在畜牧生产中，大豆和苜蓿等常规蛋白饲料主要依赖进口，导致养殖成本居高不下[1]。构树具有很高的饲用价值[2-3]。杂交构树的叶茎中粗蛋白含量为18%~22%[4-6]，与苜蓿中蛋白含量相当。与玉米秸秆等常规粗饲料相比，杂交构树中钙、铁等营养元素含量更高。杂交构树活性成分十分丰富，如具有抗氧化、抗炎及抗肿瘤等特性的黄酮类、萜类等物质[7-8]。采用杂交构树饲喂反刍动物时，构树蛋白在瘤胃中具有较好的降解率[5]，有利于瘤胃发酵[9]，有助于提高机体的免疫和抗氧化性能[10]。因此，杂交构树可以作为反刍动物的优质粗饲料[10]。动物日粮是影响动物胃肠道微生物群落组成的重要因素之一。本研究探讨杂交构树作为粗饲料饲喂湖羊后对其瘤胃微生物群落组成的影响，为杂交构树在反刍动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验用羊由江西昊天羊业有限公司提供。供试青贮杂交构树为本课题组发酵生产，开包后当天用完。其他饲草和精料原料购自邳州市小河科技发展有限公司。1.2试验设计选取105只5月龄体重（26.70±2.14）kg的湖羊公羊，随机分为7组，每组15个重复。对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂分别添加30%、60%、100%杂交构树干料和青贮杂交构树的日粮。G0组（对照组）不添加杂交构树干料和青贮杂交构树；G30组杂交构树干粉替代30%花生秆；G60组杂交构树干粉替代60%花生秆；G100组杂交构树干粉替代100%花生秆；GS30组青贮杂交构树替代30%花生秆；GS60组青贮杂交构树替代60%花生秆；GS100组青贮杂交构树替代100%花生秆。试验日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.002.T001表1试验日粮组成及营养水平（干物质基础）项目G0组G30组G60组G100组GS30组GS60组GS100组原料组成/%玉米39393939393939麦麸3333333豆粕14141414141414花生秆402816028160杂交构树0122440122440预混料4444444合计100100100100100100100营养水平总能/（MJ/kg）15.9315.9815.7715.0315.7915.9516.27粗蛋白/%12.5112.6312.9913.4012.6612.8513.24粗纤维/%29.4328.7326.3624.5827.5125.2722.72粗脂肪/%13.5113.5513.2512.7112.5312.7011.35注：预混料购自邳州市小河科技发展有限公司。所有日粮精粗比为6∶4，其营养按照NRC肉羊的营养需要量。试验羊分栏饲喂，精料和粗料分开，每天8：00和16：00饲喂2次。饲喂前打扫收集前1 d剩余的饲料并进行称重。试验预试期14 d，正式试验期60 d。正式试验期起始日称重记为初重。1.3试验方法1.3.1湖羊瘤胃液细菌基因组DNA提取正式试验结束后，分别在每个试验组挑选5只（共35只）湖羊进行屠宰。收集35只湖羊瘤胃液，-80 °C冷冻保存，用于后续DNA提取。湖羊瘤胃液细菌基因组DNA的提取采用MoBio Ultra Clean土壤DNA提取试剂盒，步骤参照试剂盒说明书。提取的基因组DNA采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。采用Nanodrop 2000测定所提取DNA的浓度以及纯度，使用无菌水稀释样本至1 g/mL。符合要求的DNA样品用于后续分析。1.3.216S rRNA宏基因组测序16S rRNA宏基因组测序在北京诺禾致源科技股份有限公司进行。样本PCR扩增和测序：以稀释后的DNA为模板，采用引物515F和806R扩增V4区域。引物序列如下：515F：5'-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'；806R：5'- GTGAAAGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，斜体部分为接头。扩增条件：98 °C预变性1 min，98 °C变性10 s，50 °C退火30 s，72 °C复性60 s，30个循环，最后72 °C延伸10 min，4 °C保存。每份样品重复扩增3次后混合，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用DNA回收试剂盒切胶回收PCR产物（北京天根生化科技有限公司）。使用TruSeq PCR-FreeDNA建库试剂盒构建文库，实时荧光定量PCR进行文库定量，采用NovaSeq6000进行测序。数据优化与统计：数据下机后，从中拆分出各样本的数据，去除Barcode和引物序列，使用FLASH（V1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）[11]拼接每个样本的reads，得到原始Tags数据；然后对原始Tags数据进行过滤处理[12]得到高质量的Tags数据。参照Qiime（V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html）[13]流程进行Tags质量控制。Tags截取：将原始Tags质量值小于等于19的连续3个碱基进行截断。Tags长度过滤：经过截取后得到Tags数据集，进一步去除其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。经过进一步处理后的Tags再去除嵌合体序列，得到的Tags序列再（https://github.com/torognes/vsearch/[14]）与物种注释数据库进行比对，检测其中的嵌合体序列，并去除，得到有效数据。有效序列的聚类采用Uparse软件（Uparse v7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/）[15]进行，相似性在97%以上的为同一个OTU（Operational Taxonomic Unit），选取OTUs出现频数最高的序列作为代表序列。将所得到的序列与SILVA132（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库中的序列进行比对，进行物种注释分析（设定阈值为0.8~1.0），获得序列在不同分类水平的群落组成信息。1.4数据统计与分析OTUs、Chao1、Shannon指数采用Qiime软件（Version 1.9.1）进行计算，Alpha多样性指数组间差异分析采用R软件进行。Anosim分析采用Rvegan包的anosim函数。2结果与分析2.1湖羊瘤胃液细菌群落多样性分析（见表2）细菌群落多样性及物种丰度采用OTU指数（序列相似性为97%）、Chao1指数、Shannon指数来进行评估。由表2可知，在7组不同样本中，GS100组瘤胃液微生物的OTU数目最多（平均值为1 408个），GS60组OTU数目最少（平均值为1 070个），7组OTU数目差异不显著（P0.05）。GS100组瘤胃液微生物Chao1指数最高（平均值为1 706），GS60组Chao1瘤胃液微生物指数最低（平均值为1 202），7组瘤胃液微生物Chao1指数差异不显著（P0.05）。G30组瘤胃液微生物Shannon指数最高（平均值为7.63），GS60组瘤胃液微生物Shannon指数最低（平均值为7.08），但是7组瘤胃液微生物Shannon指数差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.002.T002表2湖羊瘤胃液细菌群落多样性分析项目G0组G30组G60组G100组GS30组GS60组GS100组OTU数目1 101±311 229±1131 160±281 105±391 131±711 070±361 408±167Chao1指数1 227±331 380±1271 334±641 231±371 257±1151 202±401 706±172Shannon指数7.39±0.177.63±0.167.53±0.127.47±0.197.22±0.217.08±0.247.62±0.26注：同行数据肩标小写字母不同表示差异显著（P0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2细菌群落组成分析（见图1~图3）由图1可知，在门水平上，7组样本瘤胃液细菌群落组成中，拟杆菌门（Bacteroidetes）为主要的细菌类群（各样本所占比例为38.87%~66.54%），厚壁菌门（Firmicutes）（22.66%~47.20%）细菌所占比例次之。两者占总细菌比例高达83.06%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.002.F001图1不同样本细菌群落组成（门水平）由图2可知，7组样本瘤胃液细菌群落组成中，拟杆菌纲（Bacterodia）细菌为主要优势菌纲（各样本所占比例为38.87%~66.54%），梭菌纲（Clotridia）细菌所占比例次之（各样本所占比例为19.95%~44.43%）。两者占总细菌比例高达79.33%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.002.F002图2不同样本细菌群落组成（纲水平）由图3可知，7组样本均有77.54%的序列没有被注释。在被注释的序列中，unidentified_Ruminococcaceae属所占比例最高（各样本所占比例为4.51%~8.54%），unidentified_Prevotellaceae属所占比例次之（各样本所占比例为1.39%~6.21%）。Fibrobacter属在各个样本中所占比例为0.26%~2.99%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.002.F003图3不同样本细菌群落组成（属水平）2.3不同样本细菌群落组成比较分析2.3.1各样本门水平组间差异分析（见表3）由表3可知，Bacteroidetes门细菌在添加杂交构树干料以及少量添加青贮杂交构树（GS30组和GS60组）的样本中所占的比例显著高于对照组（P0.05）。Firmicute门细菌在添加60%及以上比例的杂交构树干料及青贮杂交构树组所占的比例显著低于对照组（P0.05）。Fibrobacteres门细菌在添加青贮杂交构树GS60组所占比例最高，显著高于对照组（P0.05）。Actinobacteria门细菌在对照组中所占比例最高，显著高于其他组（P0.05）。Spirochaetes门细菌在添加青贮杂交构树GS100组所占比例最高，显著高于其他组（P0.05）。添加高比例杂交构树组（G100组）以及添加低比例青贮杂交构树组（GS30组和GS60组）其比值要显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.002.T003表3各样本门水平组间差异分析项目G0组G30组G60组G100组GS30组GS60组GS100组Bacteroidetes38.87±6.35c53.24±3.87ab64.12±1.39a62.51±5.96a59.77±5.98ab66.54±3.73a46.88±2.38bcFirmicute47.20±4.21a38.13±4.09ab29.30±1.63bc29.08±5.03bc27.46±3.09bc22.67±3.09c36.18±1.61bFibrobacteres0.25±0.01b1.27±0.06ab1.10±0.06ab0.98±0.03ab0.75±0.08ab2.99±0.16a2.53±0.16abActinobacteria1.69±0.04a0.88±0.03b0.50±0.07b0.40±0.05b0.59±0.02b0.31±0.06b0.43±0.04bSpirochaetes0.22±0.06b0.80±0.02b0.54±0.05b0.55±0.02b0.72±0.02b0.97±0.06b1.93±0.07aBacteroidetes/Firmicute0.89±0.22c1.51±0.28bc2.23±0.17abc2.64±0.23ab2.46±0.24ab3.24±0.27a1.30±0.07bc2.3.2各样本纲水平组间差异分析（见表4）由表4可知，Bacteroidia纲细菌在除GS100组外的试验组中所占的比例显著高于对照组（P0.05）。Clostridia纲细菌在除G30组外的杂交构树组所占的比例显著低于对照组（P0.05）。Fibrobacteria纲细菌在添加青贮杂交构树GS60组所占比例最高，显著高于对照组（P0.05）。Spirochaetia纲细菌在添加青贮杂交构树GS100组所占比例最高，显著高于其他组（P0.05）。Coriobacteriia纲细菌在各试验组中所占比例显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.002.T004表4各样本纲水平组间差异分析项目G0组G30组G60组G100组GS30组GS60组GS100Bacteroidia38.87±6.35c53.24±3.87ab64.12±1.39a62.51±5.96a59.77±5.98ab66.54±3.73a46.88±2.38bcClostridia44.44±4.29a35.63±4.40ab26.69±1.48bc27.23±3.02bc25.27±3.01bc19.95±1.44c32.45±1.75bFibrobacteria0.25±0.01b1.27±0.15ab1.10±0.15ab0.98±0.06ab0.75±0.08ab2.99±0.16a2.53±0.16abSpirochaetia0.22±0.01b0.80±0.02b0.54±0.05b0.55±0.02b0.72±0.08b0.97±0.07b1.93±0.07aCoriobacteriia1.31±0.04a0.54±0.07b0.30±0.04b0.21±0.05b0.39±0.04b0.19±0.02b0.25±0.03b2.3.3各样本属水平组间差异分析表（见表5）由表5可知，G60和GS60组样本瘤胃中unidentified_Prevotellaceae属细菌所占比例显著高于对照组（P0.05）。GS60组样本瘤胃中Fibrobacter属细菌所占比例显著高于对照组（P0.05）。各试验组Acetitomaculum属细菌所占比例显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.002.T005表5各样本属水平组间差异分析项目G0组G30组G60组G100组GS30组GS60组GS100组unidentified_Ruminococcaceae8.54±0.617.16±0.576.69±0.926.82±0.605.57±0.124.51±0.557.55±0.73unidentified_Prevotellaceae1.39±0.17c2.55±0.18c6.21±0.54ab3.82±0.34bc3.91±0.35bc7.03±0.38a2.92±0.57cFibrobacter0.26±0.01b1.27±0.16ab1.10±0.16ab0.98±0.16ab0.75±0.19ab2.99±0.26a2.52±0.15abAcetitomaculum2.08±0.16a1.00±0.15b0.58±0.11b0.61±0.05b1.09±0.17b0.62±0.19b0.63±0.16b2.4不同样本细菌群落组成相似性分析（见表6）由表6可知，对照组G0组与添加杂交构树组细菌群落组成差异显著（P0.05），但是与G30组细菌群落组成差异不显著（P0.05）。添加杂交构树干料组各组间细菌群落组成差异不显著（P0.05）。添加青贮杂交构树组中GS100组与其他两个组细菌群落组成差异显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.002.T006表6不同样本细菌群落组成相似性分析组别G0组G30组G60组G100组GS30组GS60组GS100组G0组—0.250.502(0.012)0.532(0.004)0.368(0.013)0.548(0.007)0.776(0.014)G30组0.25—0.1640.0360.296(0.025)0.2160.632(0.007)G60组0.502(0.012)0.164—-0.080.232(0.045)0.1640.608(0.009)G100组0.532(0.004)0.036-0.08—0.2320.1640.552(0.015)GS30组0.368(0.013)0.296(0.025)0.232(0.045)0.232—0.0960.452(0.006)GS60组0.548(0.007)0.2160.1640.1640.096—0.428(0.020)GS100组0.776(0.014)0.632(0.007)0.608(0.009)0.552(0.015)0.452(0.006)0.428(0.020)—注：括号中数据为P值。3讨论细菌群落组成α-多样性反映样本中微生物群落的丰富度和多样性，常用的评估指数包括OTU指数（序列相似性为97%）、Chao1指数、Shannon指数等。微生物群落组成多样性与动物的肠道健康紧密相关，进而影响动物机体健康[16]。本试验中，采用杂交构树替代普通日粮中花生秆对湖羊瘤胃中细菌群落的丰富度和多样性无显著影响，说明采用杂交构树饲喂湖羊不会造成其瘤胃微生物紊乱。瘤胃微生物对于动物饲料的消化以及机体功能的维持有重要作用。日粮是影响其组成的主要因素之一[17]。微生物群落结构会在短时间内对日粮的改变做出响应。随着饲喂时间的延长，肠道微生物区系逐渐稳定。本试验中，无论是对照组还是添加杂交构树的试验组，其瘤胃中优势菌群均为拟杆菌门和厚壁菌门，所占比例达到83%以上。有研究表明，拟杆菌门和厚壁菌门直接或者间接参与宿主机体的营养代谢和免疫调节作用[18-19]，为健康反刍动物瘤胃中主要的两类优势菌群。本试验表明，采用杂交构树代替常规粗饲料（花生秆）对肉羊瘤胃主要细菌群落组成无显著影响。从门水平观察发现，添加杂交构树干料或者青贮杂交构树组，拟杆菌门（Bacteroidetes）细菌所占的比例显著高于对照组，厚壁菌门（Firmicute）细菌所占的比例显著低于对照组，纲水平也得到类似的结果，这可能与杂交构树相对于花生秆有较高的蛋白含量以及较低的纤维含量有关。拟杆菌门、拟杆菌纲细菌主要参与日粮中碳水化合物（多糖）以及蛋白质的降解[20]，其与厚壁菌门相比有着更为广谱的多糖降解能力，其对于提高日粮营养利用率，动物的免疫力以及维持动物肠道微生态平衡有着非常重要的作用[21-22]。厚壁菌门细菌主要帮助动物进行纤维素的降解利用[23]，含有大量的分解纤维素的菌属，例如梭菌纲细菌。从所占比例较大的属水平结果来看，添加杂交构树的试验组unidentified_Prevotellaceae的含量显著高于对照组。普雷沃氏菌科细菌主要参与蛋白质、淀粉以及可溶性碳水化合物的降解[24]。本研究中，微生物群落组成存在差异可能与杂交构树和花生秆中纤维素含量、可溶性碳水化合物含量以及蛋白质含量存在差异有关。拟杆菌门和厚壁菌门的比例高低与动物机体的能量代谢相关。拟杆菌门和厚壁菌门的比例与动物的肥胖呈负相关。比例越小，动物越胖，厚壁菌门比例升高更有利于脂肪沉积[25]。本研究中，添加杂交构树组湖羊拟杆菌门和厚壁菌门的比例显著高于对照组，说明饲喂杂交构树有可能帮助肉羊去油膘、长瘦肉。4结论采用杂交构树饲喂湖羊不会造成其瘤胃微生物紊乱。从微生物群落组成看，饲喂杂交构树以及饲喂花生秆，主要的优势菌门均为拟杆菌门和厚壁菌门，说明采用杂交构树饲喂湖羊对于肉羊瘤胃主要细菌群落组成无显著影响。但是，添加杂交构树试验组拟杆菌门的相对丰度显著高于饲喂花生秆的对照组，厚壁菌门的相对丰度则显著低于对照组，说明饲喂杂交构树使得湖羊瘤胃微生物种类组成朝着以降解蛋白质和可溶性碳水化合物进行转变。