枇杷叶为枇杷树的干燥叶[1]，是一味传统的中药，主要分布于广西、广东及云南等地区[2]。研究发现，枇杷叶中主要含有黄酮类、酚类、萜类和苦杏仁苷等成分[3-4]。枇杷叶提取物具有清除氧自由基的能力、降低血糖、增强机体免疫等药效，临床中可治疗胃炎和呼吸道疾病[5]。绿原酸是一类缩酚酸，是枇杷叶中的主要活性成分之一[6]，具有抗菌消炎作用，对肿瘤也具有一定的抑制作用，还能够提高白细胞数量，降低血压，延缓衰老[7]；绿原酸还可以作为保鲜剂和添加剂在食品行业中应用[8]。绿原酸具有多种生物学功能[9]，在动物养殖业作为天然饲料添加剂可提高畜禽机体的免疫力，改善肉品质[10-11]。双水相萃取的提取方法常用于提取纯化酶、多糖、多酚、黄酮及生物碱等生物活性物质，在天然产物分离、生物化学等方面应用较多[12-13]，也可用于提取金银花[14]、杜仲[15]及蒲公英[16]等药材中的绿原酸。提取绿原酸的方法有水提法、石硫醇法、酶解法和大孔树脂吸附法等[17]，但这些提取方法存在操作时间长和条件严苛等问题。双水相萃取能够有效避免使用对环境与人体危害大的有机溶剂，其分相速度快，操作条件温和，能够同时做到纯化与富集，有利于保护原料中活性物质的活性。本试验主要采用双水相协同超声波法提取枇杷叶中的绿原酸，UV法检测提取液中绿原酸含量[18]，通过单因素试验和Box-Behnken响应面法确定双水相协同超声波法提取枇杷叶绿原酸的最优提取工艺，为枇杷叶资源的开发与利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料枇杷叶2021年4月13日采摘于河池学院西校区，主要选取枇杷树冠四周成熟枝条下部的叶片，经河池学院化学与生物工程学院潘立卫高级实验师鉴定为蔷薇科枇杷属植物枇杷树的茎叶。主要仪器：KQ-250D超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），FA1004B型分析天平（上海越平科学仪器有限公司），DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司），Agilent8453紫外可见分光光度计（美国安捷伦公司），KA-1000C型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），DFT-50A手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司），Vorter QL-861漩涡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。主要试剂：绿原酸（批号：Y20A11K111541，98%）购自上海源叶生物科技（天津）有限公司，无水乙醇（AR）、磷酸氢二钾（AR）、L-抗坏血酸（AR）购自西陇科学股份有限公司，DPPH（AR）购自凯玛生化（天津）有限公司。1.2试验方法1.2.1枇杷叶的预处理将采摘的枇杷叶用清水漂洗干净，室内自然阴干后转移到温度为50 ℃的恒温烘箱内干燥72 h，取出已烘干的枇杷叶粉碎，过60目筛，收集枇杷叶粉末，并用自封袋密封放在干燥器中保存。1.2.2双水相体系的构建本试验主要选取磷酸氢二钾、蒸馏水和一定体积分数的乙醇溶液构建双水相体系，构建方法按参照文献[19]，准确称取磷酸氢二钾于50 mL离心管中，加入一定量蒸馏水使其溶解形成磷酸氢二钾水溶液，再加入一定量的乙醇溶液，即可构建20.0 g的双水相体系。所构建的双水相体系为弱碱性，有利于绿原酸析出，下相为盐溶液与少量的乙醇溶液构成，上相为有微量水的乙醇溶液，绿原酸溶于乙醇溶液。1.2.3枇杷叶中绿原酸的提取称取4.5 g磷酸氢二钾于50 mL离心管中，加入一定量的蒸馏水和一定体积的乙醇溶液，构建20.0 g的双水相体系。称取枇杷叶粉末0.25 g，加入双水相体系中，盖上盖子，漩涡仪旋涡2 min，于超声功率150 W、超声温度60 ℃下超声提取25 min，冷却，在1 500 r/min转速下离心10 min，静置5 min等待分层，取上相提取液转移至50 mL容量瓶中，加入体积分数为60%的乙醇溶液定容，即可得到供试品溶液，放置冰箱中冷藏。1.2.4最大吸收波长的选择参考文献[20]至文献[21]的方法，分别移取4.00 mL绿原酸标准溶液和4.00 mL枇杷叶提取液于25 mL比色管中，加入体积分数为60%的乙醇，定容至25.00 mL，以60%乙醇溶液作为空白试剂，采用紫外-可见分光光度计在200~600 nm范围内扫描全波长。在329 nm下有最大吸收峰，故将检测的最大吸收波长选定为329 nm。1.2.5标准曲线的配制分析天平准确称取绿原酸标准品4.4 mg于小型烧杯中，加入体积分数为60%的乙醇溶液使其溶解，转移至干燥的50 mL容量瓶中，多次润洗后采用60%乙醇溶液进行定容，即可得到质量浓度为88 mg/L的绿原酸标准溶液。5 mL吸量管分别量取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL配制好的绿原酸标准溶液于比色管中，加入体积分数为60%的乙醇溶液定容至25 mL，得到3.52、7.04、10.56、14.08、17.60 mg/L质量浓度的溶液。体积分数为60%的乙醇溶液作空白，在最大吸收波长下测定其吸光度（A），以绿原酸质量浓度（c，mg/L）为X轴，吸光度（A）为Y轴绘制绿原酸标准曲线。1.2.6枇杷叶中绿原酸提取率的测定绿原酸本身具有紫外吸收特性，不用加显色剂即可直接测定紫外吸收光谱（UV）。吸取枇杷叶绿原酸提取液适量定容，体积分数为60%的乙醇溶液作空白，最大吸收波长下测定吸光度，代入标准曲线回归方程中计算绿原酸提取率。绿原酸提取率=c×N×VM×106×100% (1)式中：N为稀释倍数；V为配成溶液体积（mL）；M为样品的质量（g）；c为绿原酸质量浓度（mg/L）。1.2.7单因素试验设计（1）乙醇体积分数对枇杷叶中绿原酸提取率的影响。按照1.2.2方法构建20.0 g双水相体系，其他条件保持不变，改变乙醇体积分数，分别配制40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液。按照1.2.3方法提取枇杷叶中的绿原酸，即可得到绿原酸提取液。移取4 mL提取液于比色管中，60%的乙醇定容至25 mL，测定其吸光度，计算枇杷叶中绿原酸的提取率。（2）超声温度对枇杷叶中绿原酸提取率的影响。按照1.2.2方法构建20.0 g双水相体系，其他条件保持不变，改变超声温度，分别在40、50、60、70、80 ℃下进行超声提取，按照1.2.3方法提取枇杷叶中的绿原酸，即可得到绿原酸提取液。移取4 mL提取液于比色管中，60%的乙醇定容至25 mL，测定其吸光度，计算枇杷叶中绿原酸的提取率。（3）超声时间对枇杷叶中绿原酸提取率的影响。按照1.2.2方法构建20.0 g双水相体系，其他条件保持不变，改变超声时间，分别超声提取15、20、25、30、35 min，按照1.2.3方法提取枇杷叶中的绿原酸，即可得到绿原酸提取液。移取4 mL提取液于比色管中，60%的乙醇定容至25 mL，测定其吸光度，计算枇杷叶中绿原酸的提取率。（4）磷酸氢二钾用量对枇杷叶中绿原酸提取率的影响。其他条件不变，改变磷酸氢二钾用量，分别称取4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 g磷酸氢二钾，按照1.2.2方法构建20.0 g双水相体系。按照1.2.3方法提取枇杷叶中的绿原酸，即可得到绿原酸提取液。移取4 mL提取液于比色管中，60%的乙醇定容至25 mL，测定其吸光度，计算枇杷叶中绿原酸的提取率。（5）超声功率对枇杷叶中绿原酸提取率的影响。按照1.2.2方法构建20.0 g双水相体系，其他条件保持不变，改变超声功率，分别在125、150、175、200、225 W下进行超声提取，按照1.2.3方法提取枇杷叶中的绿原酸，即可得到绿原酸提取液。移取4 mL提取液于比色管中，60%的乙醇定容至25 mL，测定其吸光度，计算枇杷叶中绿原酸的提取率。1.2.8Box-Behnken试验设计采用响应面Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken Design方法，在单因素试验基础上，以绿原酸提取率为响应值，设计响应面试验，响应面试验因素及水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.T001表1响应面试验因素及水平设计水平A乙醇体积分数/%B超声温度/℃C超声时间/minD磷酸氢二钾用量/g-15050204.006060254.5+17070305.01.2.9验证试验为考察响应面优化双水相协同超声法提取枇杷叶绿原酸工艺的稳定性，按照1.2.2方法构建双水相体系，在1.2.3提取方法下平行称取3份0.25 g枇杷叶，按响应面法得出的最优提取工艺条件进行试验，每份样品重复检测吸光度3次，计算绿原酸的提取率。1.2.10加标回收率试验取比色管3支，一支比色管移取3 mL枇杷叶提取液和3 mL绿原酸标准液，体积分数为60%的乙醇定容为25 mL，另外两支比色管，分别加入3 mL提取液和3 mL绿原酸标准液，操作方法同上，测定其吸光度，将吸光度代入标准曲线中分别计算溶液浓度、加样回收率。加样回收率=(加标测定浓度-本底样测定浓度)/加标测定浓度×100%(2)2结果与分析2.1标准曲线的绘制依据1.2.3节方法配制不同浓度的绿原酸标准液，利用UV测定329 nm处吸光度值，绘制标准曲线，利用Origin 8.0作图，得到绿原酸的线性回归方程为：Y=0.046 9X+0.002 5，R2=0.999 9，线性范围为0~17.6 mg/L。2.2单因素试验结果2.2.1乙醇体积分数对枇杷叶中绿原酸提取率的影响（见图1）由图1可知，枇杷叶中绿原酸提取率随乙醇体积分数提高呈现上升趋势，60%时达到顶峰，之后呈下降趋势。邓素兰等[22]认为，70％以上的乙醇溶液会引起绿原酸沉淀。乙醇体积分数过高时容易导致分相盐析出，造成双水相体系不稳定。因此，初步确定乙醇最佳体积分数为60%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F001图1乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响2.2.2超声温度对枇杷叶中绿原酸提取率的影响（见图2）由图2可知，枇杷叶中绿原酸提取率随超声温度提高呈现上升趋势，60 ℃时达到顶峰；60 ℃后呈下降趋势。绿原酸易溶解于热水、乙醇中，当温度升高到一定程度，有利于提取率的提高，但温度过高则会破坏绿原酸分子的邻二酚羟基结构。因此，选择60 ℃为绿原酸最佳提取温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F002图2超声温度对绿原酸提取率的影响2.2.3超声时间对枇杷叶中绿原酸提取率的影响（见图3）由图3可知，枇杷叶中绿原酸提取率随超声时间的延长呈现上升趋势，25 min时达到顶峰，25 min后呈现下降趋势。超声波能够降低纤维素的结晶度，使半纤维素部分水解，打破细胞壁，使提取时间缩短，但是超声时间过长则容易产生热效应，使得绿原酸的提取率下降。因此，选择25 min为最佳提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F003图3超声时间对绿原酸提取率的影响2.2.4磷酸氢二钾用量对枇杷叶中绿原酸提取率的影响（见图4）由图4可知，枇杷叶中绿原酸提取率随磷酸氢二钾用量增加呈上升趋势，4.5 g时达到顶峰，之后呈下降趋势。绿原酸属于有机酸，而试验所构建的双水相溶液主要为弱碱性，使枇杷叶中绿原酸更容易析出。但过多磷酸氢二钾会影响双水相体系的稳定性，同时会有大量晶体析出，甚至无法形成双水相体系，不利于绿原酸从体系中析出。因此，选择4.5 g磷酸氢二钾为最佳用量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F004图4磷酸氢二钾用量对绿原酸提取率的影响2.2.5超声功率对枇杷叶中绿原酸提取率的影响（见图5）由图5可知，枇杷叶中绿原酸提取率随超声功率增大呈上升趋势，150 W时达到顶峰，之后呈下降趋势。超声功率增大会导致温度升高，从而破坏了绿原酸分子中的邻二酚羟基结构，功率过大也会对仪器造成一定伤害，导致成本变高。因此选择150 W为最佳提取功率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F005图5超声功率对绿原酸提取率的影响2.3响应面试验结果（见表2、表3）在单因素试验结果上，综合考虑各个原因，通过响应面Box-Behnken软件，以乙醇体积分数（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、磷酸氢二钾用量（D）作为自变量，枇杷叶绿原酸的提取率（Y）作为响应值，设计4因素3水平的响应面分析方法，利用Design-Expert8.0.6软件对数据进行拟合，最后得到回归方程为：Y=1.54+0.025×A+0.022×B-0.008 333×C+0.020×D-0.05×AB+0.012×AC+0.007 5×AD-0.013×BC-0.005×BD+0.012×CD-0.091×A2-0.077B2-0.087×C2-0.088×D2由表3可知，模型的P=0.000 20.01，说明该模型极显著，且拟合程度良好，试验误差小。模型的相关系数R2＝0.918 3，表示91.83％的绿原酸提取率变化可用该模型解释。根据模型方差可知，方程的A2、B2、C2、D2项均呈极显著的水平（P0.01）。根据F值可知，4个因素对绿原酸提取率的影响排序为超声时间（C）磷酸氢二钾用量（D）超声温度（B）乙醇体积分数（A）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.T002表2响应面试验设计及结果试验号A/%B/℃C/minD/g绿原酸提取率/%15050254.51.3527050254.51.3935070254.51.4047070254.51.4256060204.01.3866060304.01.3376060205.01.4186060305.01.4195060254.01.32107060254.01.35115060255.01.34127060255.01.40136050204.51.32146070204.51.39156050304.51.37166070304.51.39175060204.51.32187060204.51.37195060304.51.29207060304.51.39216050254.01.31226070254.01.37236050255.01.35246070255.01.39256060254.51.53266060254.51.55276060254.51.5310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.T003表3枇杷叶绿原酸提取率回归模型及方差分析项目平方和自由度均方F值P值总变异0.1126模型0.100 0140.007 29.640.000 2A0.007 510.007 510.100.007 9B6.075 0×10-316.075 0×10-38.180.014 3C8.333 0×10-618.333 0×10-60.010.917 4D4.800 0×10-314.800 0×10-36.470.025 8AB0.100 0×10-310.100 0×10-30.130.720 0AC6.250 0×10-416.250 0×10-40.840.376 9AD2.250 0×10-412.250 0×10-40.300.592 1BC6.250 0×10-416.250 0×10-40.840.378 9BD0.000 110.000 10.130.720 0A20.044 010.044 059.280.000 1B20.032 010.032 042.690.000 1C20.040 010.040 054.480.000 1D20.042 010.042 056.060.000 1残差8.908 0×10-3127.424 0×10-4失拟项8.642 0×10-3108.642 0×10-46.480.141 0纯误差2.667 0×10-421.333 0×10-4注：R2=0.918 3，RAdj=0.823 0；P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.4各因素交互作用对绿原酸提取率的影响（见图6~图11）由图6可知，随着乙醇体积分数的增加和超声温度的提高，枇杷叶绿原酸得率呈先增加后降低的趋势。由图7可知，随着超声时间的延长和乙醇体积分数的增加，枇杷叶绿原酸得率先升高后降低。由图8可知，随着乙醇体积分数的增加和磷酸氢二钾用量的增加，枇杷叶绿原酸得率先升高后降低。由图9可知，随着超声温度的升高和超声时间的延长，枇杷叶绿原酸得率先升高后降低。由图10可知，随着超声温度的升高和磷酸氢二钾用量的增加，枇杷叶绿原酸得率先升高后降低。由图11可知，随着超声时间的延长和磷酸氢二钾用量的增加，枇杷叶绿原酸得率先升高后降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F006图6乙醇体积分数与超声温度交互作用对绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F007图7乙醇体积分数与超声时间交互作用对绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F008图8乙醇体积分数与磷酸氢二钾用量交互作用对绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F009图9超声温度与超声时间交互作用对绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F010图10超声温度与磷酸氢二钾用量交互作用对绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.01.013.F011图11超声时间与磷酸氢二钾用量交互作用对绿原酸提取率的影响2.5验证试验结果分析回归模型，枇杷叶中双水相协同超声法提取绿原酸物质的最好提取条件为乙醇体积分数61.39%、超声温度61.38 ℃、超声时间25.02 min、磷酸氢二钾用量4.56 g。结合实际将条件修正为乙醇体积分数61%、超声温度61 ℃、超声时间25 min、磷酸氢二钾用量4.6 g，平均提取率为1.53%，与响应面预测的理论值（1.541 1%）接近，表明该方法提取枇杷叶中绿原酸可靠有效。2.6加标回收率试验结果重复6次试验后，枇杷叶中绿原酸的加标回收率平均值为96.71%，表明在提取检测过程中使用此方法对绿原酸的损失量比较小，加样回收率较好。3结论本试验利用双水相协同超声法提取枇杷叶中的绿原酸，对影响枇杷叶绿原酸提取率的5个单因素进行试验，结合响应面优化分析。检测结果显示，R为0.999 9，加标回收率平均值为96.71%，绿原酸的最佳提取条件为乙醇体积分数61%、超声温度61 ℃、超声时间25 min、磷酸氢二钾用量为4.6 g，此条件下绿原酸提取率为1.53%，与理论值接近。运用该方法提取枇杷叶中绿原酸具有较多优势，只需用到无机盐、乙醇、水构建双水相，提取步骤简单，经济环保。绿原酸本身就具有紫外吸收特性，不用添加显色剂就可以直接检测吸光度，大大缩短了检测时间。