与荷斯坦牛奶相比，水牛奶中含有丰富的脂类物质、蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素，胆固醇含量较低[1-2]。德宏水牛是云南优良畜种资源，具有繁殖能力强、抗病能力强、役用能力强、产肉性能良好等优良特性。李卫真等[3]发现，德宏水牛乳的脂肪、蛋白质、总固形物与非脂固形物含量高于荷斯坦牛乳。德宏水牛与河流型水牛杂交改良后，形成乳、肉兼顾的德宏奶水牛，其乳用价值逐渐受到重视[4]。微小RNA（miRNA）可通过调节特异性mRNA的表达参与多种生物学途径。目前，已在生物体液（如血液、牛奶和尿液）中检测到不同细胞或组织中合成的miRNA[5]。此外，miRNA也存在于不同物种的乳脂球中。miRNA在脂质代谢中的作用已被证实，脂质稳态在一定程度上由错综复杂的miRNA活性调控[6]。据报道，在饮用牛奶6 h后，血浆中miR-21水平升高[7]。另外，miR-21-5p基因在泌乳早期表达明显增加，表明它可能参与促进泌乳早期乳腺细胞增殖[8]。本文对不同乳脂率德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p基因表达情况进行研究，初步预测和验证磷酸甘油酰基转移酶（AGPAT）和3-磷酸甘油酰基转移酶（GPAM）基因的表达水平，为研究miRNA在德宏奶水牛乳脂合成的调控机制奠定基础。1材料与方法1.1试验动物及样品采集参照本课题组李国存等[9]前期所测定的乳脂率结果，以（7.5±0.5）%为基准，乳脂率高于8%为高乳脂率组（H组），乳脂率在7%~8%为中乳脂率组（M组），乳脂率低于7%为低乳脂率组（L组）。在此基础上，每组选取胎次相同、年龄相近、饲养环境相同、处于泌乳中期的试验牛各3头，屠宰后采集乳腺组织，在液氮中保存，用于总RNA提取和基因表达量测定。本试验的样本采集程序均严格按照云南农业大学生命科学伦理委员会批准的方案进行。1.2仪器和试剂试剂：RNA保存液、荧光定量试剂、RNAiso Plus RNA提取试剂；VIOX（V2801-C）八连排管购自昆明市润丰实验室用品。仪器：Power PacTM Basic电泳仪和Thermal Cycler荧光定量PCR仪购自BioRad公司；Themo核酸蛋白定量检测仪购自Thermo科技有限公司。1.3试验方法1.3.1总RNA提取及反转录参照唐娜等[10]的方法进行乳腺组织总RNA的提取及反转录，将RNA反转录成cDNA。1.3.2靶基因预测及引物设计使用RNAhybrid 2.1.2+svm light 6.01、Miranda 3.3a和TargetScan 7.0软件对miR-21-5p的靶基因进行预测，取三者交集作为靶基因预测结果，其中与脂类合成代谢相关的基因包括GPAM和AGPAT6。以Primer 7.0设计miR-21-5p及其靶基因GPAM和AGPAT6的引物序列，并以Oligo 7.0评价其引物质量，选取质量较好的引物进行合成。引物信息见表1，引物由昆明硕擎生物科技有限公司合成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.011.T001表1引物信息基因引物序列（5'→3'）长度/bp退火温度/℃miR-21-5pTAGCTTATCAGACTGATGTTGA2251.7ACTBF：AAGGACCTCTACGCCAACACGR：TTTGCGGTGGACGATGGAG2161.419U6shRNAF：CTCGCTTCGGCAGCACAR：AACGCTTCACGAATTTGCGT1759.820AGPAT6F：CGATGAGGTGACCAAGAGGR：ATCCCCGTGAAAGCGAGA1957.918GPAMF：GTCCAATGAAGGCACCATCTR：GAAGCTTCTTGTCCCACTGC2058.2201.3.3荧光定量检测德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p及其靶基因的表达水平以采集的9头牛乳腺组织cDNA为模板，分别以β-肌动蛋白（β-actin，ACTB）基因和U6shRNA为内参，对目的基因进行实时荧光定量PCR检测，每组3个重复。反应程序：95 ℃预变性5 min，1个循环；95 ℃变性10 s；60 ℃退火25 s；65 ℃延伸25 s，共40个循环；65 ℃ 10 s，81个循环进行熔解曲线分析。反应体系（25 μL）：SYBR® Premix EX Taq™ Ⅱ 12 μL、样本2 μL、MiRNA-specific primer 1 μL、mRQ 3’Primer 1 μL、RNase free ddH2O 9 μL。反应程序及条件相同，荧光定量PCR反应在同一板中进行，开始运行程序。1.3.4蛋白互作分析使用STRING在线分析工具对水牛GPAM（登录号：XP_025130241.1）和水牛AGPAT6（登录号：NP_001277775.1）蛋白的互作关系进行分析，并以Cytoscape 3.9.0软件处理蛋白互作网络。1.4数据统计与分析使用ΔCt法计算miR-21-5p及其靶基因的相对表达水平，采用SPSS 26.0软件对试验数据进行处理，结果以“平均值±标准误”表示，采用Excel作图。采用单因素方差分析法对不同乳脂率德宏奶水牛试验组间miR-21-5p及其靶基因GPAM和AGPAT6的表达水平进行差异显著性检验，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。以Pearson相关系数法对目的基因表达水平和乳脂率进行相关性分析。2结果与分析2.1德宏奶水牛乳腺组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果（见图1）由图1可知，凝胶成像系统可观察到3个完整且明显的条带，获得符合检测要求质量标准的RNA。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.011.F001图1德宏奶水牛乳腺组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果注：M为Marker DL-2000，1~9为本试验中的9个样本。2.2德宏奶水牛miR-21-5p表达水平（见图2）由图2可知，L组奶水牛乳腺组织中miR-21-5p的表达水平高于M组和H组（P0.01），M组的表达水平高于H组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.011.F002图2德宏奶水牛miR-21-5p表达水平注：不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。2.3德宏奶水牛靶基因AGPAT6和GPAM表达水平（见图3、图4）由图3可知，H组奶水牛乳腺组织中GPAM基因mRNA的表达水平高于L组（P0.01）；M组GPAM基因表达水平高于L组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.011.F003图3德宏奶水牛GPAM基因表达水平由图4可知，H组德宏奶水牛乳腺组织中AGPAT6基因mRNA表达水平高于M组和L组（P0.01），M组AGPAT6基因表达水平高于L组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.011.F004图4德宏奶水牛AGPAT6基因表达水平2.4miR-21-5p基因与靶基因AGPAT6和GPAM的相关性（见表2）由表2可知，miR-21-5p与靶基因AGPAT6的表达水平呈极显著负相关（P0.01）；miR-21-5p与靶基因GPAM的表达水平呈显著负相关（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.011.T002表2miR-21-5p与靶基因AGPAT6和GPAM的相关性miRNAAGPAT6GPAMmiR-21-5p-0.993**-0.769*注：“**”表示相关性极显著（P0.01），“*”表示相关性显著（P0.05）；下表同。2.5miR-21-5p基因表达水平与乳脂率的相关性（见表3）本课题组李国存等[9]前期测得的H组、M组和L组乳脂率分别为9.16%、7.44%和6.72%。由表3可知，德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p表达量与乳脂率呈显著负相关（P0.05），相关系数为-0.711。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.011.T003表3miR-21-5p表达水平与乳脂率的相关性miRNA乳脂率miR-21-5p-0.711*2.6靶基因AGPAT6和GPAM表达水平与乳脂率的相关性（见表4）由表4可知，靶基因AGPAT6和GPAM与乳脂率呈极显著正相关（P0.01），相关系数分别为0.954和0.889。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.011.T004表4靶基因AGPAT6和GPAM表达水平与乳脂率的相关性基因乳脂率AGPAT60.954**GPAM0.889**2.7GPAM和AGPAT6蛋白互作网络（见图5）由图5可知，GPAM、AGPAT6和GPAT2等11个蛋白存在互作关系，AGPAT6与GPAM互作关系最强，为0.997。此外，AGPATs家族内互作较为紧密，且与GPAM互作关系均较强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.011.F005图5GPAM和AGPAT6蛋白互作网络3讨论3.1miR-21-5p对乳腺组织脂代谢的影响乳腺是哺乳动物的重要器官，其泌乳能力与发育程度密切相关。乳汁是哺乳动物在进化过程中重要的生物体液之一。脂类是哺乳动物乳中的关键组成成分，甘油三酯（TG）占乳脂的90%，根据脂肪酸（FA）碳链的长度，可将FA分为短链脂肪酸、中链脂肪酸和长链脂肪酸；根据碳链中是否含双键，可将FA分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸[11]。母乳喂养会影响婴儿肠道微生物群组成，并通过母乳中的生物活性物质，如miRNA、抗体、乳铁蛋白、免疫球蛋白、细胞因子和激素等，促进婴儿的免疫系统发育。母乳所含的miRNA可在婴幼儿胃肠道的酸性环境中存活并且被机体吸收。miRNA是一类由内源基因编码的单链RNA分子，长度约为22个核苷酸序列，通过破坏靶基因的稳定性来发挥调控作用[12]。不同种类miRNA在乳腺生长发育过程中起重要作用，与乳腺脂质代谢相关[13]。miR-152的过表达促进了牛乳腺上皮细胞合成TG，而抑制miR-152表达降低了TG的合成[14]。miR-148a是乳脂球中含量最高的miRNA，可促进TG的合成[15]。此外，miRNA还可以通过调节奶牛、山羊和大鼠乳腺上皮细胞的活性和数量以及乳脂的合成影响泌乳[16]。miR-221、miR-29和miR-181a大量存在于初乳中，可参与泌乳调节。miR-221被确定为乳腺上皮细胞增殖的调节因子，在哺乳开始时下调[17]。miR-71在不同蛋白质和脂肪含量的奶牛中的表达水平也有所不同[18]。有研究发现了山羊乳腺组织中差异表达的miRNA与山羊奶脂肪酸组成之间的关系，靶向巨噬细胞刺激1（MST1）的miR-183水平与羊奶的脂肪酸含量呈正相关，MST1基因被山羊乳腺上皮细胞的细胞质中miR-183靶向，导致脂质代谢受到抑制[19]。OLLIER等[20]研究显示，高浓缩饲粮中完整的菜籽或葵花籽油会影响产奶量和乳成分，但不影响乳糖、蛋白质（例如β-酪蛋白）和脂质（如脂蛋白、脂肪酶）等相关代谢基因的乳腺mRNA表达。miR-21是具有自主转录单位的miRNA，位于17号染色体上的液泡膜蛋白1位点[21]，其过表达通过靶向脂肪酸结合蛋白7（FABP7）显著阻断硬脂酸（SA）诱导的细胞内脂质积累。miR-21是高度保守的miRNA之一，可在大多数细胞中表达，也经常被认为是癌症和心脏病等疾病的生物标志物[22]。miR-21通过调节下游靶基因参与心血管疾病的发病机制[23]。此外，miR-21在猪的骨骼肌发育过程中均有表达，并且在出生后100 d的骨骼肌中表达较为显著[24]。据报道，与产前30 d相比，产后7 d牛乳中miR-21-5p的表达水平上调，猪乳中miR-21-5p的表达水平在泌乳期第7~14 d下调，但随后在第21 d时显著升高[25]。因此，miR-21-5p表达水平可能受哺乳期、物种或体内外细胞行为差异的影响。上述结果表明，miRNA是泌乳过程中不可或缺的调节因子。本研究中，miR-21-5p在乳腺组织中表达水平为H组M组L组，与乳脂率呈显著负相关，说明miR-21-5p基因可能参与调控德宏奶水牛乳脂合成。3.2靶基因AGPAT6和GPAM对乳腺组织脂代谢的影响AGPATs是TG合成的关键酶，在脂肪组织和乳腺组织中高表达[26]。AGPAT6基因位于牛27号染色体上，由12个外显子组成，有1 371个核苷酸，理论上编码1个含456个氨基酸、大小为52 kD的蛋白。AGPAT6基因在小鼠的脂质生物合成中发挥重要作用，尤其在决定脂肪组织和肝脏中TG含量和成分上起特定作用。TG代谢的调控在哺乳动物机体能量和体内平衡中起重要作用。在真核生物中，合成TG主要有两种途径，即甘油一酯途径和甘油二酯途径。在绝大多数细胞中，TG均是通过甘油二酯途径进行合成。AGPAT6基因负责调控牛乳腺中脂肪酸合成乳脂的过程[27]。AGPAT6与脂肪吸收、合成和沉积相关，可能影响奶牛乳脂率以及产奶量等性状。AGPAT6高表达于小鼠内脏、皮下脂肪及乳腺上皮细胞中，缺失AGPAT6会使小鼠泌乳期乳腺导管和小泡不发达，且使其乳腺上皮细胞和乳腺导管中乳脂肪滴的数量和大小均显著下降，乳中甘油二酯和TG含量也显著下降[28]。此现象表明，AGPAT6可能对哺乳具有重要影响。GPAM位于牛的第26号染色体上，是一种线粒体酶，调节细胞内TG和磷脂的水平，且GPAM基因在各个组织中均可表达。在TG的合成过程中，GPAM受到激素和食物营养的共同调控。在空腹小鼠的肝脏内，GPAM蛋白表达活性降低，当饲喂高碳水化合物或高糖饮食后，小鼠GPAM蛋白的表达会显著增加[29]。在细胞和空腹小鼠中过表达GPAM基因显示，GPAM基因是TG含量的重要调控因素之一。与野生型小鼠相比，敲除GPAM基因后，普通小鼠体重变轻，肝脏中TG含量减少40％，血浆中的TG分泌减少[30]。TG是动物体内重要的供能物质，因此GPAM基因与动物体内能量代谢及脂肪的合成有关。本研究结果显示，AGPAT6、GPAM的表达水平为H组M组L组，且与乳脂率呈极显著正相关；miR-21-5p与AGPAT6的表达水平呈极显著负相关，与GPAM的表达水平呈显著负相关。蛋白互作关系显示，水牛GPAM与AGPAT6蛋白的互作关系最强。综上所述，miR-21-5p可能通过负调控靶基因AGPAT6和GPAM的表达影响乳脂合成，进而影响乳脂率。4结论本研究结果表明，低乳脂率组的德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p的表达水平最高，miR-21-5p可能通过负调控靶基因AGPAT6和GPAM的表达影响乳脂合成，进而影响乳脂率。