近年来，我国的畜禽养殖逐渐向集约化、高密度化和规模化方向发展。但由于受到环境因素[1]以及致病微生物侵袭等外界因素的影响，导致畜禽出现免疫应激反应，而免疫应激常导致畜禽肝、肾、脑等组织器官发生病理性变化，最终造成畜禽生长能力下降，死亡率增高[2]。大肠杆菌是家禽常见的致病菌，可导致家禽腹膜炎、肝损伤及肺炎等疾病，降低家禽免疫力，引起家禽死亡[3]，严重制约了禽业养殖发展。脂多糖（LPS）作为大肠杆菌细胞壁的重要组成部分，是大肠杆菌的主要致病因素，被广泛用于建立诱导组织损伤和炎症反应模型[4]。抗生素治疗易使畜禽产生耐药性，且体内抗生素残留会影响畜禽生产的安全性。近年来，越来越多的研究利用天然植物提取物代替抗生素用于防治病原微生物的感染[5]。金花葵花多糖具有抗氧化、抗衰老、降血糖、抗炎和调节免疫等多种药物价值[6]。张建[7]研究了金花葵花总黄酮对大肠杆菌所致家兔发热和炎症的影响，发现金花葵花总黄酮有明显的抗炎解热功能。吴正平[8]发现，金花葵可以降低小鼠的血脂，缓解高脂血症诱导的肝损伤。金花葵可降低高脂血症大鼠的血脂，降低动脉粥样硬化的风险[9]。目前，对于金花葵花多糖的研究多关注其提取工艺和体外抗氧化作用[10-11]，而对动物体内生物活性的研究不多。本文通过腹腔注射LPS建立小鼠急性炎症模型来探究不同浓度金花葵花多糖对小鼠的免疫器官的影响，为金花葵的进一步开发利用奠定基础。1材料与方法1.1试验材料金花葵采自河北清竹农业科技有限公司。CL级雄性昆明小鼠，体重（20±2）g，购自河北医科大学动物实验中心，合格证批号2104147。1.2试验方法1.2.1LPS小鼠模型构建试验动物为CL级昆明系雄性小鼠，正常提供饮水与饲料。研究期间严格按照小鼠屏蔽饲养系统规范操作，保证试验环境符合GB 14923—2022的要求。将小鼠自由喂养3 d后，将54只小鼠随机分为6组，每组9个重复。试验设计见表1。各组均按照0.1 mL/10 g BW标准灌胃或腹腔注射。连续灌胃3 d。第3 d，除CK组外均给予0.2 mL LPS（0.01 mg/g BW），并对小鼠进行断食处理，12 h后处死小鼠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.018.T001表1试验设计组别处理空白对照组（CK组）灌服0.9% NaCl脂多糖模型组（LPS组）灌服0.9% NaCl+注射LPS地塞米松组（Dex组）注射0.01 mg/g地塞米松+LPSL组灌服0.2 mg/g金花葵花多糖+注射LPSM组灌服0.4 mg/g金花葵花多糖+注射LPSH组灌服0.6 mg/g金花葵花多糖+注射LPS1.2.2小鼠肝脾系数处死小鼠后，收集肝、脾脏并称重，计算肝脾系数[12]。肝脾系数=肝脾质量(g)/小鼠体重(g)×100%(1)1.2.3小鼠脾脏原代细胞的分离与培养将1.2.1中的小鼠处死，消毒，在无菌环境中获取小鼠完整脾脏，放入无菌培养皿中，参照闫峰等[13]的试验方法将细胞分离。将得到的细胞悬液置于细胞培养箱中静置培养3 h。培养后贴壁为巨噬细胞，悬浮的为淋巴细胞，分离上清后可得两种不同脾细胞。1.2.4小鼠脾细胞NO分泌量的测定（Griess法）参照司丽君等[14]的方法测定脾细胞内NO含量，将细胞悬液调整至1×105个/mL，样品细胞悬液共设置6组，分别为CK组、LPS组、Dex组、L组、M组、H组，每组分别设置5个复孔。遵循NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书，将样品、试剂Ⅰ、试剂Ⅱ等量加入96孔板中，测定相应吸光度。1.2.5小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力测定（MTT法）参考陆辉等[15]的方法检测细胞数量与活力。将调整好浓度的细胞悬液按MTT试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）操作进行处理，置于板中。按1.2.4中方法进行分组处理，将细胞悬液与MTT工作液混匀在细胞培养箱中充分反应4 h，弃上清后加入110 μL二甲基亚砜（DMSO），充分反应后测定相应的吸光度。1.2.6小鼠脾脏巨噬细胞吞噬率的测定（中性红法）参照闫峰等[13]的方法，将小鼠脾脏巨噬细胞调整细胞浓度，使之贴壁，贴壁细胞弃去上清培养液，加入100 μL 1%的中性红，染色5 min，使用磷酸缓冲生理盐水（PBS）洗涤1次，置于倒置显微镜下观察其染色情况，每孔加入200 μL细胞裂解液（无水乙醇与冰乙酸1∶1）。室温过夜，于540 nm处测定吸光度。1.2.7小鼠肝脏组织炎症因子表达量的测定（RT-qPCR）采用Trizol法提取小鼠肝脏组织总RNA，使用Nano-Drop测定总RNA纯度和浓度。利用PrimeScript™ RT Master Mix（Perfect Real Time）试剂盒将总RNA进行反转录，将获得cDNA作为模板用于RT-qPCR检测。采用TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒进行RT-qPCR。测定肝脏组织IL-6和TNF-α mRNA的表达量。所用引物使用Primer Premier 5.0软件进行设计。Gapdh引物序列F：5'-AACCTGCCAAGTATGATGA-3'；R：5'-GGAGTTGCTGTTGAAGTC-3'。IL-6引物序列F：5'-ACTTCACAGAGGATACCA-3'；R：5'-GCATCATCGTTGTTCATAC-3'。TNF-α引物序列F：5'-ACGGCATGGATCTCAAAGAC-3′；R：5'-GCAGCCTTGTCCCTTGAAGA-3'。以Gapdh为内参基因，采用2-△△Ct法计算目的基因的mRNA表达水平。1.3数据统计与分析使用Excel软件作图。使用SPSS软件对试验数据进行单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1金花葵花多糖对小鼠脏器系数的影响（见表2）由表2可知，与CK组相比，LPS组小鼠的肝脏系数与脾脏系数升高（P0.05）；与LPS组相比，3个金花葵花多糖组肝脏系数均有增大的趋势（P0.05）。LPS组与Dex组小鼠的肝脏系数与脾脏系数均具有显著差异（P0.05）；3个金花葵花多糖组小鼠的肝脏系数与脾脏系数与Dex组相比均具有显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.018.T002表2金花葵花多糖对小鼠脏器系数的影响组别肝脏系数脾脏系数CK组4.19±0.17c0.24±0.02bLPS组5.11±0.15b0.35±0.02aDex组5.74±0.17a0.28±0.03bL组5.15±0.16b0.35±0.01aM组5.13±0.16b0.35±0.03aH组5.19±0.18b0.36±0.03a注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同表示差异不显著（P0.05）。%2.2小鼠脾脏原代细胞（见图1）由图1可知，分离得到的小鼠脾脏巨噬细胞因贴壁生长已铺满培养瓶瓶底，细胞呈相对较大的圆形；而淋巴细胞体积较小，呈现较规则的圆形或类圆形，无贴壁特性，依旧悬浮生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.018.F001图1小鼠脾脏原代细胞（400×）注：A为小鼠脾脏原代巨噬细胞，B为小鼠脾脏原代淋巴细胞。2.3金花葵花多糖对小鼠脾细胞NO释放量的影响（见图2）由图2可知，CK组NO释放量为4.70 μmol/L，LPS组为5.63 μmol/L，Dex组为5.16 μmol/L，3个金花葵花多糖组分别为7.33、8.71、6.91 μmol/L。LPS组NO释放量高于CK组和Dex组（P0.05）；3个金花葵花多糖组NO释放量高于CK组、LPS组和Dex组（P0.05）。M组NO释放量高于其他各组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.018.F002图2金花葵花多糖对小鼠脾细胞NO释放量的影响注：字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同表示差异不显著（P0.05）。2.4金花葵花多糖对小鼠脾脏淋巴细胞活力的影响（见图3）由图3可知，CK组小鼠脾脏淋巴细胞活力为100%，LPS组为86.98%，Dex组为98.75%，3个金花葵花多糖组分别为86.86%、85.49%和96.40%。LPS组小鼠脾脏淋巴细胞活力低于CK组（P0.05）。H组小鼠脾脏淋巴细胞活力高于LPS组、L组和M组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.018.F003图3金花葵花多糖对小鼠脾脏淋巴细胞活力的影响2.5金花葵花多糖对小鼠脾脏巨噬细胞吞噬作用的影响（见图4、图5）由图4可知，巨噬细胞增大，呈不规则椭圆形，巨噬细胞大量吞噬中性红染液，细胞呈红色。从图4中可明显观察到中性粒、细胞核等细胞成分。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.018.F004图4经中性红染色后的小鼠脾脏巨噬细胞由图5可知，与CK组相比，LPS组小鼠脾脏巨噬细胞吞噬率增加了10.90%（P0.05）。金花葵花多糖处理后，巨噬细胞吞噬率增强，L组、M组、H组巨噬细胞吞噬率分别比LPS组增加了29.60%、52.07%和56.72%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.018.F005图5金花葵花多糖对小鼠脾脏巨噬细胞吞噬率的影响2.6金花葵花多糖对小鼠肝脏组织炎症因子mRNA表达量的影响（见图6）由图6可知，与CK组相比，LPS组小鼠肝脏IL-6和TNF-α的mRNA表达量升高（P0.05）。Dex组IL-6的mRNA表达量低于CK组（P0.05）。与LPS组相比，L组、M组、H组TNF-α的mRNA表达量分别降低了27.18%、23.75%和44.33%（P0.05），而IL-6的mRNA表达量分别降低了33.67%、40.70%和26.68%（P0.05）。图6金花葵花多糖对小鼠肝脏组织炎症因子表达的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.018.F6a1（a）TNF-α的mRNA表达量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.018.F6a2（b）IL-6的mRNA表达量3讨论3.1LPS诱导致炎小鼠模型分析大肠杆菌是畜禽生产中重要的致病微生物。LPS作为大肠杆菌主要致病因素之一，被广泛用于诱导组织损伤和炎症反应模型的建立。ZHANG等[16]通过LPS诱导建立氧化应激损伤模型，发现金花葵能够显著下调LPS诱导的RAW264.7细胞中细胞因子的表达。TU[17]通过LPS建立模型探讨了金花葵的肾脏保护作用及其与肠道微生物群和微炎症有关的潜在机制。ZHOU等[18]建立了LPS诱导的膀胱炎小鼠模型，发现金花葵降低了膀胱炎小鼠尿液沉积物中的白细胞（WBC）计数，减轻了膀胱充血、水肿和组织病理学损伤，证明了金花葵对LPS诱导的膀胱炎的保护作用。本试验采用LPS建立急性炎症模型，对小鼠进行腹腔注射内毒素LPS，小鼠表现出反应较为迟缓、精神状态较差等现象，成功造模。3.2金花葵花多糖对小鼠脏器系数的影响脾脏是体内重要的免疫器官，其大小与形态结构可直接表现机体的抗炎能力。肝脏系数和脾脏系数的变化可直观反映小鼠的免疫能力[19]。杨甜甜等[20]研究了柚类黄酮对铅中毒小鼠的保护作用，发现一定浓度的柚类黄酮能够显著降低小鼠肝脏系数，降低铅对小鼠的损伤作用。相反，吴正平[21]研究发现，金花葵花总黄酮可以通过提高脾脏指数而加强衰老模型小鼠的抗氧化功能和免疫功能。张悻等[22]研究表明，饲粮中添加植物提取物和植物精油对麻黄肉鸡肝脏系数和脾脏系数影响不显著。本研究发现，经连续3 d金花葵花多糖灌胃处理后，与LPS组相比，小鼠肝脏系数和脾脏系数变化不显著，与张悻等[22]研究结果一致。3.3金花葵花多糖对小鼠脾细胞NO释放量的影响NO作为一种气体信号分子可在细胞之间进行信号的传递，同时也参与了机体的炎症反应。当机体受到某些病原体刺激时，巨噬细胞就会表达诱导型一氧化氮合酶（i NOS），从而释放大量NO，起到杀伤外来病原体的作用[23]。因此，NO的产生可间接证明巨噬细胞的活化。梅玉屏等[24]发现，重组卡介苗及猪苓多糖可以增加荷瘤小鼠巨噬细胞NO释放量，从而明显抑制肿瘤生长。SU等[25]发现，金花葵对脂多糖诱导的THP-1细胞中NO的释放，表现出较强的抑制作用。在本试验中，经0.2、0.4 mg/g两种浓度金花葵花多糖灌胃处理的小鼠，脾细胞NO释放量随多糖浓度的提高而增长，且0.4 mg/g金花葵花多糖处理明显高于LPS组；经0.6 mg/g金花葵花多糖处理的小鼠脾细胞NO的释放量比前两种浓度多糖较低，原因可能是较高浓度多糖可能会抑制脾细胞NO的释放。由此可知，一定浓度的金花葵花多糖会提高机体的抗炎能力，但高剂量多糖则可能会抑制NO的释放。3.4金花葵花多糖对小鼠脾脏淋巴细胞活力的影响本试验采用MTT比色法测定小鼠脾脏淋巴细胞的增殖活力，细胞中线粒体的琥珀酸脱氢酶（SDH）可使MTT还原为甲臜，并在细胞中积累，之后在DMSO的作用下溶解细胞内的甲臜，测定细胞培养物的吸光度，可间接反映细胞活力。当LPS刺激淋巴细胞时，细胞活力将增强，体积变大，数量也随之增多，活细胞数目可在一定程度上反映多糖对机体免疫功能的影响。经金花葵花多糖灌胃后，小鼠脾脏淋巴细胞活力与LPS组相比均有提高，且细胞活力也随多糖浓度的增加而增加。由此可知，金花葵花多糖可促进淋巴细胞的增殖，对机体的免疫能力起到促进作用。吴正平[21]发现，金花葵花总黄酮可以提高淋巴细胞的增殖能力，进而增强机体的免疫功能。同时，经地塞米松处理后，小鼠淋巴细胞活力与LPS组相比较低，地塞米松可能通过加快淋巴细胞的凋亡来抑制机体的免疫反应[26]，从而达到调节机体抗炎反应的目的。3.5金花葵花多糖对小鼠脾脏巨噬细胞吞噬能力的影响巨噬细胞的吞噬能力是机体免疫的重要标志之一，也是证明巨噬细胞的生物活力的直接证据。巨噬细胞经过吞噬入侵机体的各种微生物、病原体提高机体的抗炎能力。本试验通过测定脾脏巨噬细胞中性红吞噬作用来测定巨噬细胞活力，经中性红染色后细胞呈红色，可明显观察到中性粒、细胞核等细胞成分，证明染色成功，巨噬细胞活力旺盛且具有较强的吞噬能力。经金花葵花多糖灌胃后巨噬细胞吞噬能力有所加强，且细胞吞噬能力也随多糖浓度的增大而增强。推测金花葵花多糖可提高病原体的特异分子在巨噬细胞表面的某种蛋白结合能力，增强吞噬识别能力，提高机体的免疫能力。杨秀松[27]研究发现，金花葵粗黄酮提取物可以通过提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力来增强小鼠的免疫功能，与本研究结果一致。3.6金花葵花多糖对小鼠肝脏组织炎症因子mRAN表达的影响IL-6是反映机体炎症和疾病严重程度的指标之一；TNF-α是肝衰竭的早期炎症因子，可加重肝坏死[28]。植物提取成分可通过降低IL-6和TNF-α表达量来缓解组织器官的损伤。XUE[29]研究发现，金花葵可以显著抑制TNF-α的表达。GUO等[30]发现，金花葵可在血清和mRNA水平上抑制炎症介质（如TNF-α）。本研究发现，金花葵花多糖可明显降低机体肝脏的炎症因子的表达水平，其在一定程度上可通过下调肝脏中部分促炎因子的表达减轻肝脏炎性损伤，证明了金花葵花多糖对脂多糖刺激诱导所致的肝脏损伤具有较好的保护作用。4结论本研究表明，金花葵花多糖可明显提高LPS模型小鼠的脏器系数，增强免疫细胞活力。适宜剂量的金花葵花多糖对致炎小鼠具有一定的抗炎效果，并具有提高机体免疫的功效。