我国预计在2030年实现碳达峰，2060年实现碳中和[1-2]。而反刍动物每年向大气中排放约57亿t二氧化碳当量的温室气体[3]。畜牧业绿色低碳养殖成为我国达成“双碳”目标的主要落脚点。甲烷进入大气的20年内，其温室效应可高达二氧化碳的80倍[4]。但甲烷在大气中的存留时长却仅为二氧化碳的十分之一，降低甲烷排放是快速减缓温室效应的方法之一[5]。奶牛的甲烷产量占全球家畜甲烷总产量的30%[6]，甲烷生成还会造成6%~13%的饲料总能损失[7]，因此，减少奶牛等反刍动物甲烷产量成为动物营养领域的研究热点。降低反刍动物甲烷产量对提高养殖业的经济效益和早日实现畜牧业“碳中和”具有重要意义。微生物组学技术广泛应用于反刍动物瘤胃微生物组成结构和多样性的研究中。XUE等[8]采用微生物组学技术鉴定出高产奶牛瘤胃微生物组成特征。随着学者对瘤胃微生物菌群功能的深入研究，瘤胃微生物菌群对甲烷生成的影响受到广泛关注。但目前关于高产和低产奶牛的甲烷产量是否存在显著差异，瘤胃菌群多样性差异是否是导致其甲烷产量不同的关键因素等报道较少。因此，本研究采用甲烷预测模型对高产和低产奶牛不同泌乳阶段的甲烷产量进行预测，利用高通量测序技术探究高产和低产奶牛瘤胃产甲烷菌群落多样性特点，以期从瘤胃微生物多样性变化的角度阐释高产和低产奶牛不同泌乳阶段甲烷产量的变化规律，为调控反刍动物甲烷排放和奶牛高效养殖提供参考。1材料与方法1.1试验设计与饲养管理试验采用双因素试验设计，两个因素分别为泌乳性能（高产和低产）和泌乳阶段（泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期）。试验奶牛由内蒙古呼和浩特市某示范牧场提供，将健康状况良好，体重、胎次、体况相似的36头奶牛按泌乳性能和泌乳阶段分成高产泌乳前期组、高产泌乳中期组、高产泌乳后期组、低产泌乳前期组、低产泌乳中期组和低产泌乳后期组，每组6头奶牛。高产和低产奶牛不同泌乳阶段产奶量和乳品质见表1。奶牛自由饮水，分群饲养，奶牛饲粮由牛场提供，以全混合日粮（TMR）的方式饲喂。基础饲粮组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.011.T001表1高产和低产奶牛不同泌乳阶段产奶量和乳品质泌乳性能泌乳阶段产奶量/[kg/(头·d)]乳脂率/%乳蛋白率/%乳糖率/%高产奶牛前期44.31±4.712.88±0.863.52±0.555.30±0.35中期42.37±4.123.29±0.613.52±0.355.25±0.36后期31.38±3.243.76±0.593.56±0.445.40±0.18低产奶牛前期23.69±1.633.72±0.463.31±0.185.25±0.17中期23.38±1.543.68±0.533.35±0.495.33±0.16后期15.91±1.864.54±0.793.60±0.275.35±0.1410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.011.T002表2基础饲粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米青贮42.55泌乳净能/(MJ/kg)6.53苜蓿草4.26粗蛋白/%19.40精补料53.19中性洗涤纤维/%32.42钙/%0.93总磷/%0.38注：1.精补料由牧场提供。2.营养水平中泌乳净能为计算值，其余均为实测值。1.2测定指标及方法1.2.1样品采集在晨饲6 h后，利用瘤胃液口腔采集器收集奶牛瘤胃内容物，用四层纱布过滤后装入冻存管，液氮速冻，于-80 ℃冰箱保存，用于瘤胃微生物高通量测序分析。1.2.2高产和低产奶牛瘤胃甲烷产量预测本研究参考王荣等[9]基于挥发性脂肪酸代谢产生的80%的氢用于甲烷生成所建立的模型，预测高产和低产奶牛瘤胃甲烷产量。CH4=0.5×ACE-0.25×PRO+0.5×BUT-0.25×VAL(1)式中：CH4为每升瘤胃液甲烷浓度（mmol/L）；ACE为每升瘤胃液乙酸浓度（mmol/L）；PRO为每升瘤胃液丙酸浓度（mmol/L）；BUT为每升瘤胃液丁酸浓度（mmol/L）；VAL为每升瘤胃液戊酸浓度（mmol/L）。1.2.3高产和低产奶牛瘤胃产甲烷菌多样性采用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取瘤胃微生物总DNA作为模板，对16S rDNA V6-V8区进行扩增。使用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行质量检测，并使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。利用Miseq PE300平台对纯化后的PCR产物进行测序。1.3数据统计与分析试验数据采用SAS 9.2软件中的GLM程序进行方差分析，Wilcoxon秩和检验比较产甲烷菌多样性和丰富度，Duncan's法进行多重比较，Pearson相关性分析，计算甲烷产量、产奶量、乳品质和产甲烷菌相对丰度的相关系数。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1高产和低产奶牛不同泌乳阶段甲烷产量的比较（见表3）由表3可知，高产奶牛3个泌乳阶段的甲烷产量差异不显著（P0.05），低产奶牛泌乳前期甲烷产量显著高于泌乳中期和后期（P0.05）。高产奶牛甲烷产量显著低于低产奶牛（P0.05）；泌乳前期奶牛甲烷产量显著高于泌乳中期和后期（P0.05），泌乳中期和后期奶牛甲烷产量差异不显著（P0.05）。泌乳性能和泌乳阶段的互作效应能够显著影响奶牛甲烷产量（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.011.T003表3高产和低产奶牛不同泌乳阶段甲烷产量的比较项目甲烷产量高产泌乳前期组8.85±0.06C高产泌乳中期组8.73±0.05C高产泌乳后期组8.45±0.06C低产泌乳前期组13.21±0.08A低产泌乳中期组9.97±0.07B低产泌乳后期组10.72±0.06B泌乳性能高产奶牛8.69±0.11b低产奶牛11.31±0.27a泌乳阶段前期10.53±0.73a中期8.86±0.66b后期9.11±0.54bP值泌乳性能0.001泌乳阶段0.007泌乳性能×泌乳阶段0.016注：同列数据肩标不同大写字母表示各组间差异显著（P0.05），同列数据肩标不同小写字母表示相同泌乳性能（或泌乳阶段）差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mmol/L2.2高产和低产奶牛不同泌阶段瘤胃产甲烷菌多样性的比较2.2.1奶牛瘤胃产甲烷菌α多样性分析（见图1、表4）由图1可知，瘤胃产甲烷菌稀释曲线达到平稳，表明本次试验的测序深度足够，采集样本可以代表高产和低产奶牛瘤胃内环境整体情况。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.011.F001图1产甲烷菌稀释曲线由表4可知，高产奶牛Shannon指数显著低于低产奶牛（P0.05）；泌乳阶段对产甲烷菌α多样性指数无显著影响（P0.05）。泌乳性能和泌乳阶段的互作效应对产甲烷菌α多样性指数无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.011.T004表4奶牛瘤胃产甲烷菌α多样性分析项目AceChaoShannonSimpson高产奶牛前期42.59±4.6442.35±4.981.87±0.130.24±0.06高产奶牛中期51.44±4.2649.33±5.151.96±0.170.21±0.03高产奶牛后期50.43±5.7646.52±4.202.09±0.150.20±0.06高产奶牛前期48.56±5.5644.86±5.172.14±0.170.19±0.05高产奶牛中期44.21±2.6144.08±5.312.13±0.120.19±0.02高产奶牛后期48.52±4.7351.67±5.972.21±0.170.18±0.03泌乳性能高产奶牛48.16±5.1346.07±4.951.97±0.13b0.22±0.06低产奶牛47.10±6.3247.54±4.592.16±0.12a0.19±0.04泌乳阶段前期45.58±6.0843.61±5.232.00±0.170.21±0.06中期47.83±5.3047.71±4.672.04±0.200.20±0.03后期49.48±5.8249.09±4.962.15±0.180.19±0.04P值泌乳性能0.7420.6850.0300.079泌乳阶段0.6080.4420.3300.582泌乳性能×泌乳阶段0.2500.6260.7660.7472.2.2奶牛瘤胃产甲烷菌属水平菌属相对丰度分析（见表5）由表5可知，本试验共检出2个相对丰度大于1%的产甲烷菌属，分别为甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）和甲烷球形菌属（Methanosphaera）。低产奶牛各泌乳阶段以甲烷短杆菌属为优势菌属。低产奶牛泌乳前期和后期瘤胃甲烷短杆菌属相对丰度显著高于泌乳中期（P0.05）。高产奶牛瘤胃甲烷球形菌属相对丰度显著高于低产奶牛，而甲烷短杆菌属相对丰度显著低于低产奶牛（P0.05）；奶牛泌乳前期和中期瘤胃甲烷球形菌属相对丰度显著高于泌乳后期（P0.05），而甲烷短杆菌属相对丰度由高到低依次为泌乳后期、泌乳前期和泌乳中期，且不同泌乳阶段差异显著（P0.05）。泌乳性能和泌乳阶段的互作效应显著影响瘤胃甲烷短杆菌属相对丰度（P0.05），而对甲烷球形菌属相对丰度无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.011.T005表5奶牛瘤胃产甲烷菌属水平菌属相对丰度分析（占总菌比例大于1%）项目甲烷短杆菌属甲烷球形菌属高产奶牛前期0.45±0.02C0.56±0.02高产奶牛中期0.45±0.03C0.55±0.03高产奶牛后期0.54±0.01B0.50±0.01低产奶牛前期0.64±0.05A0.34±0.05低产奶牛中期0.56±0.02B0.37±0.02低产奶牛后期0.67±0.05A0.26±0.05泌乳性能高产奶牛0.48±0.06b0.54±0.06a低产奶牛0.62±0.03a0.32±0.03b泌乳阶段前期0.55±0.05b0.45±0.05a中期0.51±0.03c0.46±0.03a后期0.60±0.05a0.38±0.05bP值泌乳性能0.0010.001泌乳阶段0.0010.001泌乳性能×泌乳阶段0.0070.064%2.2.3奶牛瘤胃产甲烷菌属水平相对丰度与甲烷产量、产奶量和乳成分的相关性分析（见图2）由图2可知，奶牛甲烷产量与甲烷球形菌属（r=-0.63）相对丰度呈显著负相关，与甲烷短杆菌属（r=0.52）相对丰度呈显著正相关（P0.05）。乳脂率与甲烷球形菌属（r=-0.43）相对丰度呈显著负相关（P0.05），与甲烷短杆菌属（r=0.52）相对丰度呈显著正相关（P0.05）。产奶量与甲烷球形菌属（r=0.79）相对丰度呈显著正相关，与甲烷短杆菌属（r=-0.73）相对丰度呈显著负相关（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.011.F002图2奶牛瘤胃产甲烷菌属水平相对丰度与甲烷产量、产奶量和乳成分相关性分析注：热图X轴和Y轴分别为泌乳性能等指标和菌属，r值在图中以不同颜色展示，热图右侧色卡是不同r值的颜色分区；“*”表示0.01≤P≤0.05，“**”表示0.001≤P≤0.01，“***”表示P≤0.001。3讨论3.1高产和低产奶牛不同泌乳阶段瘤胃甲烷产量差异分析反刍动物瘤胃微生物分泌各种纤维素酶发酵饲料中的纤维素和半纤维素等营养物质可产生大量氢气，过高的瘤胃氢分压会影响瘤胃发酵的正常进行[10]。产甲烷菌利用发酵产生的氢气生成甲烷，能够避免乳酸等物质的蓄积，消除氢分压对发酵的抑制，促进微生物生长，提高饲料的利用效率[11]。高产奶牛具有更高的纤维物质降解能力，产生更多的氢气，进而使甲烷产量更高。本研究结合课题组前期研究成果，运用甲烷预测模型计算得出，高产奶牛甲烷产量显著低于低产奶牛。造成差异的原因一方面可能是奶牛产奶量提高，瘤胃菌群丰富度和多样性降低[12]，高产奶牛较低的微生物多样性避免了产生更多的代谢产物，使其拥有更简明高效的能量代谢网络，降低了氢气的产量，使更多的能量用于泌乳，从而减少了生产甲烷造成的能量损失[13]。低产奶牛微生物多样性较高，造成其复杂低效的营养物质代谢网络，生成更多氢气用于甲烷的生成。另一方面可能是瘤胃发酵生成丙酸需要消耗氢气，生成乙酸会产生氢气[14]。因此，瘤胃发酵类型与甲烷产量存在密切关系[15]。本课题组前期研究结果显示，高产和低产奶牛瘤胃发酵模式不同，饲粮中营养物质的消化率以及产生的挥发性脂肪酸浓度、组成比例均有所差异，高产奶牛丙酸浓度显著高于低产奶牛，乙酸浓度和丁酸浓度则显著低于低产奶牛[16]。结果表明，生成丙酸是高产奶牛除生成甲烷外的其他排氢途径，竞争性抑制甲烷的生成。低产奶牛生成乙酸较多，产生了更多的氢气，提示其甲烷产量较高。因此，高产和低产奶牛瘤胃微生物及挥发性脂肪酸组成的不同可能是导致二者甲烷产量差异的原因。奶牛处在不同泌乳阶段，由于产奶量、体况等存在差异，导致奶牛甲烷产量不同。王贝[17]使用六氟化硫示踪法对处于不同泌乳阶段的荷斯坦奶牛甲烷产量进行测定，结果表明，随着泌乳阶段递进，甲烷产量逐渐减少，本研究结果与其一致。3.2高产和低产奶牛不同泌乳阶段瘤胃产甲烷菌多样性差异分析反刍动物主要通过瘤胃中产甲烷菌利用氢气、乙酸、甲基化合物等发酵产物生成甲烷，根据利用底物的不同将产甲烷菌分为氢营养型产甲烷菌、乙酸异化型产甲烷菌和甲基营养型产甲烷菌等，且氢营养型产甲烷菌是瘤胃中最主要的产甲烷菌类型[18]。本研究发现，高产和低产奶牛各泌乳阶段均以甲烷短杆菌属和甲烷球形菌属为优势菌属，高产奶牛瘤胃甲烷短杆菌属相对丰度显著低于低产奶牛，而甲烷球形菌属相对丰度则显著高于低产奶牛。甲烷短杆菌属是牛瘤胃中的优势氢营养型产甲烷菌属[19]，可利用瘤胃发酵产生的氢气和二氧化碳生成甲烷，是甲烷生成过程中的主导菌属[20]；而甲烷球形菌属是甲基营养型产甲烷菌属，可利用瘤胃发酵产生的甲醇等甲基类代谢产物生成甲烷[20]。因此，高产奶牛产甲烷菌群落对氢的利用能力低于低产奶牛，甲烷生成较少，更多的氢气可用于生成丙酸等营养物质，降低饲料能量损失，提高产奶量。WALLACE等[21]研究表明，高甲烷排放奶牛瘤胃甲烷短杆菌属的相对丰度显著高于低甲烷排放奶牛，与本研究结果一致。因此，高产和低产奶牛瘤胃产甲烷菌相对丰度和多样性的差异可能是导致两者甲烷产量不同的原因。4结论本研究结果显示，高产和低产奶牛不同泌乳阶段的甲烷产量存在差异，高产奶牛甲烷产量低于低产奶牛；高产奶牛产甲烷菌菌群多样性较低且甲烷球形菌属相对丰度较高，导致其产甲烷菌群落捕捉氢气用于生成甲烷的能力低于低产奶牛，甲烷产量降低。