金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）可引起动物心内膜炎和乳腺炎等疾病[1-2]，也可通过突变形成超级耐药菌[3]，严重危害公共卫生安全及畜牧生产[4-6]。随着抗生素的大量使用，金黄色葡萄球菌的耐药性逐渐增强，多重耐药现象普遍。马晓姣等[7]报道，牛乳源的金黄色葡萄球菌对氨苄西林耐药率高达100%，菌株多重耐药率超过77%。柴云美等[8]发现，鸡蛋源金黄色葡萄球菌对多种药物耐药严重，并且表现多重耐药现象。此外，还有其他来自不同样本的金黄色葡萄球菌耐药严重的相关报道[9-11]。对此，农业农村部发布多个重要文件，明确指出“减量使用兽用抗菌药物”[12-13]，减量使用兽用抗菌药物已成为全球趋势[14]。因此，开发新型有效的抗菌药物对控制细菌感染性疾病和保障人类健康具有重要意义。研究发现，三联吡啶配体与多种金属离子形成的配合物具有良好的抗菌活性，已成为潜在的抗菌药物[15-17]。霍健强等[16]报道，含三联吡啶类配合物对大肠杆菌具有良好的抑菌效果。SAGHATFOROUSH等[17]研究发现，新型三吡啶Cd（Ⅱ）配合物对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有良好的抗菌活性。但目前未见三联吡啶金属配合物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性及抗菌机制的相关研究报道。本文研究了4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌和无乳链球菌的抗菌活性，通过观察锌配合物对金黄色葡萄球菌菌体的影响，进一步探讨了4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌的抗菌作用机制，为4取代三联吡啶锌金属配合物在动物生产中抑菌作用的研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003和铜绿假单胞菌CMCC（B）10104购自中国医学细菌保藏管理中心，沙门氏菌ATCC 14028和副溶血弧菌ATCC 33787购自中国微生物菌种保藏中心，大肠杆菌K99由广西壮族自治区兽医研究所分离保存，无乳链球菌GX107由广西大学动物科学技术学院水产病害研究室分离保存。LB培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，二甲亚砜（DMSO）购自天津市永大化学试剂有限公司，1.5 mol/L Tris-HCl（pH值8.8）、1.0 mol/L Tris-HCl（pH值6.8）、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）购自北京索莱宝科技有限公司，钙黄绿素购自上海源叶生物科技有限公司，乙醇购自天津市富宇精细化工有限公司，10%过硫酸铵（APS）购自成都市科龙化工试剂厂，30%丙烯酰胺母液（Acryl/Bis）购自大连美仑生物技术有限公司，四甲基乙二胺（TEMED）、考马斯亮蓝R250、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、5×SDS蛋白上样缓冲液购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，碘化丙啶（PI）、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物试剂公司。1.2试验方法1.2.14取代三联吡啶锌金属配合物对不同细菌的抗菌活性称取4取代三联吡啶锌金属配合物溶于DMSO，使其浓度为640 mg/L。取无菌LB培养基和4取代三联吡啶锌金属配合物在96孔细菌培养板上进行2倍倍比稀释，使配合物最终浓度分别为320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L，每孔体积为100 μL，加入100 μL的1×106 CFU/mL菌液。以200 μL无菌LB培养基为阴性对照，以100 μL无菌LB培养基加100 μL的1×106 CFU/mL菌液为阳性对照，37 ℃条件下温育24 h，以未见指示菌生长的最低浓度为该物质对细菌的最小抑菌浓度（MIC），测定OD600 nm值，计算抑菌率。抑菌率=(阳性对照孔OD600 nm值-药物孔OD600 nm值)/(阳性对照孔OD600 nm值-阴性对照OD600 nm值)×100%(1)1.2.24取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌的最小杀菌浓度（MBC）将未见细菌生长的菌悬液在LB固体培养基上涂板培养，共选取配合物浓度分别为20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L的菌悬液进行培养，菌落完全不生长的最低浓度为该配合物对金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003的MBC。1.2.34取代三联吡啶锌金属配合物处理金黄色葡萄球菌的生长曲线建立采用LB培养基稀释4取代三联吡啶锌金属配合物溶液至2.5、1.25、0.625 mg/L，将金黄色葡萄球菌菌液调整为1×104 CFU/mL，向其中加入锌配合物溶液使配合物最终浓度为1/4 MIC、1/2 MIC和MIC，以添加相同体积的LB培养基作为空白对照（CK）。置于37 ℃培养，每隔2 h取样，用紫外分光光度计测OD536.4 nm值，绘制OD536.4 nm值-时间变化曲线。1.2.44取代三联吡啶锌金属配合物处理金黄色葡萄球菌的致死曲线建立采用LB培养基稀释4取代三联吡啶锌金属配合物溶液至80、40、20、10 mg/L，将金黄色葡萄球菌菌液调整为1×107 CFU/mL，向其中加入锌配合物溶液使配合物最终浓度为MIC、2 MIC和4 MIC，以添加相同体积的LB培养基作为空白对照（CK）。置于37 ℃培养，每隔2 h取样，用紫外分光光度计测OD536.4 nm值，绘制OD536.4 nm值-时间变化曲线。1.2.54取代三联吡啶锌金属配合物处理金黄色葡萄球菌的细胞形态的影响观察采用LB培养基稀释4取代三联吡啶锌金属配合物溶液至80、40、20、10 mg/L，调整金黄色葡萄球菌菌液浓度为3×107 CFU/mL，向其中加入锌配合物溶液使配合物最终浓度为MIC、2 MIC和4 MIC，取相同体积LB肉汤作为空白对照（CK），置于37 ℃、180 r/min培养4 h，5 000 r/min离心10 min，PBS洗涤2 次，除净上清液。加入2.5%戊二醛，用微型旋涡混合仪振荡1 min，使其与固定液充分接触，室温下固定3 h。5 000 r/min离心10 min，PBS洗涤2次，除净上清液，将样品依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液对样品进行洗脱，每次10 min。100%乙醇溶液洗脱完毕后，加入一定量100%乙醇溶液重悬，取重悬后的样品置于硅片上真空干燥过夜，于镀金仪中真空喷金60 s，拍照。扫描电镜使用的电压为7 kV，放大倍数为20 000倍。1.2.64取代三联吡啶锌金属配合物处理金黄色葡萄球菌的细胞膜通透性的影响采用LB培养基稀释4取代三联吡啶锌金属配合物溶液至80、40、20、10 mg/L，调整金黄色葡萄球菌菌液浓度为107 CFU/mL，向其中加入锌配合物溶液使配合物最终浓度为MIC、2 MIC和4 MIC，取相同体积LB培养基作为空白对照（CK），置于37 ℃、180 r/min培养4 h，5 000 r/min离心10 min，用PBS悬浮菌泥。向每个样品中加入钙黄绿素和红色核酸荧光染液PI，避光反应10 min。取5 µL菌液转接到载玻片上，加上盖玻片，置于荧光显微镜下观察。荧光显微镜放大倍数为10倍，标尺为100 µm。1.2.74取代三联吡啶锌金属配合物处理金黄色葡萄球菌胞内蛋白表达的影响采用BCA蛋白浓度测定试剂盒通过微孔酶标仪法测定4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003胞内蛋白浓度的影响，具体方法如下：取20 μL的 25 g/L蛋白标准，加入980 μL PBS配制成0.5 g/L蛋白标准。按BCA试剂A与BCA试剂B的比例为50∶1配制BCA工作液。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至96孔板的标准品孔中，加PBS补足至20 μL。加20 μL样品至96孔板的样品孔中，每孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置25 min，用酶标仪测定OD562 nm值，根据标准曲线计算样品蛋白浓度。先配制分离胶，搅拌均匀后加入垂直电泳槽，用乙醇消除气泡并封闭胶面。待分离胶凝固后倒掉乙醇，配制浓缩胶，搅拌均匀后注入垂直电泳槽，插入电泳梳板。待浓缩胶凝固后拔下梳板，加入电泳缓冲液，将10 μL样品注入梳孔，电压调至90 V至电泳条带进入分离胶后，电压调至120 V，电泳条带至凝胶底部1 cm处停止电泳，之后进行染色及脱色。胶板剥入盛有考马斯亮蓝染液的培养皿中，放在水平摇床上染色2 h。取出胶板放入盛有脱色液的培养皿中，放在水平摇床上脱色，每30 min更换一次脱色液，直至胶板褪去底色，蛋白谱带清晰可见。2结果与分析2.14取代三联吡啶锌金属配合物对不同细菌的抗菌活性（见表1）由表1可知，4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的MIC均为1.25 mg/L，在低浓度条件下抑制了细菌生长，表现出优异的抗菌活性；4取代三联吡啶锌金属配合物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和无乳链球菌的MIC为80~160 mg/L，表现出一定的抗菌活性；4取代三联吡啶锌金属配合物对沙门氏菌的MIC值大于320 mg/L，抗菌活性不佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.013.T001表14取代三联吡啶锌金属配合物对不同细菌的抗菌活性项目细菌MIC/(mg/L)抑菌率/%革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌1.2598.75无乳链球菌160.0086.22革兰氏阴性菌大肠杆菌80.0065.23铜绿假单胞菌80.0086.62副溶血弧菌1.2594.42沙门氏菌＞320.0024.962.24取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌的MBC含不同浓度锌配合物的金黄色葡萄球菌菌液在LB平板上涂板结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.013.F001图1含不同浓度锌配合物的金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003菌液在LB平板上的涂板结果由图1可知，当锌配合物浓度大于或等于1.25 mg/L时，菌液在LB平板上均未长出菌落，因此确定4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌的MBC为1.25 mg/L。2.34取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球生长的影响（见图2）由图2可知，0~4 h时，CK组在OD536.4 nm值几乎不变，说明细菌0~4 h时在生长缓慢，4 h后OD536.4 nm值变化很快，说明指示菌生长快速，进入对数生长期，12 h后生长速度放缓；经1/4 MIC和1/2 MIC浓度锌配合物作用的两组细菌OD536.4 nm值变化趋势类似，在8~12 h时段内生长速度明显加快；经MIC浓度锌配合物作用的指示菌在前18 h内OD536.4 nm值几乎不变，说明细菌在前18 h内几乎不生长，18 h后生长速度加快。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.013.F002图24取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003生长的影响2.44取代三联吡啶锌金属配合物处理的金黄色葡萄球菌的致死曲线（见图3）由图3可知，在4 h时CK组OD536.4 nm值变化最快，说明细菌此时生长速度最快，处于对数生长期；8 h后OD536.4 nm值增长速度放缓，说明细菌生长速度减缓但仍处于上涨趋势。经MIC锌配合物作用的细菌OD536.4 nm值在16 h前几乎不变化，说明该时间点前细菌几乎不生长；16 h后OD536.4 nm值增长速度变快，说明该时间点后细菌生长速度增快；经2 MIC和4 MIC锌配合物作用的两组细菌OD536.4 nm值在前20 h内几乎不变化，说明前20 h内指示菌几乎不生长，20 h后生长速度加快。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.013.F003图34取代三联吡啶锌金属配合物处理的金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003的致死曲线2.54取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌细胞形态的影响（见图4）由图4可知，与金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003原始菌株相比，经锌配合物处理后的菌株形态变化明显；原始菌株呈典型的球状、细胞圆润饱满、外形规则且表面光滑；经MIC、2 MIC和4 MIC浓度锌配合物处理后细胞形态出现干瘪及破裂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.013.F004图44取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003细胞形态的影响（20 000×）2.64取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响经过核酸荧光探针PI和钙黄绿素染色后，可区分细胞的通透性。使用荧光显微镜观察到的经锌配合物作用的金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003和原始菌株细胞膜通透性变化见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.013.F005图54取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003细胞膜通透性的影响由图5可知，CK组在显微镜下观察均呈绿色荧光，经MIC、2 MIC和4 MIC浓度锌配合物作用后菌株呈红色荧光。研究表明，未经过锌配合物作用菌体细胞的细胞膜通透性正常，细胞主要显示为绿色荧光；经过MIC、2 MIC和4 MIC浓度锌配合物作用后，PI进入细胞与钙黄绿素竞争取代结合位点，荧光颜色由绿色转变为红色，细胞膜受损程度增加。2.74取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌胞内蛋白表达的影响使用酶标仪测定标准蛋白（BSA）的吸光度，建立了BSA的吸光度与浓度的标准曲线（见图6）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.013.F006图6BSA吸光度-浓度标准曲线由图6可知，直线的R2=0.995 3，说明BSA可用样品蛋白含量的测定。根据标准曲线计算出各组蛋白浓度见图7。由图7可知，CK组的蛋白浓度最高，其次是锌配合物浓度为1/4 MIC的处理组，锌配合物浓度为1/2 MIC的处理组蛋白浓度最低。CK组蛋白浓度与1/4 MIC组相比差异不显著（P0.05），CK组蛋白浓度显著高于1/2 MIC组（P0.05），1/4 MIC组蛋白浓度显著高于1/2 MIC组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.013.F007图7CK组菌株和经不同浓度锌配合物作用后菌株胞内蛋白浓度注：“**”表示组间存在显著差异（P0.05）。提取的CK组菌株和经过不同浓度锌配合物处理后的菌株的胞内蛋白经过SDS-PAGE电泳后的图谱见图8。由图8可知，金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003的43种菌株蛋白分子质量主要分布在15~100 kDa之间，与CK组菌株相比，经过1/4 MIC、1/2 MIC浓度锌配合物处理后的2种菌株蛋白条带颜色随着锌配合物浓度的升高而逐渐变浅，说明蛋白表达均受到抑制。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.013.F008图8CK组菌株和经不同浓度锌配合物作用后菌株SDS-PAGE图谱3讨论随着抗生素的细菌耐药性问题日益严重，开发新型抗菌药物变得迫切[11,18-19]。据报道，新型三联吡啶金属配合物对多种细菌具有良好的抗菌活性[17]。本研究发现，4取代三联吡啶锌金属配合物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有良好的抗菌活性，可认为其具有广谱抗菌活性。HASSAN等[20]研究发现，无抗菌活性的果胶与三联吡啶金属配合物结合后可对多种细菌产生较好的抗菌活性，与本研究结论相似。4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的MIC很低，与革兰氏阳性菌的最后一线抗生素万古霉素以及革兰氏阴性菌最后一线抗生素多黏菌素浓度相近[21]。当MBC≥32倍的MIC时，可判定受试微生物对受试药物产生了耐药性。本试验中，4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌的MBC与MIC相等，表明4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌具有良好抑制活性。细菌的生长曲线可反映其生长情况，细菌的生长繁殖一般分为4个时期：延滞期、对数期、稳定期和衰亡期[22]。由4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌的生长曲线和致死曲线的影响可知，锌金属配合物在不同程度上抑制细菌的生长，且具有浓度依赖性。简永欢等[23]研究发现，不同浓度的巴西苏木素对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌具有不同程度的抑制作用，其生长曲线与本研究中相似。但本研究中各处理组金黄色葡萄球菌均有继续生长的趋势，可能是由于生长过程中金黄色葡萄球菌发生了突变，但仍需进一步研究验证。金黄色葡萄球菌是常见的革兰氏阳性致病菌，正常形态为光滑的球形或近似球形，折光性好[24]。本研究通过扫描电镜观察到经MIC、2 MIC和4 MIC浓度锌配合物作用后的金黄色葡萄球菌菌体发生皱缩、干瘪或破裂等形态变化，这与郭英等[25]研究抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抗菌作用机制及张卯等[26]研究香茅醛对金黄色葡萄球菌的抗菌机制的结果相似，说明4取代三联吡啶锌金属配合物可能通过破坏细菌细胞导致细胞内容物外流而抑制细菌生长，从而表现抗菌作用。PI是一种常用的发红色荧光的DNA染料，可用于验证细胞膜是否破损[27]。本试验通过荧光显微镜观察到经不同浓度4取代三联吡啶锌金属配合物作用后的菌株呈现红色荧光，与田立鹏等[28]的研究结果相似，可能是由于4取代三联吡啶锌金属配合物导致细菌细胞膜通透性增大，使PI染料进入细胞内与钙黄绿素争夺结合位点，从而导致细菌菌体呈现红色荧光。蛋白质能够维持细菌正常生理代谢功能，当菌株蛋白质表达受到抑制时会导致菌体生长缓慢[29]。本研究发现，经4取代三联吡啶锌金属配合物作用后指示菌的胞内蛋白含量减少，结合荧光结果，说明4取代三联吡啶锌金属配合物可能使细胞膜通透性增大引起锌配合物进入细胞内抑制蛋白表达而发挥抗菌作用。曹瑶[30]研究发现，木犀草素可使金黄色葡萄球菌细胞膜破损及抑制细菌胞内蛋白表达，进而表现抗菌作用，结果与本研究相似。4结论本研究成功测定了4取代三联吡啶锌金属配合物对多种细菌的MIC，观察经配合物作用后的金黄色葡萄球菌的生长情况、菌体细胞形态、细胞膜通透性及胞内蛋白表达量的变化，初步探索了4取代三联吡啶锌金属配合物对金黄色葡萄球菌的抗菌机制，发现4取代三联吡啶锌金属配合物具有成为新型抗菌药物的潜力。本试验可为治疗细菌感染提供新思路，也为锌配合物的开发与利用提供参考。