究表明，APS能够增强新城疫疫苗体液免疫和细胞免疫功能[27]，提高传染性法氏囊炎病毒疫苗血清抗体效价，促进T淋巴细胞增殖[28]；促进禽流感疫苗T淋巴细胞增殖，提高疫苗的免疫性能[29]。杨仕群等[30]报道，APS能够提高禽流感、新城疫和IB等疫苗抗体滴度，增强免疫保护性。APS也能够增强IB核酸疫苗的血清抗体效价，提高核酸疫苗细胞免疫水平[21]。本试验表明，攻毒前后APS均能够显著提高IB H120弱毒疫苗诱导的IgG抗体水平。综上所述，APS能够提高禽类疫苗的体液免疫水平。3.2APS联合H120弱毒疫苗对蛋鸡黏膜免疫功能的影响研究表明，家禽黏膜免疫主要通过sIgA发挥作用，sIgA可以从空间构象上阻断病毒的附着，并对细菌与宿主黏膜上皮的附着具有直接的阻断效应，黏膜免疫对家禽传染病的防治具有重要意义[31]。郭彩霞等[32]研究表明，APS能够提高家禽机体的免疫力和抵抗力，促进黏膜再生，减轻黏膜炎症和萎缩，保护黏膜机械屏障，降低肠道通透性，提高黏膜免疫功能。本试验中，APS联合H120弱毒疫苗能够显著提高sIgA抗体效价，攻毒后APS+H120组sIgA抗体效价显著高于H120组。本研究表明，APS可以作为免疫佐剂提高疫苗的黏膜免疫抗体水平。此外，APS还可以作为疫苗冻干保护剂，减少冻干过程中的抗原损失。3.3APS联合H120弱毒疫苗对蛋鸡肺脏和肾脏组织载毒量以及生长性能的影响进行短期急性攻毒试验可检测禽类疫苗的保护效力，监测禽类的生长性能、死亡率、体外排毒和体内载毒能够评价疫苗的保护效力[33]。本试验中，攻毒14 d内PBS组蛋鸡的生长性能显著降低，有6只蛋鸡死亡；H120疫苗组蛋鸡生长性能下降不明显，仅有1只蛋鸡死亡；H120+APS组蛋鸡生长性能没有下降，无蛋鸡死亡，保护力为100%。此外，本试验发现，在攻毒后第5 d，与H120组相比，APS+H120组能够显著降低蛋鸡肺脏和肾脏的病毒滴度；在攻毒后第10 d，还可以在H120组肺脏和肝脏检测到少量病毒，第15 d检测不到病毒；而H120+APS组在攻毒后第10、15 d检测不到病毒。汪宏才等[18]报道，APS能够增强新城疫疫苗的保护力。结合本试验结果，APS能够作为一种禽用免疫佐剂，增强禽类疫苗的免疫力和保护力。4结论本研究结果表明，APS与IB弱毒疫苗联用时能有效提升疫苗的抗体效价，增强该弱毒疫苗接种后的保护力，从而诱导蛋鸡产生免疫应答，提高自身抗病力。