在畜牧养殖业中应用抗生素可在短期内降低养殖动物的患病率，促进动物生长，提高经济效益[1]。但长期使用抗生素容易使动物产生耐药性，同时使动物制品产生药物残留[2]。因此，“替抗”产品成为当前养殖业的研究热点。在此背景下，复合微生态制剂的研究逐渐受到人们的重视，它可以有效抑制病原微生物增殖，也不会产生药物残留等问题[3]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当前养殖业使用较广的一种微生态制剂，它能够产生芽孢结构，抗逆性强，便于加工、储藏和运输[4]。枯草芽孢杆菌进入动物肠道后可以产生大量生理活性物质来抑制病原菌滋生[5]，促进有益菌生长[6]。屎肠球菌（Enterococcus faecium）是动物肠道内的有益菌[7]，具有繁殖速度快、在肠道内附着力强等优点。屎肠球菌产生的乳酸等物质会提高动物的生长性能[8]。目前，关于单独将枯草芽孢杆菌和屎肠球菌制备成微生态制剂的研究较多，但是将二者结合起来应用于蛋鸡的相关研究较少。因此，本试验研究枯草芽孢杆菌、屎肠球菌以及两者联合使用对蛋鸡的影响，为两者在蛋鸡养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料枯草芽孢杆菌，活菌数为1.0×1010 CFU/g；屎肠球菌，活菌数1×1010 CFU/g。二者均购自亚太佳禾生物科技有限公司。1.2试验设计试验于潍坊高新区某蛋鸡养殖场进行。选择体重和产蛋率接近的健康的38周龄海兰褐蛋鸡400只，随机分为4组，每组5个重复，每个重复为20只鸡。试验期56 d。试验1组（对照组）饲喂基础饲粮；试验2组在基础饲粮中添加200 g/t的枯草芽孢杆菌；试验3组在基础饲粮中添加200 g/t的屎肠球菌；试验4组在基础饲粮中添加由100 g/t枯草芽孢杆菌与100 g/t屎肠球菌组成的复合微生态制剂。基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.007.T001表1基础饲粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米58.00代谢能/(MJ/kg)11.00豆粕21.00粗蛋白/%16.50棉粕4.00钙/%3.60菜籽粕5.00磷/%0.50石粉9.20赖氨酸/%0.70磷酸氢钙1.50蛋氨酸/%0.50食盐0.30预混料1.00注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 9 000 IU、VD 3 200 IU、VE 30 IU、VB1 1.50 mg、VB2 3.80 mg、VB6 1.60 mg、VK 1.60 mg、泛酸10.00 mg、叶酸 0.50 mg、烟酸28.50 mg、生物素0.18 mg、Fe 80.00 mg、Mn 85.00 mg、Zn 50.00 mg、Cu 9.00 mg、Se 0.30 mg、I 1.50 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理采用三层立体笼养鸡，每天光照保证不低于15 h。蛋鸡自由采食、自由饮水。1.4测定指标及方法1.4.1生产性能依据裘博文等[9]的方法，统计平均蛋重、产蛋率、死淘率和料蛋比。1.4.2蛋品质依据彭箫等[10]的方法，在蛋鸡46周龄的第1 d，随机采集试验各组蛋样，每组随机选取10枚鸡蛋，测定蛋品质相关指标。蛋品质分析仪的型号为Robotmation EMT-5 200。1.4.3血清生化和免疫指标试验结束当天，从各组中随机抽取蛋鸡5只，翅下静脉采血5 mL，3 500 r/min离心10 min，得到血清，保于-20 ℃冰箱内保存。使用日立7 180全自动生化分析仪检测总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）和白细胞介素4（IL-4）含量。试剂盒购自上海恒远生物科技有限公司。1.4.4肠道微生物无菌条件下称量盲肠食糜1 g，依照微生物活菌计数的方法进行测定，经选择性培养基培养后，在平皿上计算乳酸菌、大肠杆菌及沙门氏菌相应活菌数。1.5数据统计与分析采用SPSS 16.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡生产性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，试验2组、3组和4组蛋鸡的产蛋率均有所提高（P0.05），料蛋比和死淘率均下降（P0.05）。试验4组蛋鸡的产蛋率、料蛋比和死淘率均优于试验2组和试验3组，但3组之间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.007.T002表2枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡生产性能的影响组别产蛋率/%平均蛋重/(g/只)平均日采食量/(g/只)料蛋比死淘率/%试验1组（对照组）91.72±1.02b60.21±0.82114.15±1.242.07±0.05a3.22±0.45a试验2组93.35±1.52a60.14±1.32114.23±0.982.03±0.04b2.65±0.52b试验3组93.58±1.35a60.25±0.74113.92±1.122.02±0.04b2.43±0.24b试验4组94.22±1.24a60.18±0.91113.86±1.052.01±0.05b2.27±0.38b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡蛋品质的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，试验2组、3组和4组蛋鸡的蛋壳厚度和蛋黄颜色均得到改善（P0.05）。各试验组的哈夫单位略有提高，但差异均不显著（P0.05）。试验4组蛋鸡的蛋壳厚度、蛋黄颜色和蛋黄比例均优于试验2组和试验3组，但3组之间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.007.T003表3枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡蛋品质的影响组别蛋黄颜色蛋黄比例/%蛋形指数蛋壳厚度/mm蛋壳强度/（kg/cm2）蛋白高度/mm哈夫单位试验1组（对照组）9.85±0.31b25.51±1.24b1.34±0.030.310±0.030b3.83±0.426.25±0.4876.21±1.35试验2组10.46±0.35a26.06±0.63ab1.32±0.050.335±0.040a3.91±0.766.28±1.3176.52±2.13试验3组10.80±0.42a26.53±0.45ab1.34±0.030.342±0.040a3.95±0.536.19±1.1676.76±1.24试验4组11.05±0.46a26.92±1.16a1.35±0.060.361±0.050a3.92±0.656.27±0.6876.95±2.052.3枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，试验2组、3组和4组蛋鸡血清中总蛋白和球蛋白含量均有所提高（P0.05）。试验4组蛋鸡血清中总蛋白和白蛋白含量均优于试验2组和试验3组，但3组之间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.007.T004表4枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡血清生化指标的影响组别总蛋白/(g/L)白蛋白/(g/L)球蛋白/(g/L)葡萄糖/(mmol/L)总胆固醇/(mmol/L)甘油三酯/(mmol/L)试验1组（对照组）48.83±1.34b23.62±0.3525.21±0.85b14.21±0.4312.08±1.2413.74±1.25试验2组50.46±2.06a23.70±1.1426.76±1.15a14.25±0.5312.02±1.3513.68±1.02试验3组51.06±1.38a23.75±1.2727.31±1.28a14.13±0.4211.95±1.0613.55±1.37试验4组51.54±1.13a23.86±0.7427.68±0.73a14.18±0.7511.89±1.2813.43±1.462.4枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡血清免疫指标的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，试验2组、试验3组和试验4组蛋鸡血清中免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和干扰素-γ含量均有所提高（P0.05）。试验4组蛋鸡各血清免疫指标均优于试验2组和试验3组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.007.T005表5枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡血清免疫指标的影响组别免疫球蛋白G/(g/L)免疫球蛋白A/(g/L)免疫球蛋白M/(g/L)干扰素-γ/(ng/L)白细胞介素2/(ng/L)白细胞介素4/(ng/L)试验1组（对照组）2.23±0.15b0.228±0.0401.22±0.06b57.98±3.54b218.35±5.62b74.53±6.72试验2组2.92±0.12a0.226±0.0601.40±0.05a63.84±1.68a231.47±5.31ab76.02±5.24试验3组3.05±0.21a0.230±0.0601.48±0.04a64.56±2.06a232.94±6.49ab76.58±3.46试验4组3.16±0.27a0.232±0.0301.56±0.04a65.35±2.37a236.42±7.46a78.06±2.982.5枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡肠道微生物的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，各试验组蛋鸡肠道中的乳酸菌数量升高（P0.05），而大肠杆菌和沙门氏菌的数量降低（P0.05）。研究表明，在基础饲粮中添加复合益生菌的效果优于添加单一益生菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.007.T006表6枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡肠道微生物的影响组别乳酸菌大肠杆菌沙门氏菌试验1组（对照组）7.86±0.38b7.85±0.43a6.72±0.31a试验2组8.64±0.42a7.16±0.40b6.24±0.45b试验3组8.72±0.52a7.18±0.51b6.25±0.38b试验4组8.81±0.26a6.86±0.36b6.19±0.27blgCFU/g3讨论3.1枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡生产性能的影响本试验结果显示，与对照组相比，在基础饲粮中添加单一益生菌，产蛋率明显提高，料蛋比和死淘率明显下降，而在基础饲粮中添加复合益生菌的功效优于添加单一益生菌。枯草芽孢杆菌和屎肠球菌进入动物肠道后可以产生大量生理活性物质，抑制病原菌滋生，促进有益菌生长。枯草芽孢杆菌和屎肠球菌代谢产生的维生素和多种活性酶增强了动物吸收营养物质的能力，从而间接提高了动物的生产性能[11]。UPADHAYA等[12]研究发现，用枯草芽孢杆菌（500 g/t）和地衣芽孢杆菌（500 g/t）复合微生态制剂饲喂20 w的蛋鸡，发现蛋鸡的产蛋率明显提高，采食量下降，提高了饲料吸收率。YANG等[13]研究发现，在蛋鸡的饲粮中添加1×106 CFU/g的枯草芽孢杆菌制剂能够提高蛋鸡的生产性能，改善鸡蛋品质。裴跃明等[14]研究发现，枯草芽孢杆菌制剂可显著提高产蛋后期蛋鸡生产性能，且最佳用量为0.5%。李昊等[15]研究发现，使用副干酪乳杆菌KL1可以提高蛋鸡的生产性能。本课题组前期研究表明，丁酸梭菌能够提高蛋鸡的生产性能及蛋品质[16]。以上研究结果均与本研究结果相似。3.2枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡蛋品质的影响本试验发现，与对照组相比，在基础饲粮中添加益生菌制剂，鸡蛋的蛋壳厚度和蛋黄颜色明显提高，哈夫单位也略有提高，且在基础饲粮中添加复合菌种的效果优于添加单一菌种。原因可能是枯草芽孢杆菌与屎肠球菌在动物肠道增殖的过程中产生了大量的酶类物质，如淀粉酶和纤维素酶等，这些酶类使蛋鸡吸收营养物质的能力得到增强。例如，蛋鸡对钙和磷元素物质的吸收增强可以显著增加蛋壳厚度。而微生态制剂在动物肠道内代谢的过程中产生了番茄红素等类胡萝卜素，所以蛋黄颜色加深[17]。徐晨希等[18]研究发现，在饲粮中加入微生态制剂后，蛋鸡的哈夫单位和蛋白高度有所提高。张盼望[19]研究发现，在高温条件下给蛋鸡饲喂复合微生态制剂，蛋白高度和哈夫单位显著提高，微生态制剂的使用量为400 g/t枯草芽孢杆菌（1×1011 CFU/g）。鹿晓慧等等[20]研究发现，微生态制剂能够提高家禽的产蛋性能。顾动地等[21]研究发现，酵母硒能够提高产蛋高峰期的蛋鸡的产蛋能力。本试验将枯草芽孢杆菌与屎肠球菌的优良特性进行结合，在很大程度上提高了蛋鸡蛋品质，可为提高蛋鸡养殖的经济效益提供参考。3.3枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对蛋鸡血清生化指标及免疫指标的影响本试验中，在基础饲粮中添加益生菌制剂的试验组蛋鸡血清中总蛋白、球蛋白含量显著提高，而且添加复合益生菌制剂的作用强于添加单一益生菌。血清中的总蛋白含量越高，表明机体合成蛋白质的能力越强。郭军蕊等[22]研究发现，在饲粮中分别添加1×105、1×106、1×107、1×108 CFU/g枯草芽孢杆菌CGMCC 1.921饲喂蛋鸡，发现蛋鸡血清中总蛋白量有所提高，免疫力得到增强。郑爱娟等[23]研究发现，在基础饲粮中添加2.5×108 CFU/kg丁酸梭菌，肉鸡血清中球蛋白含量显著提高。本试验结果与上述研究内容较为一致。血清免疫指标含量可以体现动物体免疫应答能力。本试验中，在基础饲粮中添加益生菌制剂组的免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和干扰素-γ的含量显著提高，动物体免疫功能得到提高，从而提高了机体对外界病原体的抵抗力。刘淑娇等[24]研究发现，在肉仔鸡的基础饲粮中分别添加0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的复合益生菌制剂，肉仔鸡的免疫功能显著升高，且复合益生菌制剂的最佳用量为0.6%。黄翠翠等[25]研究发现，丁酸梭菌可以提高肉鸡的抗氧化功能。3.4枯草芽孢杆菌与屎肠球菌对肠道微生物的影响动物肠道内的微生物种类繁多，数量大。在健康的状态下，动物体内的微生物处于动态平衡的状态[26]。当动物肠道内菌群失衡，致病菌数量升高，极易导致动物出现健康问题。微生物在动物肠道内定植后可以产生抗菌物质，有效抑制病原菌的繁殖[27]。因此，在饲粮中适当补充微生态制剂可以有效抑制肠道内病原微生物的生长。益生菌在生长繁殖的过程中产生大量的营养物质，如多种氨基酸和维生素等物质，能够有效刺激有益菌的生长，使有益菌数量保持优势状态[28]。动物的肠道免疫力得到提高，有利于动物保持健康状态。张明伟等[29]发现，益生菌可以有效调节蛋鸡肠道菌群平衡。郝小静等[30]研究发现，复合微生态制剂明显降低了高日龄蛋鸡粪便中有害微生物的数量。4结论本研究结果表明，100 g/t枯草芽孢杆菌与100 g/t屎肠球菌复合益生菌制剂可以提高蛋鸡的生产性能、蛋品质及免疫力，改善血清生化指标。